Se presenta un protocolo que combina el aislamiento de células y de células enteras patch-clamp de registro para medir las propiedades eléctricas de la primaria células epiteliales disociadas de la cauda de la rata epididimidas. Este protocolo permite investigar las propiedades funcionales de las células epiteliales epididimales primarias para dilucidar adicionalmente el papel fisiológico del epidídimo.
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Artículo de método
Grabaciones de parche de sujeción de células enteras de células epiteliales primarias aisladas del epidídimo
En este artículo
Resumen
Resumen
El epidídimo es un órgano esencial para la maduración de los espermatozoides y la salud reproductiva. El epitelio epidídimo consiste en tipos de células intrínsecamente conectados que son distintos no sólo en características moleculares y morfológicas sino también en propiedades fisiológicas. Estas diferencias reflejan sus diversas funciones, que en conjunto establecen el microambiente necesario para el desarrollo de espermatozoides post-testicular en el lumen epididimario. La comprensión de las propiedades biofísicas de las células epiteliales epididimales es crítica para revelar sus funciones en el esperma y la salud reproductiva, tanto en condiciones fisiológicas como fisiopatológicas. Mientras que sus propiedades funcionales aún no se han dilucidado completamente, las células epiteliales epididimales se pueden estudiar mediante la técnica de parche-clamp, una herramienta para medir los eventos celulares y las propiedades de membrana de células individuales. Aquí, describimos los métodos de aislamiento de células y de células enteras de pinza de sujeción de grabación a meaAsegúrese de las propiedades eléctricas de las células epiteliales disociadas primarias de la rata cauda epididimidos.
Introducción
El epidídimo en el tracto reproductor masculino es un órgano revestido con una capa de células epiteliales de mosaico. Al igual que en otros tejidos epiteliales, los diversos tipos celulares del epitelio epidídimo, incluyendo células principales, células claras, células basales y células de los sistemas inmunológico y linfático, trabajan de manera concertada para funcionar como la barrera en el frente del túbulo y como Células de apoyo para la maduración de los espermatozoides y la fisiología 1 , 2 , 3 . Por lo tanto, estas células epiteliales desempeñan un papel esencial en....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales se llevan a cabo de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Shanghai, que cumplen con los requisitos locales e internacionales.
1. Animales Experimentales
- Utilizar ratas Sprague-Dawley macho adultas (~ 300-450 g) entre 8-12 semanas de edad. A esta edad en las ratas, los espermatozoides han llegado a la cauda epididimida.
2. Aislamiento de las células epiteliales de los epididimidos de la cauda de la rata
NOTA: Los siguientes pasos se realizan bajo condiciones no aséptic....
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Resultados
El procedimiento de digestión enzimática descrito para el aislamiento de células epiteliales del epidídimo de cauda de rata es un protocolo modificado de nuestros estudios anteriores 9 , 12 . Este método produce una mezcla de células individuales con más del 90% de viabilidad y sin ampollas superficiales o volumen de células hinchadas. La mezcla heterogénea de células se compone principalmente de células principales, células clar.......
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Discusión
En este protocolo, la dispersión enzimática de los epididimidos de cauda de rata produjo consistentemente células epiteliales sanas. La calidad de las células epiteliales epididimales para los experimentos de parche-clamp depende de unos pocos pasos críticos en el protocolo. Por ejemplo, la centrifugación de la mezcla celular a una fuerza centrífuga baja (30 xg) es importante para eliminar los espermatozoides y el contenido luminal epidídimo; Las células epiteliales del epidídimo se vuelven insalubres en presencia de lo.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Damos las gracias al Dr. Christopher Antos por sus útiles comentarios sobre el texto. Este trabajo fue apoyado por el financiamiento inicial de la Universidad de ShanghaiTech otorgado a Winnie Shum y por el financiamiento de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NNSFC N ° 31471370).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Instrumento del sistema AXON | |||
| Amplificador controlado desde computador | Molecular Devices - | Axon Multiclamp 700B Amplificador | |
| adquisición digital | Molecular Devices - Convertidor | ||
| Microscopio Microscopio | |||
| Sutter Instruments | MPC-325 | ||
| Cámara de grabación y calentador en línea | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument del sistema HEKA | |||
| Patch Clamp amplificador | Harvard Bioscience - HEKA | EPC-10 USB doble | |
| Microscopio | |||
| Sutter Instruments | MPC-325 | ||
| Cámara de grabación y calentador en línea | Warner Instruments | TC-324C | |
| Otro instrumento | |||
| micropipetas | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Cámara de grabación | Warner Instruments | RC-26G o cámara | |
| Vidrio capilar de borosilicato con filamento | Sutter Instrument / Harvard Apparatus | BF150-86-10 | |
| Mesa de aislamiento de vibraciones | TMC | 63544 | |
| Cámara digital | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| fuerte>Reactivos para aislamiento | |||
| RPMI 1640 | medio Gibco | 22400089 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Gibca 15140112 | ||
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco C12440500BT | ||
| Colagenasa I | Sigma | C0130 | |
| Colagenasa II | Sigma | C6885 | |
| 5-&alfa;-dihidrotestosterona | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Suero fetal bovino | capricornio | FBS-12A | |
| Soluciones internas de micropipeta (solución basada en K+) (pH 7,2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/varios | V900068 | |
| MgCl2 · 6H2O, 2mM | Sigma/varios | M2393 | |
| EGTA, 0,1mM | Sigma/varios | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/ varios | V900477 | |
| K-gluconato, 100 mM | Sigma/varios | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3 mM | Sigma/Varios | A9187 | |
| La solución salina fisiológica de registro externo estándar (PSS) (pH 7,4, 300-310 mOsm) | |||
| NaCl, 140 mM | Sigma/varios | V900058 | |
| KCl, 4,7 mM | Sigma/varios | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/varios | V900266 | |
| MgCl2 · 6H2O, 1.2mM | Sigma/varios | M2393 | |
| NaH2PO4, 1.2mM | Sigma/varios | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/varios | V900477 | |
| Glucosa, 10mM | Sigma/varios | V900392< | |
| fuerte>Para el ajuste del pH | |||
| NaOH | Sigma/varios | V900797 | Pureza >=97% |
| KOH | Sigma/varios | 60371 | Pureza >=99.99% |
Referencias
- Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
- Robaire, B., Hinton, B. T. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. Plant, T. M., Zeleznik, A. J.....
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Reimpresiones y permisos
