Summary
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והתרבות של תאי מעי דק בעכברים מעורבים. תרבויות מעיים העיקריות אלה מאפשרות החקירה של מסלולי איתות שבבסיס הפרשת פפטיד בטן באמצעות מספר הטכניקות.
Abstract
המעי הוא האיבר האנדוקרינית הגדול ביותר בגוף, עם תאים enteroendocrine מפרישי ההורמון ממוקמים לאורכה של האפיתל של הקיבה והמעיים. למרות החשיבות הפיזיולוגית שלהם, תאי enteroendocrine מייצגים רק חלק קטן של אוכלוסיית התא האפיתל ובעבר, אפיונם הציג אתגר משמעותי וכתוצאה מכך הסתמכות על מודלי קו התא. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור הבידוד וההתרבות של תאי מעי דק בעכברים מעורבים. תרבויות העיקריות אלה שמשו לזיהוי מסלולי האיתות שבבסיס הגירוי והעיכוב של הפרשת פפטיד בטן בתגובת מספר החומרים מזינים נוירופפטידים כמו גם סוכנים תרופתיים. יתר על כן, בשילוב עם שימוש עכברי כתב ניאון מהונדסים, הוכחנו כי התרבויות העיקריות אלה הופכים כלי רב עצמה עבור הבדיקה של תאי enteroendocrine fluorescently-tagged בבית ברמת tracellular, באמצעות שיטות כגון הידוק תיקון וסידן תא בודד הדמית cAMP-סריג.
Introduction
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבודד תאי מעי בעכברים מעורב תרבות כדי לאפשר לימוד הפרשת פפטיד במעי הדמית תא חי של תאי enteroendocrine. גרסה מוקדמת של הליך זה פורסם במקור ב- 2008 על ידי ריימן ואח. 1 ומאז היווה את הבסיס של 20 פרסומים נוספים מהקבוצה שלנו. עבור כתב היד הזה, בחרנו להתמקד תרבויות מעי דק כפי שהם יותר מאתגרים להקים מ תרבויות גסות.
תאים Enteroendocrine להפריש מערך של פפטידים הבטן כולל פפטיד גלוקגון דמוי 1 (GLP-1), גלוקוז-תלויים insulinotropic פפטיד (GIP), כולציסטוקינין (CCK) ו פפטיד YY (PYY) 2. יש פפטידים המעיים אלו תפקידים פיזיולוגיים חשובים ובארגון התגובות postprandial כגון האטת המעבר במעי, הגברה של שחרור אינסולין מגורה הגלוקוז אינדוקציה של שובע. GLP-1 mimeticsnd תרופות אשר מעכבים השפלה שלה מורשים כיום לטיפול בסוכרת מסוג 2 קיימת הערכה מתמשכת של הפוטנציאל הטיפולי של המרצת הפרשת אנדוגניים של פפטיד זה 3. הבנה טובה יותר של פיזיולוגית enteroendocrine ואת המנגנונים שבאמצעותם הפרשה או מגורה או עכבות הן, אפוא, חשיבות קריטית.
גוט הפרשת פפטיד ניתן ללמוד באמצעות מגוון של במבחנה לשעבר vivo מודלים ניסיוניים, כל אחד עם יתרונות וחסרונות (לסקירה מקיפה האחרונות גם מכסה את השימוש במודלים vivo לראות סוונדסן et al. 4). Ex vivo טכניקות כגון לתאי Ussing המעי 5 ו perfused המבודד 6 כרגע בשימוש לחקור הפרשת פפטיד בטן בתגובה לחומרים שונים. היתרון העיקרי של שיטות אלה, כמולעומת תרבויות עיקריות, הוא שהסביבה המיידית של תאי enteroendocrine נותרת שלמה ברובו וחשובה, את הקוטביות של התאים נשמרה. לכן, אפשר לשאוב מידע לגביהם תא משטח secretagogue פועל 6. עם זאת, אלה הם בדרך כלל טכניקות נמוכה התפוקה ואיכות הנתונים הנגזרים מהם מסתמכת במידה רבה על היושרה ואת הכדאיות של רקמת המעי, אשר בהכרח ירידה לאורך זמן.
Organoids מעיים כיום יותר ויותר בשימוש כמודלים חוץ גופית לחקר תפקוד התא enteroendocrine ופיתוח 7. Organoids, אשר יכול לנבוע הוא בעכברים ורקמות אדם, יש את היתרון של יצירת "דמוית הקריפטה" 3D מבנים המקיימים קוטבי בתא בתרבות. עם זאת, תאי enteroendocrine organoid הנגזרת טרם לאפיין באופן מלא דמיונם cel L מקורהls נשאר ברובו לא ידוע. יש תרבויות ראשיות היתרון של להיות צעד אחד קרוב יותר את ההגדרה הפיזיולוגית, כמו תאי enteroendocrine אינם מתוחזקים בדיל בתנאים מלאכותיים לתקופות זמן ממושכות.
שיטת תרבות העיקרית חלופה אשר הועסקה על ההערכה של הפרשת פפטיד בטן היא הבידוד של תאים במעי עכברוש עוברי (FRICs) 8. עם זאת, התרבות של רקמת מעי מבוגרת זוכה להצלחה פחות כמה הבדלים נצפו על היענות FRICs לעומת תאי מעי בעכברים בוגרים (למשל גלוקוז 8).
Enteroendocrine דמוי קווים סלולריים (למשל GLUTag, STC-1 ו- NCI-H716) שימשו באופן מסורתי להבחין vs ישיר. השפעות עקיפות על תאי enteroendocrine ולבתר מנגנונים מולקולריים שבבסיס צימוד גירוי ההפרשה; לראות Kuhre ואח 9 לייצור והפרשת פפטיד ידי שורות תאי "L תא דמוי" הונצחו. זה כבר צורך כתאי enteroendocrine, הפזורים לאורך מערכת העיכול, מהווים רק תחת 1% של תאי האפיתל במעי 10 ו תאים ממוינים, בידיים שלנו, אינם שורדים בתרבות 1. קווים סלולריים להישאר כלים שימושיים בשל העובדה כי הם אוכלוסייה הומוגנית בעיקרה תא שבו היא תורמת מניפולציות גנטיות כגון-להשתקת גנים. כתוצאה מכך, קל לחקור את התפקיד של חלבונים אשר לא יכול להיות ממוקד פרמקולוגית, כאשר עכברים מהונדסים אינם זמינים. עם זאת, שורות תאים אינן מודלים תמיד תקפים של תאים ראשוניים. אמנם יש קווי דמיון רבים, ממצאים מתרבויות ראשיות בהזדמנות הדגישו הבדלי מסלולי האיתות מופעלים על ידי חומרים מזינים מסוימים בתאי L העיקריים לעומת תאי GLUTag, למשל (למשל. Peptones <sup class = "Xref"> 11). באופן מכריע, בשילוב עם עכברי כתב ניאון מהונדסים, מודל התרבות העיקרי מאפשר בחינה מפורטת של תאי enteroendocrine העיקרי בודדים ברמת תאיים. Fluorescently- מתויגים בתאי L בתוך תרבויות עיקריות כבר בשימוש על ידי הקבוצה שלנו עבור תיקון clamping 1, 12 מחקרים, וסידן תא בודד 11, 13 ו הדמית monophosphate סריג אדנוזין מחזורי 14 מחקרים, אשר הניבו התקדמות משמעותית בתחום enteroendocrine פִיסִיוֹלוֹגִיָה.
הפרוטוקול הבא מותאם לביצוע ניסויי הפרשה, באמצעות צלחת 24-היטב או לעריכה של עד 16 מנות הדמיה, מן קטע 10 סנטימטרים של המעי הדק בין עכבר מבוגר יחיד. הפרוטוקול ניתן לשנות בקלות לחקר תאי המעי הגס על ידי הגדלת פעמים עיכול ושיתוףריכוז llagenase.
Protocol
הנהלים כל חיה אושרו על ידי אוניברסיטת קיימברידג 'צער בעלי חיים וגוף סקירה אתיות תאמו את חיות (הליכים מדעיים) Act 1986 תקנות תיקון (SI 2012/3039).
אופן ההכנה 1. ב Advance
- מניחים aliquot של מטריקס קרום במרתף (BMM) (~ 200 μL) על הקרח להפשיר.
הערה: BMM מבצרת בטמפרטורת החדר (RT). - טרום חמים 50 מ"ל סטרילי גבוהה גלוקוז בינוני הנשר Modified של Dulbecco (DMEM) (ללא תוספות) ו ~ 40 בינוני מ"ל סטרילי תרבות (DMEM גלוקוז גבוהה בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS), 100 U / mL פניצילין 0.1 מ"ג / מ"ל סטרפטומיצין (P / S), ו 2 מ"מ L- גלוטמין) ב 50 מבחנות צנטריפוגה מ"ל באמבט מים 37 מעלות צלסיוס
- סידן טרום צמרמורת ומגנזיום המכיל פוספט שנאגר מלוח (PBS).
- תשקול 15 מ"ג collagenase (גולמי XI), להוסיף צינור צנטריפוגות 50 מ"ל ולשמור על קרח.
אוסף רקמות 2.
- להוסיף ~ 20 מ"ל L-15 בינוני עד צינור צנטריפוגות 50 מ"ל ומניחים אותו על קרח.
- להרדים עכבר נקע בצוואר הרחם, או שיטה 1 אחרים שאושרו הזמנים.
הערה: רקמת מעי בדרך כלל מתקבלת מעכברים על רקע C57BL6. עם זאת, רקע גנטי אחר גם שמש למשל 129 / SvEv 15. ניסויי הדמיה דורשים שימוש עכברי כתב ניאון למשל Glu-ונוס 1. רקמות מתקבלות עכברים בוגרים (2-6 חודשים) של שני המינים. העכברים הם שוכנו individually-מאוורר כלובים עם כרצונך גישה למים צ'או רגיל. עם זאת, ניסויים כדי לבחון את ההשפעה של תזונה עתירת שומן, למשל, על תפקוד התא enteroendocrine 16 יכול להתבצע אם נתמך על ידי רישיון הפרויקט. - לנתח בעדינות להסיר מעי עכבר (מ בשוער להתחיל של פי טבעת) באמצעות מלקחיים ומספריים דיסקציה. ולאחסן אותו בינוני L-15 על הקרח עד מוכן לשימוש.
3. רקמות הכנה
- מניחים רקמת המעי בצלחת פטרי 10 ס"מ המכיל מספיק PBS כדי לכסות את הרקמה. קח 10 סנטימטרים של רקמה רצויה (מעי דק העליון למשל, 10 סנטימטרים עליונים, דיסטלי שוער).
- לרוקן את תכולת המעיים בעזרת פיפטה פלסטיק פסטר PBS מקורר.
- בעזרת מלקחיים, בעדינות אחיזה בקצה אחד של קטע המעי ומקום קצה פיפטה פסטר לתוכו. לרוקן את תכולת עם PBS צונן. חזור משני קצותיו עד majoוביטחון של התוכן כבר סמוק החוצה. מעבירים לצלחת פטרי נקי המכיל PBS צונן ורענן.
- בעזרת מלקחיים, להסיר את רקמת השומן ואת לפדר, מקפיד לא לשלוף את שכבת השריר בעת ובעונה אחת.
- מקלפים את השריר שכבת off "כמו גרב" תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות שתי קבוצות של מלקחיים בסדר.
הערה: שלב זה אינו חיוני, אבל מומלץ מאוד. ישנן דרכים חלופיות של הסרת שכבת השריר לזו המתוארת כאן. לדוגמה, במעי ניתן לחתוך פתוח אורכית הראשון, לפני הסרה של שכבת השריר.- מצא נקודת התחלה בסוף הפרוקסימלי יותר של הרקמה שבה קיים דש גלוי של שריר. בעדינות להתרחק כמות קטנה של שכבת השריר לאורך כל הדרך סביב המעי.
הערה: כדי למנוע קריעה של שכבת השריר או האפיתל במעי, לצמצם את כוח המתיחות ידי כיווץ שטח פנים גדול יותר מאשר באמצעות tIPS של מלקחיים בסדר. - הצמד במעי כמה שיותר דש שריר ככל האפשר, בעדינות לפרק ולהתחיל לקלף את שכבת השריר מרחבי המעי. כדי למנוע קריעה היא שכבת השריר אפיתל, לשמור readjusting עמדת המלקחיים כדי לשמור אותם קרובים זה לזה. בדרך זו, להסיר את שכבת השריר מן האורך של קטע המעי וזורק.
- מצא נקודת התחלה בסוף הפרוקסימלי יותר של הרקמה שבה קיים דש גלוי של שריר. בעדינות להתרחק כמות קטנה של שכבת השריר לאורך כל הדרך סביב המעי.
- חותכים את המעי פתוח אורכי או לשטוף ידי מתערבל בצלחת פטרי נקי עם PBS צונן ורענן. חזור במידת הצורך להסיר כל chyme או ריר הנותרים.
- רקמת בשר טחון עם להב אזמל כירורגי כדי להשיג ריבועים של ~ 1-2 מ"מ 2 ולהוסיף האלה ~ 20 מ"ל מקורר PBS בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל בעזרת פיפטה פסטר. כדי להימנע חתיכות רקמה דבקות פיפטה, לנתק את הקצה להרטיב את פיפטה ידי triturating עם PBS.
- נער בעדינות את הצינור כדי להמשיך לשטוף את חתיכות רקמה. לאפשר לרקמות להתיישב ושופכים או pipette את רוב PBS וחזרו עם PBS הטרי עד PBS נראה ברור.
4. הכנת פלייט / כלי BBM מצופה עיכול בינוני
הערה: השלבים הבאים יש לבצע במנדף בתרבית רקמה (עם צעדי דגירה ב 37 מעלות צלזיוס מים באמבטיה).
- כן פתרון BMM 2% ב DMEM המקורר (ללא תוספות). תוך כדי עבודה, לשמור על פתרון קרח. אם אתם מחפשים פתרון 2%, להוסיף 140 μL מופשר BMM כדי 7 מ"ל DMEM (מספיק כדי להכין צלחת 24-היטב יחיד).
- הוספת 250 μL 2% פתרון BMM לכל טוב (24 גם צלחת) או לכל צלחת הדמיה זכוכית התחתונה.
- דגירת צלחות / מנות מצופות למשך 30 דקות לפחות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר פילמור נאותה של BMM.
- מוסיפים את מ"ל 50 מחומם מראש DMEM (ללא תוספות) אל collagenase 15 מ"ג (מהמדרגות 1.2 ו 1.4) כדי ליצור פתרון 0.3 מ"ג / מ"ל ו להפוך להתמוסס.
- עַלCE נמס לגמרי, באמצעות מזרק 20 מ"ל, לסנן את הפתרון collagenase דרך פילטר 0.2 מיקרומטר סטרילי לתוך צינור צנטריפוגות חדשות סטרילי 50 מ"ל. תווית זו כאמצעי העיכול.
לעיכול רקמת 5.
- מוציאים את חתיכות רקמה מן PBS באמצעות 10 מ"ל פיפטה סרולוגיות ולהוסיף צינור צנטריפוגות 50 מ"ל סטרילי המכיל DMEM סטרילי מצונן (ללא תוספות), מערבולת ולאחר מכן הסר DMEM.
הערה: כדי למנוע רקמות דבקות פיפטה סרולוגיות, להרטיב אותו על ידי טחינה דקה עם DMEM לפני קשר עם הרקמה. - "Digest" 1 ו 2: סילוק פסולת תא תאים בודדים
- הוסף בינוני עיכול מיליליטר 7 על פיסות הרקמה ולתת צינור מערבולת.
- דגירה של 5 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
- נער בעדינות (לא מערבולת) הצינור עבור ~ 3 s.
- לאפשר לרקמות להתיישב וזורקי מדיום העיכול, הזמנהנפח קטן להסתכל במיקרוסקופ.
הערה: במיוחד כאשר החלו לצאת, מומלץ מאוד לבדוק נפח קטן של כל "לעכל" (~ 30 μL) תחת מיקרוסקופ כדי לאמוד את התקדמות תהליך העיכול. אם מאורות רבים הם נצפו בשלב זה, את הרעד עשוי להיות יותר מדי נמרץ. לקבלת תמונות מייצגות של מה השלבים השונים "Digest" בדרך כלל נראים, לעיין ב איור 1. - 5.2.-5.2.4 חזור על השלבים (עם מדיום עיכול טרי).
- "דייג'סט" 3 עד 5: אוסף של שברי הקריפטה
- להוסיף 7 בינוני העיכול מ"ל לרקמה.
- דגירה של 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- במהלך הדגירה, לנער כל 5 דקות במשך 10-12 s.
הערה: הטלטול הוא יותר נמרץ מאשר רועד עבור "מעכל" 1 ו 2.
- במהלך הדגירה, לנער כל 5 דקות במשך 10-12 s.
- אפשר רקמות מעוכלות להתיישב ולאסוף את מדיום עיכול צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. אםרקמת נאסף בטעות יחד עם המדיום, ולאפשר לו להתיישב, להסיר אותו בעזרת פיפטה 10 מ"ל סרולוגיות ולהעביר אותו בחזרה אל צינור צנטריפוגות 50 מ"ל המכיל את רקמות מעוכל.
- צנטריפוגה שנאספו בינוני / supernatant ב RT עבור 3 דקות ב 100 גרם x.
- בטל supernatant מחדש להשעות את התא גלולה מ"ל 5 בינוני התרבות מחומם מראש על ידי טחינה דקה עדינה ומניחים בצד.
- בדוק נפח קטן של השעית התא תחת מיקרוסקופ (ראה הערת משלב 5.2.4).
הערה: באופן אידיאלי, שברי הקריפטה להתחיל להופיע "לעכל" 3 יחד עם פסולת תא תאים בודדים. "דייג'סט" 4 ו 5 להכיל מספר גדול משמעותית של שברי הקריפטה עם פסולת התא מופחת (איור 1). התאם רועד בעוצמה לפי הצורך כלומר אם הרקמה לא מעכלים ושברי הקריפטה אינם מופיעים, לנער במרץ רב יותר. - חזור על שלבים 5.3.1-5.3.6 עד 5 "מעכל" היוהושלם או עד שרוב הרקמות כבר מעוכל (א שיידרש 6 th בתקציר).
- לאחר כל supernatants מ "מעכל" 3-5 (או 3-6) נאספו, צנטריפוגה לעכל supernatants ב RT עבור 3 דקות ב 100 גרם x.
- בניסויי הפרשה, לשלב את supernatants מ "מעכל" 3-5 (או 3-6) לפני צנטריפוגה.
הערה: רקמה פחות נחוצה עבור ניסויי הדמיה, ולכן לבחור את supernatant Digest כי הוא (פסולת בהעדר תא תאים בודדים) הנקי עם המספר הגדול יותר של שברי הקריפטה. זהו בדרך כלל "לעכל" 4 או 5. - בטל supernatant בעדינות מחדש להשעות את הגלולה ידי triturating עד גושים לא גלויים. Re- להשעות את גלולה במדיום תרבות מחומם מראש בתוספת 10 מיקרומטר Y-27,632 dihydrochloride (כדי למנוע anoikis 17). השתמש 5 מיליליטר עבור ניסויי הפרשה ו 2 בינוני תרבות מיליליטר עבור ניסויי הדמיה.
- לְסַנֵןתא השעיה דרך מסנן 100 מיקרומטר (כדי להסיר את כל רקמה מעוכלת). הפעל מ"ל 2 נוסף של המדיום התרבות מחומם מראש דרך המסנן כדי לשטוף (הנפח הכולל: 7 מ"ל ו 4 מ"ל עבור הפרשת ודימות, בהתאמה).
הערה: סינון אינו חיוני, אולם, שברי רקמות גדולות יותר נוטים שלא לדבוק צלחת / מנות.
איור 1: נציג תמונות של "מעכלת" משיטת תרבות מעי דק עיקרית. (א) חומר אופייני מ "מעכלים" 1 ו 2 המכילים תאים ופסולת תא בודדים בעיקר. (ב) דוגמא של מוצרים מן "לעכל" 3. החיצים השחורים מצביעים שברי הקריפטה המופיעים החומר לעכל. (C) האופייני של "לעכל" 4 או 5. לוח (D) מייצגות ויקווה לעכל חומר"מעכל" 3-5 עבר דרך פילטר 100 מיקרומטר להסיר את שברי רקמות רצויים הגדולים לראות (C). כל התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי הפוך עם מטרת 20X. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
6. תרבויות מעי ציפוי (מועשר עבור תאי קריפטה)
- סור פתרון BMM עודף מצלחת או מנות, ולהוסיף 250 μL בינוני התרבות מחוממת מראש ל הפרשה היטב.
הערה: מנות ההדמיה הן נותרו ללא בינוני כך להמשיך לשלב הבא במהירות כדי למנוע את המנה מהתייבשות. - פלייט 250 השעית תא μL לכל טוב (24 גם צלחת) או לכל צלחת זכוכית תחתונה.
- טיפה חכם פלייט ב "זיג זג" בהילוך איטי על פני הבאר. אפשר שברי הקריפטה להסתפק ~ 5 דק 'לפני שעבר את הצלחת thחממת דואר.
הערה: זה אמור לעודד חלוקה שווה של מאורות / תאים בתוך הבאר.
- טיפה חכם פלייט ב "זיג זג" בהילוך איטי על פני הבאר. אפשר שברי הקריפטה להסתפק ~ 5 דק 'לפני שעבר את הצלחת thחממת דואר.
- דגירה צלחת או מנות לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO 2.
הערה: בשכבה "טלאים" צריכה יצרה. לקבלת תמונה מייצגת של התרבויות הבאות שלושה שוטף, ראו איור 2 א. - מנות ההדמיה "מבול" עם 2 מיליליטר מחומם מראש בינוני תרבות לכל צלחת.
הערה: אלו מאכלים יהיו מתאימים הדמיה עד ~ 72 h הבאים ציפוי. תרבויות גסות בדרך כלל מעמד זמן רב יותר, עד 7 ימים. תאים אשר לא דבק ניתן להסיר על ידי צעד לשטוף. תרבויות ראשיות מוכנות כעת לשמש בניסויים.
Representative Results
שימוש צעדי עיכול סדרו מאפשר האיסוף של הכנה יחסית נקיה של שברי הקריפטה להיות מצופה לניסויים. שני מעכל תחילה להסיר תאים בודדים בעיקר ופסולת תא מהחומר לעכל (איור 1A). במהלך Digest השלישי, שברי הקריפטה מופיעים חומר מתעכל (איור 1B). מעכל תשואה 4 ו 5 מספר גדול יותר של שברי הקריפטה עם תאים בודדים פחות (איור 1C). סינון החומר אסף מעכל 3-5 מסיר חתיכות גדולות של רקמה מעוכלת, שעלולה להזיק לתרבות, הפקת הכנת שבר הקריפטה נקיה (1D איור).
בעקבות 18-24 שעות של תרבות, monolayers של תאי מעי דק עיקריים הם נצפו (איור 2 א). שימוש בתרביות המופקות עכברים טרנסגניים המבטאות את קאל במיוחדחיישן פלורסנט cium, GCaMP3, תחת שליטה של האמרגן proglucagon 11, תאי L שניתן לזהותם בקלות משובצים בתוך התרבות (איור 2B). בתרבויות מעי דק עיקריות, תרכובות מיקוד G q -Ca 2+ אני וקמפ אני תלויות מסלולים מגורים את הפרשת GLP-1 (עבור מתודולוגיה ניסוי הפרשה לראות ריימן et al. 1). Bombesin (BBS, 100 ננומטר) ושיתוף יישום של forskolin ו 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (F / I, 10 מיקרומטר אחד) עורר 2 ו 11-לקפל, גירוי של GLP-1 שחרור ביחס הבסיס, בהתאמה (איור 2C). ביטוי תא L ספציפי של GCaMP3 מאפשר זיהוי של וניטור בזמן אמת של גיוס סידן בתאי L פרט. שני 100 ננומטר bombesin (BBS) ו אשלגן כלורי 30 מ"מ (KCl) מגורה עלייה זמנית סידן תאיים מעיד על q G ידוע <תת /> - ומסלולי electrogenic מצמיד בתאי L העיקריים (2D איור).
איור 2: נציג נתונים שמקורם בתרבויות מעי דק עיקריות. תמונות דוגמא של תרבויות מעי דק עיקריות מעורבות משמשות (א) הפרשה ו (ב) ניסויי הדמיה לפרסם 24 ציפוי h. תמונה (א) שנלקחה צלחת 24-היטב, באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי הפוך עם מטרת 4X. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (ב) שימוש Glu-Cre x עכברים ROSA26 GCamP3, תאי L בתוך שדה הראייה (תאים ירוקים) זוהו על ידי הקרינה של GCaMP3. סרגל קנה מידה מייצג 50 מיקרומטר. (ג) הפרשת GLP-1 נמדדה בתגובה bombesin (BBS, 100 ננומטר) forskolin / 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (F / I, 10 מיקרומטר אחד). הפרשת GLP-1 אחוז חושבהעל ידי מדידת רמות GLP-1 ב supernatants ו lysates תא. הנתונים מייצגים את אמצעי ± SEM של n = 3 עבור כל תנאי. (ד) הקרינה GCaMP3 (המשקף סידן cytosolic) של שני תאים שהותוו (B) במעקב בזמן אמת בתגובה אשלגן כלורי (KCl, 30 מ"מ) ו BBS (100 ננומטר). הדמית תא יחידה בוצעה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם מטרת נפט טבילת 40X. GCaMP3 הסעירה ננומטר 475/10, באמצעות מנורת קשת קסנון 75 W ו monochromator בשליטת התוכנה דימות פלואורסצנטי. פליטה נרשמת עם מצלמה למכשיר תשלום מצמידים דיגיטלית ברזולוציה גבוהה (CCD) באמצעות מראה dichroic ומסנן רוחב פס 510-560 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והתרבות של תאי מעי דק בעכברים מעורבים כדי לאפשר לימוד הפרשת פפטיד במעי הדמית תא בודד של תאי enteroendocrine שכותרתו.
כדי להגדיל את הסיכוי של תרבויות המעי דק להיות מוצלחות, חשוב כי הפרוטוקול מתבצע מהר ככל האפשר (רצוי, בתוך 3 שעות של קצירת הרקמות) וכי הרקמות נשמרות במדיום קר כקרח או חיץ לפני לתהליך העיכול, להגביל מוות של תאים. אמנם זה לא הכרחי, במיוחד עבור תרבויות גסות, הסרת שכבת השריר מן המעי הדק הוא מעודדים. פרוטוקול תרבות המעי הדק כבר טופל ככל האפשר. עם זאת, חשוב לציין כי אין תהליך העיכול הוא זהה. ישנם צעדים רבים במהלך הפרוטוקול הזה שבו השתנות ניתן הציגו על בסיס יום-יומי למשל מידת הסרת שריר, בגודל של t"טחון" הוא חתיכות רקמה, עוצמת רועדת, את העוצמה של קבוצה מסוימת של collagenase וכו. לכן, חשיבות עליונה לבחון aliquots של כל אחד שונה "מעכל" תחת מיקרוסקופ כדי להעריך את התקדמות תהליך העיכול חייט טלטול ומספר "מעכל" בהתאם. מומלץ ללחוץ יותר בעדינות מלכתחילה, ואם שברי הקריפטה אינם ברורות מן "לעכל" 3 ואילך, מתחיל לרעוד יותר בתקיפות.
מניסיוננו, תאי enteroendocrine לא להתרבות בתרבות ובדרך כלל הולכים לאיבוד מתרבויות קטנות מעי תוך 4 ימים. אף על פי כן, זה מאפשר מספיק זמן כדי לבצע ניסויי הפרשת פפטיד בטן (בדרך כלל מתבצע מעל 2 h, 18-24 ציפוי פוסט h) כדי לבדוק גירויים פיסיולוגיים ו / או סוכנים תרופתיים. ניסויים הדורשים דגירה לילה לפני הניסוי הפרשה גם למשל ריאליבמקרה של טיפול מקדים עם רעלן השעלת 15.
טכניקת התרבות העיקרית המוצגת כאן היא שיטה מבוססת היטב, כפי שמעיד היקף תפוקת מחקר זה פיק לאורך השנים. מודל התרבות העיקרי נעשה שימוש כדי ללמוד את הפרשת מגוון של פפטידים בטן, כולל GLP-1 1, GIP 18 ו PYY 19, בתגובה המזינה מגוון ולא מזין 14, 20 גירויים ומעכבים. יתר על כן, באותה הטכניקה יושמה בהצלחה לתרבות של תאים אנושיים מעיים 21. לעתים קרובות, שילוב של שיטת תרבית תאים ראשונית יחד עם למשל מודל ניסיוני נוסף. vivo לשעבר או in vivo יכול לספק את רוב תובנה 6. יש לציין, ובניגוד לשיטות אחרות, הטכניקה הזו יש imיישומים הנסב מעבר למדידה של שחרור פפטיד המעיים. הוכחנו כי תרבויות מעי דק עיקריות נגזרו עכברי כתב מהונדסים הם כלים רבים עצמה עבור החקירה של מסלולי איתות תאיים המצמידים בבטן הפרשת פפטיד, באמצעות למשל Ca 2+ וחיישנים מחנים, 11 GCaMP3, 13 ו Epac2camps 14, בהתאמה, כמו גם טכניקות אלקטרו 12.
כמו בכל הדגמים במבחנה, תרבויות המעיים העיקריות יש מגבלות מובנות מסוימות, לרבות אובדן הקוטביות של תאי האפיתל בתרבות, כמו גם האובדן של היצע עצבוב דם. קשה לאמוד את ההשפעות האפשריות של תנאים מלאכותיים אלה על תפקוד התא enteroendocrine. עם זאת, נתונים המתקבלים מתרבויות עיקריות עמדו פעמים רבות לתרגום ב in vivo settiננוגרם (למשל ההשפעות של חומצות שומן קצרות שרשרת על GLP-1 הפרשת 15).
תרבויות המעיים העיקריות הן טכניקה תכליתית עם יישומים פוטנציאליים רבים. הם כבר סיפקו תובנות מכניסטית חשוב אל תקנה של הפרשת פפטיד המעיים.
Disclosures
החוקרים אין לחשוף.
Acknowledgments
GLP-1-מבחנים חיסוניים בוצעו על ידי מעבדת assay ביוכימיים Core בבית חולי Addenbrooke.
עבודה זו, לאורך השנים, היה נתמך על ידי קרן Wellcome (כיום מענקים פעילים 106,262 / Z / 14 / Z ו- 106,263 / Z / 14 / Z) ואת המועצה למחקר רפואי (MRC) (מענקים MRC_MC_UU_12012 / 3 ו MRC_MC_UU_12012 / 5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Costar | 3524 | For secretion experiments |
| Bombesin | Sigma-Aldrich | B4272 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Centrifuge tubes, 15 mL, sterile | Greiner bio-one | 188261 | For tissue preperation/digestion |
| Centrifuge tubes, 50 mL, sterile | Corning | 430828 | For tissue preperation/ digestion |
| Collagenase XI (Crude) | Sigma-Aldrich | C9407 | For making up digestion medium |
| Dichroic mirror | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| DMEM High glucose (4500 mg) | Sigma-Aldrich | D6546 | For dissolving matrigel (keep at 4 °C). For making up digestion medium, pre-warm to 37 °C. |
| Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm) | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| Foetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | For making up culture medium |
| Forceps/Tweezers | Agar Scientific | AGT520 | For dissection/removal of intestine |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | Positive control (secretion experiment) |
| Glass-bottomed dishes (35 mm) | MatTek | P35G-0-14-C | For imaging experiments |
| High precision tweezer (110 mm) | IDEAL-TEK | 3480641 (5 SA) | For removing muscle layer |
| High resolution digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-ER | For imaging experiments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Positive control (secretion experiment) |
| L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | For collecting tissue, keep on ice |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For making up culture medium |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes |
| MetaFluor | Molecular Devices (supplied by Cairn Research) | - | Fluorescence ratio imaging software |
| Mice (C57BL6) | Charles River Laboratories | C57BL/6J | Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments |
| Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3) | in house | - | For calcium imaging and secretion experiments |
| Microscope (EVOS XL Core) | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | For photomicrographs of cultures |
| Microscope | Olympus | IX71 | Inverted microscope with 40X oil objective used for imaging experiments |
| Monochromator | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4234 | For cleaning tissue |
| PBS containing Ca2+ and Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | For washing tissue, keep on ice |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | For making up culture medium |
| Petri dishes (100 mm x 20 mm) | Corning | CLS430167 | For cleaning tissue and removing muscle layer |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P/4280/53 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Scissors | Agar Scientific | AGT554 | For dissection/removal of intestine |
| Sterile cell strainer 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | For filtering crypt cell suspension prior to plating |
| Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless) | Swann Morton | 0308 | For dicing tissue |
| Syringe filters, Minisart NML (0.2 µm pore size) | Sartorius | 16534-K | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Syringes, 20 mL, disposable, sterile, Luer slip | BD | 300613 | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Xenon arc lamp 75W | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1,000 in final culture medium) |
References
- Reimann, F., Habib, A. M., Tolhurst, G., Parker, H. E., Rogers, G. J., Gribble, F. M. Glucose sensing in L cells: A primary cell study. Cell Metab. 8, 532-539 (2008).
- Psichas, A., Reimann, F., Gribble, F. M. Gut chemosensing mechanisms. J Clin Invest. 125 (3), 908-917 (2015).
- Lovshin, J. A., Drucker, D. J. Incretin-based therapies for type 2 diabetes mellitus. Nat Rev Endocrinol. 5 (5), 262-269 (2009).
- Svendsen, B., Holst, J. J. Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines. Peptides. 77, 47-53 (2016).
- Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine. Diabetes. 64 (2), 370-382 (2015).
- Brighton, C. A., et al. Bile acids trigger GLP-1 release predominantly by accessing basolaterally located G protein-coupled bile acid receptors. Endocrinology. 156 (11), 3961-3970 (2015).
- Petersen, N., et al. Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids. Diabetes. 63 (2), 410-420 (2014).
- Brubaker, P. L., Vranic, M. Fetal rat intestinal cells in monolayer culture: a new in vitro system to study the glucagon-like immunoreactive peptides. Endocrinology. 120 (5), 1976-1985 (1987).
- Kuhre, R. E., et al. Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716, and STC-1 cells: a comparison to native L-cells. J Mol Endocrinol. 56 (3), 201-211 (2016).
- Gerbe, F., et al. Distinct ATOH1 and Neurog3 requirements define tuft cells as new secretory cell type in the intestinal epithelium. J Cell Biol. 192 (5), 767-780 (2011).
- Pais, R., Gribble, F. M., Reimann, F. Signalling pathways involved in the detection of peptones by murine small intestinal enteroendocrine L-cells. Peptides. 77, 9-15 (2016).
- Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. J Physiol. 589 (Pt 5), 1081-1093 (2011).
- Emery, E. C., et al. Stimulation of GLP-1 secretion downstream of the ligand-gated ion channel TRPA1. Diabetes. 64 (4), 1202-1210 (2015).
- Psichas, A., Glass, L. L., Sharp, S. J., Reimann, F., Gribble, F. M. Galanin inhibits GLP-1 and GIP secretion via the GAL1 receptor in enteroendocrine L and K cells. Br J Pharmacol. 173 (5), 888-898 (2016).
- Tolhurst, G., et al. Short-chain fatty acids stimulate glucagon-like peptide-1 secretion via G-protein-coupled receptor FFAR2. Diabetes. 61 (2), 364-371 (2012).
- Richards, P., et al. High fat diet impairs the function of glucagon-like peptide-1 producing L-cells. Peptides. 77, 21-27 (2016).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Parker, H. E., Habib, A. M., Rogers, G. J., Gribble, F. M., Reimann, F. Nutrient-dependent secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from primary murine K cells. Diabetologia. 52 (2), 289-298 (2009).
- Pais, R., Rievaj, J., Larraufie, P., Gribble, F. M., Reimann, F. Angiotensin II type 1 receptor-dependent GLP-1 and PYY secretion in mice and humans. Endocrinology. 157 (10), 3821-3831 (2016).
- Moss, C. E., et al. Somatostatin receptor 5 and cannabinoid receptor 1 activation inhibit secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from intestinal K cells in rodents. Diabetologia. 55 (11), 3094-3103 (2012).
- Habib, A. M., Richards, P., Rogers, G. J., Reimann, F., Gribble, F. M. Co-localisation and secretion of glucagon-like peptide 1 and peptide YY from primary cultured human L cells. Diabetologia. 56 (6), 1413-1416 (2013).
