Summary
Aquí presentamos un método estereológico, el fraccionador óptico, utilizado para cuantificar la formación de nuevas neuronas, y su supervivencia, en el hipocampo de rata después de la estimulación electroconvulsiva. Cuando se implementa correctamente, la sensibilidad y eficiencia de los métodos estereológicos garantiza estimaciones precisas con una precisión fija y predeterminada.
Abstract
Los métodos estereológicos están diseñados para describir parámetros cuantitativos sin hacer suposiciones sobre tamaño, forma, orientación y distribución de células o estructuras. Estos métodos han sido revolucionarios para el análisis cuantitativo del cerebro de mamífero, en el que las poblaciones de células volumétricas son demasiado altas para contar manualmente, y la estereología es ahora la técnica de elección cuando las estimaciones de las cantidades tridimensionales necesitan ser extraídas de las mediciones bidimensionales Secciones. Todos los métodos estereológicos son en principio imparciales; Sin embargo, se basan en el conocimiento apropiado sobre la estructura de interés y las características del tejido. La estereología se basa en un muestreo sistemático aleatorio (SURS) sistemático, con ajuste del muestreo al nivel más eficiente con respecto a la precisión, proporcionando información confiable y cuantitativa sobre toda la estructura de interés. Aquí presentamos el fraccionador óptico en conjunción con inmunohistoquímica BrdU tO estimar la producción y supervivencia de neuronas recién formadas en la capa de células granulares (incluida la zona sub-granular) del hipocampo de rata después de la estimulación electroconvulsiva, que está entre los estimuladores más potentes de la neurogénesis. La técnica de fraccionamiento óptico está diseñada para proporcionar estimaciones del número total de células de secciones gruesas muestreadas de la estructura completa. Las secciones gruesas proporcionan la oportunidad de observar las células en su extensión completa 3-D y por lo tanto, permiten una clasificación celular fácil y robusta basada en criterios morfológicos. Cuando se implementa correctamente, la sensibilidad y la eficiencia del fraccionador óptico proporcionan estimaciones precisas con una precisión fija y predeterminada.
Introduction
La cuantificación de células en una estructura tridimensional (3-D) puede requerir la obtención de estimaciones basadas en principios imparciales. Incluso hoy en día, los estudios usan frecuentemente métodos bidimensionales (2-D) para reportar datos de estructuras tridimensionales. Sin embargo, estos métodos no consideran la naturaleza heterogénea de la estructura en términos de forma y distribución de células que resulta en limitaciones metódicas; Hacen suposiciones sobre la estructura tridimensional de interés y los resultados no se refieren a la estructura completa. Estas limitaciones reducen la sensibilidad y la precisión de los métodos, así como aumentan el riesgo de errores 1 .
El sesgo en el conteo de células puede evitarse mediante la aplicación de estereología basada en diseño, que es de importancia general para obtener información cuantitativa sobre el número de células en un tejido o estructura dado. Si bien la estereología ha sido un método que tarda mucho tiempo, los avances en procedimientos,Ware y la imagen, ha hecho que sea mucho más eficiente y ampliamente aplicable. La estereología implica principios de muestreo estadístico y teoría geométrica estocástica para proporcionar herramientas eficientes para estimar el volumen, el área superficial, la longitud y el número de objetos en una estructura tridimensional por muestreo en secciones 2D. Por lo tanto, la estereología permite obtener datos cuantitativos no sesgados sobre los cambios estructurales en las secciones de tejido, que dan estimaciones promedio de los números verdaderos, sin análisis exhaustivo 1 . La estereología se define como la inferencia estadística de los parámetros geométricos de la información muestreada. Esto puede lograrse mediante el muestreo no sesgado, es decir, el muestreo aleatorio sistemático de secciones, así como las reglas de conteo que aseguran que todos los objetos tienen probabilidades iguales de ser contados 3 . Mientras que los resultados estereológicos pueden tener diversos grados de precisión como se indica por el coeficiente de error (CE), esto puede serAjustada a la varianza biológica inherente (coeficiente de varianza (CV)) ajustando la cantidad de muestreo que se requiera 4 , 5 . Algunos estudios estereológicos previos han examinado los efectos a corto plazo de la estimulación electroconvulsiva (ECS) sobre la plasticidad del hipocampo en roedores 6,7 . Los datos de estos estudios muestran un aumento inicial en el número total de neuronas, así como una diferenciación sináptica elevada tras ECS repetidas. Sin embargo, estos estudios no estiman la neurogénesis directamente, ya que no utilizan marcadores específicos para la proliferación celular.
Aquí presentamos una aplicación de un método estereológico, la técnica de fraccionamiento óptico 8 , 9 , para cuantificar el número total de neuronas recién formadas en la capa celular de gránulos del hipocampo de rata (GCL), incluyendo también la zona subgranular (SGZ) Como su largo plazoUrvival 10 , 11 . Se sometió a las ratas a un calendario clínico relevante de ECS (tres veces a la semana durante 3 semanas), que es uno de los estimuladores más potentes de la neurogénesis [ 12] . Los animales de control se trataron usando el mismo procedimiento, pero sin pasar de corriente. En cada uno de los 21 días de experimentación, todas las ratas se inyectaron intraperitonealmente con 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) que se incorpora en el ADN en lugar de timidina durante la división celular 13 . Después de la experimentación, las ratas se mantuvieron durante cuatro períodos de tiempo diferentes (24 horas, 3 meses, 6 meses y 12 meses). Utilizando el principio del fraccionador, se obtuvo una fracción conocida del hipocampo a través de un muestreo aleatorio uniforme de secciones, y se aplicaron los disectores ópticos (sondas 3-D) a las secciones de tejido grueso muestreado e inmunotenso. Se observa especialmente que las secciones congeladas generalmente se colapsan en el eje z durante el procesoY que los desvia- dores ópticos basados en el espesor de la sección media ponderada en número deberían usarse en este caso particular [ 14] . Como el plano focal de los disectores ópticos se movió una distancia conocida a través de la sección, las neuronas positivas para BrdU se contaron cuando su característica de interés se reconoce claramente. En el campo de la estereología hay cierto debate sobre el número total de partículas que deben contarse 15 ; Típicamente 150-200 neuronas se cuentan en la estructura de interés para obtener una precisión adecuada es decir un coeficiente de 7-8% 8 . Los conteos neuronales positivos para BrdU se completaron utilizando un software estereológico con formación de imágenes mediante un microscopio estándar equipado con cámara y los objetivos siguientes: 2X, 4X y 10X, así como un objetivo de inmersión en aceite 100X (abertura numérica = 1,40) y una etapa motorizada . Los movimientos en la dirección z se midieron con un microcador digital. La ampliación finalFue de 3000X.
Protocol
Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de la Inspección de Experimentación Animal danesa y fueron aprobados por el comité local de ética para Animales Experimentales.
1. Procesamiento de tejidos
Después de la perfusión transcardial y post fijación en paraformaldehído al 4% (PFA) diluido en tampón de fosfato 0,2 M durante la noche a 4ºC, los cerebros se transfieren a sacarosa al 30% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 3 días a 4ºC. A continuación, los cerebros se congelan sobre hielo seco en polvo y se almacenan a -80 ° C hasta seccionar.
- Separe los hemisferios derecho e izquierdo a lo largo de la línea media del cerebro usando un bisturí y luego elija uno u otro hemisferio al azar en el primer cerebro, para luego cambiar sistemáticamente entre hemisferio derecho e izquierdo ( Figura 1A ). Monte el hemisferio muestreado sobre un disco de muestra con el eje largo perpendicular al discoUtilizando un medio de montaje.
- Coloque los recipientes multidiscos numerados para pre-enfriamiento en el criostato.
- Montar el disco de la muestra en el criostato y cortar la totalidad del hipocampo (Bregma 1.80 a - 7.04 16 ) en 80 μ m de espesor secciones en el plano coronal ( Figura 1B ].
- Coloque todas las secciones muestreadas consecutivamente en los recipientes multidiscos enfriados, para asegurar que las secciones se mantengan en orden de corte.
- Cubrir las secciones completamente con crioprotector y mantener los envases a -20 ° C hasta su uso posterior.
2. Immunostaining
NOTA: Para realizar un seguimiento de las secciones individuales durante todo el procedimiento de tinción, coloque las secciones muestreadas en redes de tinción de 25 pocillos. Utilice cada 5 ª sección, dando un número final promedio de 12 (8-16) secciones por hipocampo para la inmunotinción y posterior contaje celular.
- Antes de submuestrear cada n- ésima sección con un inicio aleatorio entre la sección uno y la sección n ( Figura 1C ), transfiera los recipientes de -20 ° C a la temperatura ambiente (RT).
- Utilizar, por ejemplo, un pincel, para transferir las secciones en orden numérico a las redes de 25 pocillos de tinción colocadas en placas petri llenas de PBS.
NOTA: A partir de este punto, mantenga las secciones en las redes de tinción que se colocan en platos de vidrio a juego colocados en un agitador orbital (sección 2.3 a 2.9). - Transferir las redes de tinción a las placas de vidrio correspondientes y lavar las secciones dos veces durante 10 minutos en PBS a RT antes de la incubación con peróxido de hidrógeno al 3% (H2O2) diluido en agua destilada (dH2O) durante 20 min.
- Transferir las secciones a tres soluciones diferentes de ácido clorhídrico (HCl) (1 M a 0 ° C durante 10 min, 2 M a RT durante 10 min y 2 M a 37 ° C durante 20 min) antes de la neutralización en tetraborato de sodio 0,1 M unT RT durante 20 min.
- Después de incubaciones de 3x10 min en Triton X-100 al 1% diluido en PBS (tampón de lavado), transferir las secciones a un tampón de lavado que contiene suero bovino fetal al 10% (solución de bloqueo) durante 1 h a RT.
- Incubar las secciones durante 48 h a 4 ° C en ratón-anti-BrdU diluido 1: 100 en solución de bloqueo.
- Lavar las secciones 3 x 10 min en tampón de lavado, e incubar durante 48 h en peroxidasa de rábano picante diluido 1:10 en tampón de lavado.
- Transferir las secciones a PBS durante 5 x 10 min, y luego durante 7 min en 0,01% de diaminobenzidina (DAB) diluidas en PBS antes de transferirlas a una solución similar de DAB que contiene 0,02% de H2O2 durante 10 min a TA.
- Completar una serie de lavados (2 x 10 min en PBS y 2 x 10 min en tampón de fosfato sin cloruro de sodio añadido) y montar las secciones en orden numérico en portaobjetos de microscopio.
- Secar las secciones durante aproximadamente 30 minutos antes de recocer con cresilVioleta.
- Coloque los portaobjetos del microscopio en un portaobjetos.
- Rehidratar las secciones durante 10 min en placas de tinción de diapositivas que contienen dH2O, y luego transferir las diapositivas a violeta de cresilo al 0,02% en dH2O durante 15 min.
- Repita el paso 2.12 antes de que las secciones se deshidraten tres veces en etanol (96% durante 5 min y 99% durante 2 × 2 min).
- Colocar las secciones en xileno durante 2 x 15 min y cubrir las diapositivas con un medio de secado rápido para su montaje.
- Por último, deje los portaobjetos deslizados durante aproximadamente 24 horas antes de poder utilizarlos para la microscopía.
3. Estimación del número total de neuronas marcadas con BrdU usando el fraccionador óptico
NOTA: Llevar a cabo un estudio piloto que incluya algunos animales para determinar los parámetros de muestreo óptimos, como el número de secciones a analizar y el número de disectores ópticos dentro de las secciones muestreadas. Este piloto tambiénCV preliminar (desviación estándar / media) y la posibilidad de ajustar el CE (ver sección 3.9.3) para obtener una precisión satisfactoria de las estimaciones determinadas por el investigador (para más detalles ver más abajo). Del mismo modo, realizar un análisis de distribución z para abordar los siguientes puntos: la contracción del tejido, la calidad de la tinción en toda la sección y la distribución de las células en el eje z [ 14] .
- Compruebe el grosor del tejido en las secciones para confirmar que son adecuados para el uso del fraccionador óptico, por ejemplo , es lo suficientemente grueso para la altura del disector seleccionada incluyendo las zonas de protección (véase más adelante). NOTA: El grosor del tejido es medido en varios lugares dentro de la región de interés.
- Coloque los portaobjetos en la etapa motorizada del microscopio y encienda el software estereológico preferido.
- Delinear el área de interés utilizando un objetivo de baja ampliación (2X o 4X) antes de cambiar a un 100X aceite-imm(Véase la figura 2A ).
- Usando un punto específico de un marco de conteo ( por ejemplo, en o adyacente a una esquina), localice la parte superior de la sección moviéndose a lo largo del plano focal hasta que aparezca alguna característica de la sección en el enfoque. Registre esta posición z como 0 (vea la Figura 2B ).
- Mueva el plano focal hacia abajo a través del tejido hasta que el mismo punto específico del marco de recuento esté en el último nivel z del tejido en foco y marque esta posición. El espesor de tejido local se define de 0 a este punto final y se puede leer en el eje z. Registrar el grosor del tejido (ver Figura 2B ).
- Documentar la penetración completa de la mancha y la distribución de las células en todo el espesor de la sección.
NOTA: La distribución de las neuronas marcadas con BrdU se utiliza como guía para determinar las zonas de protección requeridas. Aunque una distribución uniforme de células es crítica,Es aceptable observar menos células cerca de la parte superior e inferior de la sección, indicando el efecto de las cápsulas perdidas (para más detalles ver Dorph-Petersen et al., 2009).- Muestra de neuronas marcadas con BrdU y registra su posición z junto con el grosor de sección local medido en la esquina seleccionada de cada marco de recuento.
- Trace el número de neuronas positivas a BrdU como una función de su posición z.
- Fijar la altura de las zonas del disector y del protector según el espesor medio de la sección y la distribución de las celdas (véanse 3.1 y 3.2).
NOTA: La altura del disector debe ser menor que el grosor de la sección para evitar artefactos cerca de las superficies. Este riesgo se evita mediante la inclusión de zonas de protección en la parte superior e inferior de la sección. - Determine la longitud del paso entre los descriptores.
- Delinear la región de interés en todas las secciones a analizar y registrar las áreas.
- Sumar estas áreas y luego dividir bY el número de distritos que se colocarán dentro de esta área.
NOTA: Basado en la experiencia previa un buen punto de partida implica 75 sondas. Esto proporcionará una aproximación del área y las posiciones de muestreo correspondientes ( paso A) (para más detalles ver Oeste, 2012). - Tome la raíz cuadrada de un paso , que proporcionará el tamaño xy-paso.
- Determine el tamaño del marco de conteo.
- Ajustar el tamaño del fotograma de conteo a una unidad arbitraria y realizar un muestreo piloto de neuronas positivas para BrdU utilizando los parámetros obtenidos en las secciones 3.3 y 3.4.
NOTA: El tamaño debe determinarse empíricamente por ensayo y error, pero se recomienda ajustarlo para permitir el muestreo de 2-3 células por disector 8 .
- Ajustar el tamaño del fotograma de conteo a una unidad arbitraria y realizar un muestreo piloto de neuronas positivas para BrdU utilizando los parámetros obtenidos en las secciones 3.3 y 3.4.
- Después de este último paso del estudio piloto comienza el muestreo de células.
NOTA: Los parámetros de muestreo obtenidos deben resultar en recuentos de aproximadamente 150-200 células iN cada animal que es suficiente para obtener un diseño estereológico eficiente 8 . - Cuente las neuronas positivas a BrdU usando un objetivo de inmersión en aceite de 100 × y una ampliación final de 2000-3000 ×. En cada disector óptico, se identifican las neuronas marcadas con BrdU que son claramente reconocidas por la característica de interés (en el presente estudio, el criterio es cuando el borde de ataque de la neurona marcada con BrdU se enfoca por primera vez), se localizan Dentro del marco de conteo o toque las líneas de inclusión ( Figura 2B ). No cuente las neuronas positivas a BrdU que, cuando claramente reconocidas por la característica de interés dentro de la altura del disector, toquen las líneas de exclusión. Es críticamente importante seguir escrupulosamente estas reglas de conteo a lo largo de toda la cuantificación estereológica.
NOTA: A medida que BrdU se incorpora a todas las células en división, se utiliza la morfología para distinguir entre neuronas y otros tipos de células. NeuRon son un núcleo claramente definido con un citoplasma neutro y un nucléolo oscuro. Las células positivas a BrdU se reconocen como neuronas recién formadas en base a su tamaño relativamente mayor en comparación con las células gliales. Debe mencionarse que en los estudios de proliferación a corto plazo (por ejemplo, <24 h) la doble tinción utilizando inmaduros marcadores neuronales puede ser un requisito previo [ 17] . - Estimar el número total de neuronas positivas para BrdU en cada cerebro multiplicando el número total de células contadas (Σ Q - ) por las fracciones de muestreo recíproco:
para
dónde
Q- es el espesor de la sección media ponderada en número, h es la altura del disector, asf es la fracción de muestreo de área, ssf es la sección sFracción de amplificación y t i es el espesor de sección en la iª trama de conteo con un recuento de células de 
En el disector 14 , 18 . - Calcular el coeficiente de error (CE) 8 que es la varianza de muestreo de las neuronas positivas para BrdU en el muestreo sistemático y uniformemente aleatorio (SURS).
- Primero, calcule el ruido , que es igual al número total de neuronas BrdU-positivas contadas:
- A continuación, calcule la varianza en SURS:
NOTA: Hemos juzgado el área y los recuentos de células en el hipocampo para cambiar suavemente de sección a sección y por lo tanto se utiliza "clase de suavidad" m = 1 (1/240) 8 , 19
dónde
P i es el número de puntos contados para el objeto en la i- ésima sección yn es el número de secciones 4 , 20 . - Finalmente, calcule el CE de la estimación:
NOTA: En general, la precisión óptima se logra típicamente cuando el valor CE es menor que la mitad del CV observado, como OCV 2 = ICV 2 + CE 2 , donde OCV es el CV observado y ICV es el CV 4 inherente.
- Primero, calcule el ruido , que es igual al número total de neuronas BrdU-positivas contadas:
Q- es el espesor de la sección media ponderada en número, h es la altura del disector, asf es la fracción de muestreo de área, ssf es la sección sFracción de amplificación y t i es el espesor de sección en la iª trama de conteo con un recuento de células de 
En el disector 14 , 18 . 
FFigura 1: Ilustración esquemática que muestra el procesamiento de tejidos de acuerdo con los principios del fraccionador utilizados en el presente estudio.
Después de la experimentación, los hemisferios están separados y el hemisferio derecho o izquierdo elegido sistemática y aleatoriamente (A). El cerebro completo que se extiende sobre todo el hipocampo se corta en cortes coronales de 80 μm de grosor (B), tras lo cual cada 5 ª sección se sub-muestra, comenzando aleatoriamente entre las secciones 1 a 5, para la inmunotinción final y cuantificación estereológica (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ilustración que muestra el procedimiento de muestreo estereológico usando disectores ópticos.
(A) Después del procesamiento histológico, la hEl Ippocampal GCL / SGZ fue delineado y los disectors ópticos aplicaron uniformemente y aleatoriamente sobre la región. (B) En los disectores ópticos (izquierda), las neuronas positivas para BrdU se contaron sólo si su característica de interés se reconoce claramente dentro de la altura del disector y se sitúa dentro del marco de recuento o se toca la línea de inclusión (derecha). Las neuronas que tocan la línea de exclusión no fueron contadas. Barras de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Representative Results
Parámetros de muestreo
Analizando la distribución z en un estudio piloto ( Figura 3 ), encontramos una distribución uniforme de BrdU-positivas neuronas en la altura del disector. Se midió el encogimiento de las secciones; El espesor medio final fue de 26,4 μm (19,0-32,0 μm) en secciones cortadas originalmente a 80 μm. Basándose en el grosor del tejido y la distribución de las neuronas marcadas con BrdU, la altura del disector se ajustó a 10 μm y las zonas de protección en la parte superior e inferior de la sección se ajustaron a 5 μm y 4-17 μm respectivamente. Dependiendo de la densidad de las células, el área de los marcos de recuento era 1414 ó 5210 μm 2 . La longitud del paso fue de 220 mu m en ambas direcciones xey, y el conteo de células se realizó en un promedio de 12 secciones (rango 8-16) por animal. Estos parámetros de muestreo dieron como resultado una media de 133 (rango 33-372) BrdU-positivas contadas en 173 (107-204) disectores en cada hemisferio cerebral.
Como ejemplo, se obtuvieron los siguientes valores de CV y CE para las estimaciones neuronales positivas para BrdU en ratas tratadas con ECS: 24 horas: CV = 0,59, CE = 0,11; 3 meses: CV = 0,34, CE = 0,12; 6 meses: CV = 0,43, CE = 0,09; 12 meses: CV = 0,22, CE = 0,09.
Cuantificamos el número total de nuevas neuronas y su supervivencia a largo plazo en el hipocampo de rata después de ECS utilizando el fraccionador óptico en conjunción con una técnica de tinción BrdU [ 10 , 11] . Los resultados finales mostraron una neurogénesis basal en los cuatro grupos de animales de control, que no difirió significativamente en función del tiempo de supervivencia ( Figura 3 ). Además, ECS indujo un aumento significativo en el número total de BrdU-positivas neuronas en 24(269%, p <0,0001), 6 (152%, p <0,05) y 12 meses (162%, p <0,05) después de la experimentación, en comparación con los animales control.
Figura 3: Datos cuantitativos del número total de neuronas positivas para BrdU en el GCL / SGZ del hipocampo de rata 10 , 11 .
Las barras horizontales representan los valores medios. Abreviaturas: GCL, capa celular de gránulos; SGZ, zona sub-granular; H, horas; M, meses. **** p <0,0001, *** p <0,001 y * p <0,05 frente al control (n = 11-12 por grupo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Utilizando ECS como una metodología para inducir la neurogénesis, encontramos un aumento inmediato del 260% en la formación de nuevas neuronas positivas para BrdU en el hipocampo. En este conjunto de neuronas generadas de forma aguda encontramos 40% de desgaste desde el día 1 hasta tres meses, con casi el 50% de las neuronas recién formadas sobreviviendo al menos 12 meses después del tratamiento 10 , 11 . El recuento de las neuronas marcadas con BrdU siguió un estricto esquema de muestreo, con lo cual el hipocampo entero se cortó en secciones de 80 μm de espesor seguido de submuestreo de cada 5 ª sección con un inicio de muestreo aleatorio entre la sección uno y la sección cinco. Proporcionar estas secciones se eligen de manera sistemática al azar, esto es demostrablemente un excelente método para reducir la varianza del resultado final, sin recuento exhaustivo 1 . Este esquema de muestreo nos permitió contar neuronas positivas a BrdU en un promedio de 12 (8-16) hipocamposEn cada cerebro de rata, con una precisión final del 9-11%.
Cuando se utiliza el método del fraccionador, es esencial conocer la fracción de la altura de la sección en la que se realiza el recuento, ya que la contracción y deformación tisular ocurre frecuentemente durante el procesamiento histológico 14 . De hecho, se observó una contracción considerable del grosor en este estudio. Además, debe observarse que puede producirse una retracción diferencial del tejido, tal como se presenta en Dorph-Petersen et al. 2001. Sin embargo, siempre y cuando la estructura completa de interés esté disponible para el análisis, estas limitaciones no resultan en un sesgo del número total de partículas, es decir , las neuronas positivas para BrdU. En estudios en los que la contracción del tejido es un problema particular, siempre debe indicarse que los resultados se obtienen en tejido deformado. En este estudio, se contó con una altura de 10 μm. Las secciones del presente estudio tenían un espesor medio final de 26 μm, un espesor de 5 μmZona de protección en la parte superior y una zona de guarda de 11 μm (media) en la parte inferior de la sección. Estos parámetros son aceptables ya que las zonas de protección deben ser aproximadamente el diámetro de las partículas muestreadas.
Después de la delineación del GCL / SGZ, los disectors fueron colocados uniformemente aleatoriamente dentro del área delineada. Los descriptores deben ser posicionados con una longitud de paso fija que optimice el muestreo y el recuento para obtener eficientemente estimaciones con una precisión determinada por el investigador. La precisión óptima se logra típicamente contando hasta 150-200 células en cada estructura de interés 5 . En el presente estudio, se contó una media de 133 (rango 33-372) BrdU-positivas neuronas en cada rata hipocampo. Debido a un bajo número de células en algunos de los animales de control, nuestro número de neuronas positivas para BrdU cayó por debajo del número generalmente aceptable de células necesarias para obtener una precisión adecuada, lo que dio lugar a valores CE relativamente altos para esos casos. MARIDOSin embargo, como obtuvimos valores CE de menos de la mitad de los valores de CV (ver sección de resultados representativos) no se requirió muestreo y conteo adicionales. Los altos valores de CV muestran que el mayor contribuyente a la variación observada proviene de la variación biológica. De hecho, podríamos afirmar que el número promedio de neuronas positivas para BrdU contadas en el presente estudio fue mayor de lo necesario. Por ejemplo, en un grupo de ratas alcanzamos un valor de CE del 9% y observamos un valor de CV del 43%. En este caso particular, podríamos haber apuntado para una precisión de aproximadamente el 20%. En resumen, la precisión del número total de neuronas positivas para BrdU en el presente estudio es suficiente, ya que captura los efectos reales del tratamiento sobre el número real de partículas. Debido a la variación biológica bastante grande en ciertos grupos de animales, las mismas estimaciones se podrían haber obtenido con una precisión aceptable, a pesar de un menor gasto de esfuerzo. Las altas variaciones biológicas dentro de los gruposSer compensado aumentando el número de animales.
Se podría argumentar que el estándar de oro para obtener el número exacto de células implica el recuento exhaustivo de todos los objetos de interés. Sin embargo, en la mayoría de los estudios del cerebro esto no es una posibilidad debido al gran número de células. Aunque mucho más eficiente que el recuento exhaustivo de células, el fraccionador opcional es relativamente demorado en comparación con el simple cribado de diferencias en el número de células que se prefiere si el número exacto de células no es esencial. Es nuestra experiencia que las diferencias de más del 20-30% se pueden detectar puramente por procedimientos de selección.
Si se realiza correctamente, el muestreo utilizando estereología basada en diseño proporciona estimaciones imparciales y precisas de manera eficiente 1 . La propiedad imparcial de la estereología produce estimaciones que, cuando se replican, se aproximan a la media real de la población y mejoran la reproducibilidad de laEstimación 21 . Inicialmente, se debe obtener una muestra representativa de toda la estructura de interés (en este estudio, el hipocampo GCL / SGZ), permitiendo la estimación en un subconjunto estadísticamente válido de las secciones 4 . Para obtener un número apropiado de secciones y sondas de recuento aplicamos SURS, lo que reduce la varianza en comparación con el muestreo aleatorio 8 . Además, SURS asegura que las partículas de interés dentro de la estructura son muestreadas con las mismas probabilidades, independientemente de su tamaño, forma, orientación y distribución en la estructura. Como tal estereología es muy recomendable cuando la obtención de estimaciones precisas e imparciales es un aspecto central del proyecto.
Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Damos las gracias a Susanne Sørensen por la hábil asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Velux; La Fundación Jascha; Aase y la Fundación Ejnar Danielsens; Fundación Hermanos Hartmann; El director Jacob Madsen y la esposa Olga Madsens Foundation; El doctor Sofus Carl Emil Friis y la esposa Doris Friis 'Trust; La Fundación de 1870; Torben y la Fundación Alice Frimodts y la Fundación para la Investigación Neurológica. La edición de manuscritos fue realizada por Inglewood Biomedical Editing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 5'-bromo-2'deoxyuridine - BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
| Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
| Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
| dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
| Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
| Ethanol - 70 % | Plum A/S | 201098 | |
| Ethanol - 96 % | Plum A/S | 201104 | |
| Ethanol - 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
| Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
| H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
| HCl | J. T. Baker | 6081 | |
| Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
| Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
| PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
| PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
| Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
| Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
| Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
| Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
| Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
| Xylene | VWR | 28,973,363 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cover slips | Menzel-Gläser | 24x50 mm #0 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
| Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Microscope camera | Olympus | DP72 | |
| Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
| Motorized stage | Prior | H101A | |
| Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
| New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
| Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
| Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
| Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
| Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
| Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
| Slide rack | Sakura | 4465 | |
| Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
| Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
| Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |
References
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