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Neuroscience

Echtzeit-Iontophorese mit Tetramethylammonium zur Quantifizierung der Volumenfraktion und Tortuosität des Gehirns extrazellulären Raumes

Published: July 24, 2017 doi: 10.3791/55755
Automatic Translation
*1, *2,3, 4, 5, 5, 2
1Department of Medicine, University of Virginia, 2Department of Cell Biology, SUNY Downstate Medical Center, 3Neural and Behavioral Science Graduate Program, SUNY Downstate Medical Center, 4Division of Neonatology, University of Virginia, 5Department of Neuroscience and Physiology, New York University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Protokoll beschreibt Echtzeit-Iontophorese, eine Methode, die physikalische Parameter des extrazellulären Raumes (ECS) des lebenden Gehirns misst. Die Diffusion eines in das ECS freigesetzten Inertmoleküls wird zur Berechnung des ECS-Volumenanteils und der Tortuosität herangezogen. Es ist ideal für das Studium akuter reversibler Änderungen an Gehirn ECS.

Abstract

Diese Übersicht beschreibt die grundlegenden Konzepte und das Protokoll zur Durchführung der Echtzeit-Iontophorese (RTI) -Methode, die Gold-Standard, um den extrazellulären Raum (ECS) des lebenden Gehirns zu erforschen und zu quantifizieren. Die ECS umgibt alle Gehirnzellen und enthält sowohl interstitielle Flüssigkeit als auch extrazelluläre Matrix. Der Transport von vielen Substanzen, die für die Gehirnaktivität erforderlich sind, einschließlich Neurotransmitter, Hormone und Nährstoffe, erfolgt durch Diffusion durch die ECS. Änderungen des Volumens und der Geometrie dieses Raumes treten bei normalen Gehirnprozessen, wie Schlaf und pathologischen Zuständen, wie Ischämie, auf. Allerdings bleibt die Struktur und Regulierung des Gehirns ECS, vor allem in kranken Staaten, weitgehend unerforscht. Die RTI-Methode misst zwei physikalische Parameter des lebenden Gehirns: Volumenbruch und Tortuosität. Volumenanteil ist der Anteil des von ECS besetzten Gewebevolumens. Tortuosität ist ein Maß für die relative Hinderung, die eine Substanz beim Diffundieren durch ein Gehirn bekommtGion im Vergleich zu einem Medium ohne Hindernisse. In RTI wird ein inertes Molekül aus einer Quellenmikroelektrode in das Gehirn ECS gepulst. Da sich die Moleküle von dieser Quelle weg diffundieren, wird die sich ändernde Konzentration des Ions über die Zeit mit einer ionenselektiven Mikroelektrode gemessen, die etwa 100 μm entfernt ist. Aus der resultierenden Diffusionskurve können sowohl Volumenanteil als auch Tortuosität berechnet werden. Diese Technik wurde in Gehirnscheiben von mehreren Arten (einschließlich Menschen) und in vivo verwendet , um akute und chronische Veränderungen an ECS zu untersuchen. Im Gegensatz zu anderen Methoden kann RTI verwendet werden, um sowohl reversible als auch irreversible Änderungen des Gehirns ECS in Echtzeit zu untersuchen.

Introduction

Der extrazelluläre Raum (ECS) ist das Netzwerk von miteinander verbundenen Kanälen außerhalb aller Gehirnzellen und enthält sowohl interstitielle Flüssigkeit als auch extrazelluläre Matrix ( Abbildung 1a und Abbildung 1b ). Die Verteilung von vielen Substanzen, die für die Gehirnzellfunktion erforderlich sind, einschließlich Nährstoffe, Hormone und Neurotransmitter, erfolgt durch Diffusion durch die ECS. Änderungen der physikalischen Parameter dieses Raumes, einschließlich Volumen, Geometrie und extrazelluläre Matrix, können die Diffusion durch die ECS und die lokalen Ionenkonzentrationen, die Gehirnzellen, die einen tiefen Einfluss auf die Gehirnzellfunktion 1 , 2 haben, drastisch beeinflussen.

Die Echtzeit-Iontophorese (RTI) dient zur Bestimmung von zwei strukturellen Merkmalen einer Hirnregion: Volumenanteil und Tortuosität 3 , 4 ,"Xref"> 5 Der Volumenanteil ( α ) ist der Anteil des von der ECS ( V ECS ) besetzten Gewebevolumens bezogen auf das gesamte Gewebevolumen ( V- Gewebe ) in einem repräsentativen Elementarvolumen;

Gleichung

Tortuosität ( λ ) ist die relative Hinderung, dass eine Substanz beim Diffundieren durch eine Hirnregion im Vergleich zu einem Medium ohne Hindernisse begegnet;

Gleichung

Wobei D * (cm 2 s -1 ) der effektive Diffusionskoeffizient der Substanz im Gehirn ist und D (cm 2 s -1 ) der freie Diffusionskoeffizient der Substanz in einem freien Medium, wie verdünntes Agarosegel, ist.

Heute ist die am häufigsten verwendete Sondensubstanz für die RTI-Methode ist das kleine Kation Tetramethylammonium (TMA). TMA hat ein Molekulargewicht von 74 g / mol, vollständig dissoziiert in Lösung und hat eine positive Ladung. RTI-Studien mit diesem Ion haben gezeigt, dass α Gleichung 0,2 und λ Gleichung 1,6 1 , 2 . Das bedeutet, dass die ECS etwa 20% des gesamten Hirnvolumens beträgt und dass die Diffusion eines kleinen, inerten Moleküls im ECS etwa 2,5 mal langsamer ist als in einem Medium ohne Hindernisse 3 . Jedoch variieren sowohl α als auch λ mit Hirnalter, Region und Zustand und in pathologischen Zuständen 1 . Veränderungen dieser Parameter wurden mit der Entwicklung des Gehirns, Alterung, Schlaf, Epilepsie und vielen anderen grundlegenden Prozessen und Erkrankungen des Gehirns verbunden 1, 6 Während andere Techniken α und λ messen, kann RTI sowohl in lokalisierten Regionen des lebenden Gewebes in Echtzeit messen. Aus diesem Grund ist RTI zu einem unverzichtbaren Werkzeug geworden, um Veränderungen in α und λ bei akuten und reversiblen Herausforderungen zu untersuchen.

Die Theorie, die RTI unterstützt, wurde ursprünglich von Nicholson und Phillips validiert, und die Technik wurde seit dieser Zeit 4 , 7 ausführlich verwendet. Experimente, die RTI einsetzen, beginnen mit der Freisetzung eines Pulses von TMA aus einer Quellenmikroelektrode durch Iontophorese in ein verdünntes Agarosegel. Einmal ausgestoßen, diffundieren die Ionen frei von der Punktquelle und wählen aus einer potentiell unendlichen Anzahl von zufälligen Pfaden ( Abbildung 1d ). Die sich ändernde Konzentration des Ions wird über die Zeit unter Verwendung einer ionenselektiven Mikroelektrode (ISM) gemessen, die grob positioniert ist100 μm entfernt ( Abbildung 1c ). Die Änderungen der TMA-Konzentration werden aufgezeichnet und an eine Kurve angepasst, die die Berechnung von D und der Transportnummer der Iontophorese-Mikroelektrode erlaubt (Parameter, die im Protokoll diskutiert werden). Mit diesen Werten wird die Prozedur in einem interessierenden Hirnbereich wiederholt, um D * zu erhalten und sowohl α als auch λ zu berechnen. Die Steuerung der Iontophorese-Mikroelektrode, die Datenerfassung, die graphische Darstellung und die Anpassung der TMA-Konzentrationskurve und die Berechnung der experimentellen Parameter erfolgt in der Regel durch die Programme Wanda und Walter, die speziell für diesen Zweck konzipiert wurden (die Software und ihre Handbücher sind Frei von den Autoren auf Anfrage erhältlich).

Der Abschnitt "Protokoll" dieser Überprüfung beschreibt die grundlegenden Verfahren, die für die Konstruktion und Durchführung von RTI in Nagetierhirnscheiben erforderlich sind. Die Technik wurde auch in Nicht-Stab verwendetModelle, einschließlich menschliche Gehirnscheiben und in vivo Gehirnpräparate 1 , 4 , 6 , 8 , 9 . Der Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" bietet sowohl ideale als auch nicht ideale Ergebnisse, um Nuancen bei der Dateninterpretation hervorzuheben. Schließlich behandelt der Diskussionsteil kurz die Techniken zur Fehlerbehebung, die Beschränkungen von RTI, alternative Techniken, die zum Studium der ECS und zukünftige Anwendungen von RTI verwendet werden.

Abbildung 1
Abbildung 1: Diagramme der Diffusion durch ECS. ( A ) Diagramm der ECS: Zeigt die Größe und den Standort des ECS in einem typischen Gehirnteil an. Gelb markiert das ECS zwischen den grauen Gehirnzellenprozessen. Das Volumen des ECS beträgt etwa 20% des gesamten Gewebevolumens ( dh der Volumenanteil = 0.2) unter physiologischen Bedingungen. ( B ) Vergrößertes Diagramm des ECS: Highlights der physikalischen Parameter, die zur Tortuosität beitragen, einschließlich der Gehirnzellgeometrie (grau) und der extrazellulären Matrix (als Mesh von mehrfarbigen Glycosaminoglykanen und Proteoglykanen dargestellt). ( C ) 3D-Diagramm der Diffusion von einer Punktquelle: Demonstriert die Nettobewegung von inerten Molekülen von einer iontophoretischen Quelle zu einem ISM. Ohne Diffusionsbarrieren und zelluläre Aufnahme diffundieren Moleküle in alle Richtungen nach außen und erzeugen eine kugelförmige Konzentrationsfront. Das ISM quantifiziert die lokale Konzentration der aus der iontophoretischen Quelle freigesetzten inerten Moleküle. ( D ) Computersimulation der Diffusion in ECS des Gehirns: [Far left] Setup für Monte Carlo Simulation; Grüne Sphären stellen Gehirnzellenprozesse dar und das rote Kreuz stellt eine Punktquelle dar. Dieses Setup modelliert das in Abbildung 1a dargestellte Hirngewebe. [Mittlere Bilder] 3 und6 Moleküle, die zufällige Bewegungen durchführen, während sie durch den extrazellulären Raum des Gehirns diffundieren, in 2 Dimensionen gezeigt. [Weit rechts] Zufällige Spaziergänge von vielen Molekülen, die von der Punktquelle freigesetzt werden. Die Netzbewegung aller Moleküle von der Punktquelle ist nach außen, wie in Fig. 1c dargestellt, nach außen. Die kumulativen Zufallswege skizzieren die Räume zwischen den Zellen ( dh die ECS, siehe Referenz 5 für weitere Erläuterungen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Protocol

Alle Tierverfahren, die verwendet wurden, um Gewebeproben zu erhalten, wurden von der Tierethik-Komitee im SUNY Downstate Medical Center genehmigt.

1. Vorbereitung von Lösungen und Geräten

  1. Bereiten Sie eine 150 mM NaCl-Hinterfüllungslösung für den Referenztubus des ISM vor. Lagern Sie es in einer 10 ml Spritze, die an einem 0,22 μm Filter befestigt ist (um Bakterien oder Partikel zu entfernen).
  2. Vorbereiten einer 150 mM TMA-Chlorid (TMA-Cl) -Verfüllung für die Mikroelektroden. Lagern Sie es in einer 10 ml Spritze, die an einem 0,22 μm Filter befestigt ist. Bereiten Sie die TMA-Cl-Lösungen (in diesem Protokoll) von einer 5 M-Hersteller-Lagerlösung vor, um die korrekte Konzentration zu gewährleisten.
  3. Chloridieren Sie mindestens vier Silberdrähte für die Herstellung von Mikroelektroden, indem Sie die Drähte in Bleichmittel (Natriumhypochlorit) für mindestens 2 h eintauchen. Entfernen Sie überschüssiges Bleichmittel mit Ethanol und lassen Sie die Drähte trocknen.
  4. 50 ml 0,3% Agarose in 150 mM NaCl und 0,5 mM TMA-Cl in einem Becher zubereitenUnd decke es ab Verwenden Sie Agarose, die pulverisiert und relativ frisch ist, um gute Diffusionsmessungen zu gewährleisten.
  5. Die Agarose-Lösung mit einem Rührstab erhitzen und mischen, um sie aufzulösen. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen. Lagern Sie diese bei 4 ° C für bis zu 1 Woche.
  6. Eine gleichgültige (Grund-) Elektrode aus 4% Agarose in 1 M KCl (Richtungen in Ergänzung A)
  7. Füllen Sie eine kleine, poröse Tasse, die in die Versuchskammer passen kann und die eine elektrische Kontinuität zwischen ihrem Inhalt und der äußeren Umgebung ermöglicht ( Abbildung 2a ). Legen Sie einen Metallring auf die Unterseite dieses Bechers, um zu verhindern, dass er schwimmt, wenn er teilweise in Wasser eingetaucht ist.
  8. Verwenden Sie eine serielle Verdünnung eines 5 M TMA-Cl-Materials, um fünf 100 mL TMA-Cl-Lösungen für die Kalibrierung der ISMs herzustellen. Lösungen sollten Endkonzentrationen von 0,5, 1, 2, 4 und 8 mM TMA-Cl haben, alle in 150 mM NaCl. Bewahren Sie die Kalibrierlösungen in einer abdichtbaren Schale auf, um eine Verdunstung zu vermeiden/ Li>

2. Elektronisches Setup

  1. Verbinden Sie die Komponenten des RTI-Versuchsaufbaus gemäß dem Blockdiagramm in Abbildung 2b ; Einen Verstärker mit zwei Eingangskanälen (einer davon sollte sehr hochohmig für den ionenselektiven Fass des ISM sein), ein Tiefpassfilter auf 10 Hz, ein Schreiber, ein A / D + D / A Wandler, eine iontophoretische Einheit (oder ein Verstärker, der in der Lage ist, Konstantstromimpulse zu liefern) und einen Computer (PC), der die Wanda- und Walter-Programme ausführt. Überprüfen Sie das elektronische Setup, um zu bestätigen, dass alle Verbindungen vorhanden sind.
  2. Schützen Sie den Versuchsaufbau in einem geerdeten Gehäuse (wie zB einem Faraday-Käfig), wenn nötig, da ISMs einen hohen Widerstand haben und empfindlich auf Artefakte sind, die durch nahe gelegene Bewegungen entstehen.
  3. Erstellen Sie eine dedizierte ISM-Kalibrierstation, die aus einem Dual-Eingangsverstärker, einem Chartrekorder, einem entsprechenden ISM-Halter und einer gleichgültigen Masseelektrode besteht. Wenn möglich,Das Gehäuse abschirmen. Überspringen Sie diesen Schritt, wenn die ISMs im experimentellen Setup kalibriert sind (Schritt 3.29)

Figur 2
Abbildung 2: Poröser Experimental Cup und Electronic Setup. ( A ) Poröser Experimentierbecher: Ein poröses Mesh wird verwendet, um eine experimentelle Tasse zu schaffen, die eine elektrische Kontinuität zwischen der Agarose (innen) und der experimentellen Badeflüssigkeit (außen) ermöglicht. Ein Metallring ist an der Unterseite des Bechers angebracht, um zu verhindern, dass der Becher in der Badelösung schwimmt. ( B ) Blockschaltbild des RTI-Setups (Schritte 2.1 und 2.2): Ein ISM ist mit einem Verstärker (Amp.) Verbunden. Das ISM hat zwei Fässer. Einer enthält einen flüssigen Ionenaustauscher (LIX) in der Spitze und erzeugt eine Spannung, die proportional zum Logarithmus der TMA-Konzentration an der Spitze zusammen mit der lokalen Umgebungsspannung ist; ThE-Signalweg wird durch eine rote Linie dargestellt. Der andere Fass des ISM ist als Referenzlauf bekannt und misst die Umgebungsspannung an der Spitze des ISM; Es ist durch einen blauen Signalweg verbunden. Der Verstärker hat zwei sogenannte Kopfstufen, die mit dem ISM verbunden sind; Diese Einheiten haben eine Verstärkung von 1 (x1) und passen die hohe Impedanz der Mikroelektrode auf die niedrige Impedanz des Restes der Verstärkerschaltung an. Die mit dem ionenselektiven Fass verbundene Kopfstufe muss in der Lage sein, einen ankommenden Widerstand von etwa 1.000 MΩ anzupassen, während der Widerstand des Referenztubus typischerweise etwa 10 MΩ beträgt. Nach dem Verlassen der Kopfstufe wird die Spannung von dem Referenztubus invertiert und von der Spannung an dem ionenselektiven Tubus unter Verwendung eines Summierverstärkers (& Sgr;) subtrahiert, um die reine Ionensignalspannung zu erhalten. Die Ausgänge des Verstärkers gehen zu einer Signalaufbereitungseinheit über, die eine zusätzliche Verstärkung und ein Multipol-Tiefpaßfilter (≤ 10 Hz, typischerweise ein Bessel fiLter), die Rauschen beseitigt und das Signal-Aliasing am Analog-Digital-Wandler (A / D) verhindert. Die Ausgänge des Filters werden auch auf einem Streifenschreiber angezeigt. Der A / D-Wandler digitalisiert die Signale und sendet sie an einen Personal Computer (PC). Der PC erzeugt auch ein digitales Signal, das von einem Digital-Analog-Wandler (D / A) in einen analogen Spannungsimpuls umgewandelt wird, der der Iontophoreseeinheit zugeführt wird, der die Spannung in einen Stromimpuls konstanter Amplitude umwandelt und sendet Zur Iontophorese-Mikroelektrode. Der Ionophorese-Signalweg wird durch eine grüne Linie dargestellt. Die Datenerfassung und das Iontophorese-Signal stehen unter der Kontrolle des Wanda-Programms, das eine Ausgabedatei für jeden Diffusionsdatensatz in Form einer Spannungs-Zeit-Aufzeichnung erzeugt, zusammen mit allen Parametern, die das Experiment definieren. Ein zweites Programm, Walter, liest die Ausgabedatei und verwendet ISM-Kalibrierdaten, um die digitalisierten Spannungen in Konzentrationen umzuwandeln. Die Konzentration veRsus Zeitkurven werden dann in Walter auf die entsprechende Lösung der Diffusionsgleichung eingepasst. D und n t extrahiert werden, wenn das Medium Agarose ist und λ und α extrahiert werden, wenn das Medium Gehirn ist. Analoge Signale sind durchgezogene Linien; Digitalsignale sind gestrichelte Linien. Es gibt auch eine gleichgültige Masseelektrode (nicht gezeigt) in dem Bad, das die Scheibe enthält. Rote Linien = Ionensignal, blaue Linien = Referenzsignal, grüne Linien = Iontophoresebefehl, feste Linien = analog, gepunktete Linien = digital. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. Vorbereitung und Kalibrierung von Ionen-selektiven Mikroelektroden

  1. Fertige ISMs unter Verwendung des Protokolls unter einem Tag vor dem Experiment. Machen Sie ISMs in Chargen, um sicherzustellen, dass mindestens zwei Arbeiten am Tag des Experiments.
    HINWEIS: Die meisten ISMs sind für einen Tag stabilzwei. ISM-Herstellung ist empfindlich gegenüber Feuchtigkeit und atmosphärischen Bedingungen. Nicht jede Mikroelektrode wird erfolgreich kalibrieren.
  2. Spähen Sie etwa 0,5 cm Glas am Ende eines der Fässer einer doppelten Barosilikatglas-Kapillare mit einer alten Pinzette.
  3. Chip ein einziges Fass auf dem gegenüberliegenden Ende der Kapillare ( Abbildung 3a ). Sicherstellen, dass das Septum nicht beschädigt ist (kritisch). Achtung: Schutzbrille tragen, um Verletzungen durch Geschossglas zu vermeiden.
  4. Legen Sie die Kapillare in eine Flasche Aceton für mindestens 1 Stunde, um Verunreinigungen zu entfernen.
  5. Entfernen Sie die Kapillare aus dem Aceton und pulsieren Sie sauberes, trockenes, komprimiertes Stickstoffgas oder Luft durch, um überschüssiges Aceton zu entfernen. Entfernen Sie alle Aceton in der Kapillare, da restliches Aceton die Silanisierung beeinträchtigen kann (entscheidend).
  6. Fixieren Sie die Spitze der Mikropipette entweder auf einem vertikalen oder horizontalen Abzieher. Schneiden Sie die Parameter, um eine Pipette mit einer langen Kegel zu ziehen undScharfe Spitze, ca. 1 μm oder weniger im Durchmesser. Am Ende dieses Schrittes wird eine Kapillare zu zwei Pipetten gemacht ( Abbildung 3a ).
  7. Visualisieren Sie eine einzelne Mikropipette unter einem zusammengesetzten, aufrechten Mikroskop mit einem 10fachen Objektiv. Schneiden Sie die Spitze mit einem Glasmikroskop-Objektträger ab, so dass der Enddurchmesser der Spitze ( dh beide Fässer) zwischen 2 und 5 μm liegt ( Abbildung 3b ). Diese Pipette wird ab sofort als ISM bezeichnet.
  8. Füllen Sie den abgebrochenen Fass des ISM mit 150 mM NaCl Referenzlösung durch die Öffnung auf der abgebrochenen Seite mit einer 10 ml Spritze, die an einem 0,22 μm Filter und einer 28 G, 97 mm Nadel befestigt ist ( Abbildung 3b ). Füllen Sie den Fass nicht an drei Viertel der Höhe des Fasses.
  9. Füllen Sie den nicht abgebrochenen Fass des ISM mit 150 mM TMA-Cl-Backfill-Lösung. Tippen Sie auf die ISM vorsichtig, um Luftblasen aus der Lösung zu klopfen. Überprüfen Sie auf Blasen unter dem MikrofonRoskopie zum Absplittern der Spitze
  10. Flamme die Rückseite des ISM mit einem Bunsenbrenner, um sicherzustellen, dass keine Kommunikation der Backfill-Lösung über das Septum auf der Rückseite des ISM auftritt. Stellen Sie sicher, dass das obere Viertel des ISM nach dem Flammen trocken ist.
  11. Setzen Sie einen chloridisierten Silberdraht in die Referenzlösung des ISM ein und biegen Sie den aus der Kapillare herausragenden Draht, um dies als Referenztubus zu markieren ( Abbildung 3c ). Stellen Sie sicher, dass der Draht in die Hinterfüllungslösung getaucht ist und für die Dauer des Experiments in Lösung bleibt.
  12. Schieben Sie eine kurze Länge von Polytetrafluorethylenschlauch (ca. 20 cm lang) über die Spitze einer 25 G Spritzenadel. Legen Sie das andere Ende des Schlauches in die Rückseite des ionenselektiven Fasses. Stellen Sie sicher, dass sich der Schlauch im Fass befindet, aber über der Hinterfüllungslösung ( Abbildung 3c ).
  13. Einen Zitronenstab mit einem Bunsenbrenner erhitzen und sowohl den Schlauch als auch den Silv abdichtenEr in ihre jeweiligen Fässer verdrahten ( Abbildung 3c ). Sicherstellen, dass eine komplette Luftdichtung um den Kunststoffschlauch im ionenselektiven Fass (kritisch) hergestellt wird.
  14. Einen kleinen, transparenten Glasbehälter (5 ml oder weniger) von 4% Chlortrimethylsilan in Xylol vorbereiten. Achtung: Xylol und Silane sind sehr gesundheitsgefährdend; Behandeln Sie beide Chemikalien in einer Dunstabzugshaube und verwerfen Sie angemessen.
  15. Positionieren Sie den Behälter vor einem Stereodissektionsmikroskop, das horizontal in einer Abzugshaube montiert ist. Sichern Sie den ISM vertikal über dem Behälter mit einem Mikromanipulator ( Abbildung 3d ).
  16. Tauchen Sie die Spitze der Mikroelektrode in die Chlortrimethylsilanlösung ein.
  17. Bringen Sie eine leere 10-ml-Spritze an die 25-gauge-Nadel, die zum ISM führt. Einen positiven Luftdruck von der Spritze auftragen, bis eine Blase der TMA-Cl-Lösung gebildet wird; Dieser Schritt sollte unter direkter Visualisierung durch das Mikroskop durchgeführt werden.
  18. Tippen Sie den ISM-Halter vorsichtig an, um die Blase von der Spitze zu klopfen.
  19. Die Chlortrimethylsilanlösung auf eine Höhe von etwa 1.500 μm in die Spitze des ISM unter Verwendung eines Unterdrucks auf die 10 ml-Spritze ziehen.
  20. Die Chlortrimethylsilanlösung vollständig von der Spitze des ISM ausstoßen, bis eine Blase der TMA-Cl-Lösung an der Spitze entsteht ( Abbildung 3d ).
  21. Wiederholen Sie die Schritte 3.19 und 3.20 fünfmal. Stellen Sie sicher, dass jeweils eine gleichmäßige, ununterbrochene Flüssigkeitssäule in die Spitze gezogen wird. Wenn keine Lösung in die Spitze gezogen werden kann, überprüfen Sie, ob der Schlauch blockiert ist, die Luftdichtung unvollständig ist oder die Spitze des ISM blockiert ist.
  22. Die Chlortrimethylsilanlösung aus der Spitze spülen, bis eine Blase der TMA-Cl-Lösung entsteht.
  23. Unter Beibehaltung eines positiven Drucks auf die Spritze, entfernen Sie das ISM aus der Xylol-Lösung. Stellen Sie sicher, dass alle Xylol-Lösung aus der ISM-Spitze ausgestoßen wird, da überschüssiges Xylol den Ausstoß ruiniertAufhänger Spalte in nachfolgenden Schritten erstellt.
  24. Legen Sie die Spitze des ISM in einen kleinen, transparenten Behälter (entweder der eine der Wärmetauscher oder eine kleine Küvette), der den flüssigen Ionenaustauscher (LIX) für TMA hält. Führen Sie diesen Schritt unter direkter Visualisierung mit dem horizontalen Mikroskop-Setup durch.
  25. Tragen Sie einen kleinen Betrag des Unterdrucks auf, um eine minimale Menge des LIX in die Spitze zu ziehen ( dh, sobald LIX in die Spitze eintritt, stoppen Sie, Unterdruck anzuwenden).
  26. Trennen Sie die 10-ml-Spritze vom Schlauch und lassen Sie das ISM für 5 min sitzen. Während dieser Zeit wird der LIX in die silanisierte Spitze eintreten, bis er einen Gleichgewichtszustand erreicht.
  27. Entfernen Sie das ISM vom LIX. Ziehen Sie den Schlauch aus dem Wärmetauscherrohr heraus (während Sie so wenig Wachs wie möglich entfernen). Legen Sie einen chloridisierten Silberdraht in die kleine Öffnung, die am hinteren Ende des ISM entsteht. Den Draht in der Hinterfüllung des Wärmetauscherrohres mit geschmolzenem Wachs abdichten.
  28. Lassen Sie das ISM sitzenFür mindestens 30 min. Befestigen Sie die fertigen ISMs an den Innenrand eines Bechers mit einem biegsamen, vorübergehenden Kleber.
  29. Kalibrieren Sie das ISM, indem Sie die von der ISM gemessene Spannung in jeder Kalibrierlösung, die in Schritt 1.8 durchgeführt wurde, aufzeichnen.
    HINWEIS: Die Kalibrierung kann in einer Kalibrierstation durchgeführt werden (siehe Schritt 2.3) oder im Versuchsaufbau. Dieses Verfahren ist in der Ergänzung B und in Haack et al. 10 skizziert.
  30. Wenn die ISM-Kalibrierung für mehrere ISMs erfolgreich war, pausieren Sie hier bis zum Tag der bestimmungsgemäßen Verwendung. Wenn nicht, fabriziere mehr ISMs.
  31. Am Tag des Experiments die Mikroelektrode erneut kalibrieren (siehe Schritt 3.29).

Abbildung 3
Abbildung 3: Vorbereitung einer Ionen-selektiven Mikroelektrode. ( A ) ISM nach dem Absplittern der Kapillaren und Ziehen (Schritte 3.2-3.6): Ein einziges Fass an beiden Enden oFa-Glas-Kapillare ist abgebrochen. Ein ISM wird durch Ziehen einer doppelten Glaskapillare erzeugt, um zwei Mikropipetten mit feinen Spitzen zu erzeugen. ( B ) ISM nach dem Abfüllen der beiden Fässer (Schritte 3.7-3.9): Die Spitze eines einzelnen ISM wird auf einen Durchmesser von 2-5 μm abgebrochen. Der ionenselektive Fass wird mit TMA-Cl wieder gefüllt und der Referenztubus wird mit NaCl zurückgefüllt. ( C ) ISM vor dem Beschichten mit Chlortrimethylsilan (Schritte 3.11-3.13): Ein chlorierter Silberdraht wird in den Referenztubus eingeführt. Polytetrafluorethylen (PTFE) -Rohr ist mit einer 25 G-Nadel verbunden und in den ionenselektiven Fass eingesetzt. Eine luftdichte Abdichtung auf beiden Fässern wird mit Dentalwachs hergestellt. ( D ) Beschichtung einer Mikropipette mit Chlortrimethylsilan (Schritte 3.15-3.26): [Niedrige Vergrößerung] Ein in Chlortrimethylsilan suspendiertes ISM in Verbindung mit einem horizontal angebrachten Stereomikroskop. [Hohe Vergrößerung] Der Blick durch eine horizontal montierte StereomikroskopOpe einer ISM-Spitze in Chlortrimethylsilanlösung. Nach der Visualisierung der Spitze durch ein Mikroskop wird eine geringe Menge an TMA-Cl-Lösung aus dem ionenselektiven Fass ausgestoßen (genug, um eine kleine Blase der TMA-Cl-Lösung zu erzeugen). Der ISM-Halter wird abgegriffen, um eine TMA-Cl-Lösungsblase freizusetzen, und dann wird Chlortrimethylsilan in die Spitze gezogen. Dieser Zyklus wird mehrmals wiederholt. Nachdem das Chlortrimethylsilan aus dem ISM ausgestoßen worden ist, wird das ISM in den flüssigen Ionenaustauscher (LIX) für TMA gegeben und LIX wird in die Spitze des ionenselektiven Tubus gezogen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

4. Vorbereitung der Iontophorese Mikroelektroden

HINWEIS: Iontophorese-Mikroelektroden sollten am Tag des Experiments hergestellt werden.

  1. Ziehen Sie eine doppelte Barosilikatglas-Kapillare auf eine vertikale oder hoRizontaler Abzieher Schneiden Sie die Parameter, um eine Pipette ähnlich den in Schritt 3.6 gezogenen Mikropipetten zu ziehen ( Abbildung 4a ).
  2. Legen Sie die Mikropipette unter das in Schritt 3.7 verwendete Verbundmikroskop und schneiden Sie die Spitze mit einem Glasmikroskop-Objektträger ab, so dass der resultierende Durchmesser zwischen 2 und 5 μm liegt ( Abbildung 4a ).
  3. Füllen Sie beide Fässer mit der 150 mM TMA-Cl-Hinterfüllungslösung unter Verwendung einer 10 ml-Spritze, die an einem 0,22 μm-Filter und einer 28 G-, 97 mm-Nadel befestigt ist ( Abbildung 4a ).
  4. Tippen Sie vorsichtig auf die Mikropipette, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen in der Lösung der beiden Fässer verbleiben.
  5. Legen Sie chlorierte Silberdrähte in beide Fässer der Mikropipette. Stellen Sie sicher, dass die Drähte in den Hinterfüllungslösungen tief genug sind, damit sie für die Dauer des Experiments mit den Lösungen in Kontakt bleiben.
  6. Dichtung der Drähte in die Fässer mit heißem Dentalwachs. Vorsichtig verriegeln t Er drückt sich, indem er sie umeinander verdreht (abgeschlossene Mikroelektrode, die in Abbildung 4b gezeigt ist ).

Abbildung 4
Abbildung 4: Vorbereitung einer Iontophorese-Mikroelektrode. ( A ) Iontophorese-Mikroelektrode nach dem Nachfüllen der beiden Fässer (Schritte 4.1-4.3): Eine Iontophorese-Mikroelektrode wird aus einem Kapillarrohr gezogen. Die Spitze der Mikroelektrode wird auf einen Durchmesser von 2-5 μm abgebrochen. Beide Fässer der Iontophorese-Mikroelektrode werden mit TMA-Cl-Lösung gefüllt. ( B ) Abgeschlossene Iontophorese-Mikroelektrode (Schritte 4.5-4.6): Eine Iontophorese-Mikroelektrode mit zwei chlorierten Silberdrähten, die in die Fässer eingeführt wurden. Die Fässer der Mikroelektrode sind mit Wachs versiegelt, und die Silberdrähte sind an der Rückseite der Mikroelektrode zusammengedreht./files/ftp_upload/55755/55755fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

5. Vorbereitung von künstlichen Zerebrospinalflüssigkeits- und Nagetier-Gehirn-Tissue-Scheiben

  1. 1 l künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) mit einer für das Experiment geeigneten Zusammensetzung zugeben und 0,5 mM TMA-Cl dazugeben.
    HINWEIS: Der TMA-Cl ist notwendig, um während des Experiments eine Hintergrundkonzentration von TMA zu etablieren.
  2. Vorbereiten von Nagetierhirnscheiben mit einer Dicke von 400 μm gemäß den Standardprotokollen 11 , 12 . Verwenden Sie das in Schritt 5.1 vorbereitete ACSF für die Sezierung und Pflege von Hirnschnitten.

6. Echtzeit-Iontophorese in Agarose

  1. Schalten Sie den Computer mit den Walter- und Wanda-Programmen ein.
    HINWEIS: Diese Programme sind auf Anfrage frei verfügbar. Während diese Software ist nicht notwendig, Programmierung ähnlichSoftware oder die Durchführung der Analyse von Hand wäre ansonsten erforderlich.
  2. Führen Sie ACSF durch die Eintauchkammer mit einer geeigneten Rate ( zB 2 mL / min). Stellen Sie den Temperaturregler auf die gewünschte Temperatur und blasen Sie ACSF mit 95% O 2 /5% CO 2 (oder einem anderen geeigneten Gasgemisch) für die Dauer des Experiments.
  3. Montieren Sie eine gleichgültige (Erd-) Elektrode in einem geeigneten Halter und tauchen Sie die Spitze in den ACSF ein, der durch die Tauchkammer läuft. Verbinden Sie den Draht mit dem Boden des Aufzeichnungs-Setups.
  4. Füllen Sie den porösen Becher (hergestellt in Schritt 1.7) mit der zuvor hergestellten 0,3% Agarose und legen Sie ihn in die Eintauchkammer. Stellen Sie sicher, dass die Lösung nicht über die Oberseite des Bechers läuft.
  5. Sichern Sie ein kalibriertes ISM an den Pipettenhalter eines Mikromanipulators und eine Iontophorese-Mikroelektrode zum zweiten. Stellen Sie die Halterungen auf einen für den Aufbau geeigneten Winkel ein ( Abbildung 5a ).
  6. VerbindenDie ISM- und Iontophorese-Mikroelektrodendrähte zu ihren jeweiligen Kopfstufen des Aufzeichnungsverstärkers. Alternativ können Sie sich direkt an den Verstärker anschließen (abhängig vom Setup).
  7. Sicherstellen, dass das Gewicht / die Positionierung der Anschlussdrähte oder Clips keine Bewegung der Mikroelektroden verursacht, da kleine Schwankungen in der Positionierung die Ergebnisse beeinflussen können.
  8. Schalte das elektronische Setup ein (ab Schritt 2). Starten Sie Walter und Wanda in getrennten Fällen.
  9. Klicken Sie in der Wanda GUI auf "Calibrate" ( Abbildung 6a ). In der Kalibrierbox ( Abbildung 6b ) die bei der ISM-Kalibrierung gemessenen Spannungen ausfüllen (Schritt 3.29) und auf "Daten putzen" klicken.
    HINWEIS: Dies ermöglicht die Anpassung an die folgende Darstellung der Nicolsky-Gleichung (alternativ passen die Gleichung mit einem anderen Mittel, um M und K zu erhalten ):
    Gleichung
    Ihre, V die gemessene Spannung (mV) ist, M die Nicolsky Steigung (mV) ist, C die Konzentration des Ions (mM), K ist die Interferenz (mm), und V 0 die Offset - Spannung (mV) 3.
  10. Klicken Sie im Feld Kalibrieren auf "Akzeptieren", um automatisch die in Schritt 6.9 erzeugte Steilheit ( M ) und Interferenz ( K ) in die Haupt-GUI zu übertragen.
    HINWEIS: Hierbei steht K für die Na-Interferenz, was meist vernachlässigbar ist.
  11. Auf der linken Seite der GUI stellen Sie sicher, dass alle experimentellen Parameter in entsprechenden Einträgen gesetzt sind ( Abbildung 6a ).
    1. Legen Sie im Feld Quellmethode die Quelle auf die iontophoretische Quelle (Standard), die "Record Duration" auf "200 s" (Standard), die "Pulse Begin" auf "10 s" (Standard), das "Pulse End" Auf "60 s" (Voreinstellung), der "Bias Current" auf "20 nA" (Standard), der"Hauptstrom" auf "100 nA" (Standard) und den "Umrechnungsfaktor" auf einen entsprechenden Wert.
    2. In der Messelektrodenbox "Bad C" auf die Konzentration der in der Badlösung enthaltenen TMA (ausgedrückt in mM) einstellen. Setzen Sie den "Total Gain", "Output Channel", "ISM Channel" und "Ref. Channel" auf geeignete Werte für das verwendete Datenerfassungssystem.
      HINWEIS: Der "Conversion Factor" muss auf einen geeigneten Wert eingestellt sein (spezifisch für die verwendete iontophoretische Einheit). Dieser Wert gibt die Strommenge an, die für eine gegebene angelegte Spannung aus dem D / A-Wandler (nA / mV) bestanden wird.
  12. Legen Sie eine Temperatursonde in die Agar-Tasse. Notieren Sie die gemessene Temperatur im Eintrag "Temperatur" im Feld "Messelektrode" der GUI ( Abbildung 6a ).
  13. Schalten Sie die Unterstufenbeleuchtung ein. Falls erforderlich, schalten Sie die Kamera an das Mikrofon anRoscope und Kameramonitor.
  14. Senken Sie die Mikroelektroden mindestens 1000 μm tief in die Agarose und zentrieren Sie sie in die Tasse ( Abbildung 5b ). Visualisieren Sie sie unter dem Mikroskop mit einem 10fachen Objektiv (Wasser-Immersions-Objektiv mit einem langen Arbeitsabstand).
  15. Versetzen Sie die Spannung am Verstärker auf 0 mV für beide Referenz- und ISM-Kanäle, um die in der Agarose aufgezeichnete Spannung als Grundlinienspannung festzulegen.
  16. Auf dem Zweikanalverstärker manuell den ISM-Kanalstecker zum Spannungs-Subtraktionsausgang bewegen, um die Subtraktion 'on' zwischen den Referenz- und ISM-Kanälen einzustellen.
    HINWEIS: Die Subtraktion stellt sicher, dass die Spannungsänderungen im ISM-Kanal die Änderungen der TMA-Konzentration allein widerspiegeln.
  17. Bewegen Sie das ISM so, dass es die Spitze der Iontophorese-Mikroelektrode berührt. Zentrieren Sie die Spitzen aufeinander in allen drei Richtachsen.
  18. Zuerst die relativen Positionen beider Mikroelektroden auf derMikromanipulator-Steuerkästen. Stellen Sie sicher, dass die Mikroelektroden genau und präzise (kritisch) zentriert sind.
  19. Bewegen Sie den ISM 120 μm von der Iontophorese-Mikroelektrode in einer Achse (die linke rechte Achse, Abbildung 5b ). Geben Sie diesen Abstand in das Feld "Messelektrode" der GUI ein ( Abbildung 6a ).
  20. Starten Sie eine Aufnahme, indem Sie im GUI auf "Acquire" klicken ( Abbildung 6a ); Erlauben Sie dem Programm, eine vollständige Aufnahme aufzunehmen.
    HINWEIS: Die Iontophorese-Mikroelektrode erhält einen konstanten Vorstrom. Nach dem Klicken auf "Acquire" gibt es eine kurze Verzögerung, bevor der Hauptstrom für eine begrenzte Dauer angewendet wird.
  21. Wiederholen Sie Schritt 6.20 zwei bis drei weitere Male. Warten Sie, bis das TMA-Signal vor dem Erwerb neuer Datensätze zur Grundlinie zurückkehrt. Das Programm speichert jeden Datensatz für spätere Analyse.
  22. Überprüfen Sie den Abstand der beiden Mikroelektroden durch Verschieben der ISM-Rückseite tO die von der Steuerbox angegebene Nullstellung. Wenn die Mikroelektroden nicht mehr zentriert sind, zentrieren Sie sie wieder mit der gleichen Strategie wie in Schritt 6.17. Aufzeichnen von Änderungen in der Position der Elektroden.
    HINWEIS: Wenn sich der Abstand um mehr als etwa 2% ändert, können die in Schritt 6.19 erworbenen Aufzeichnungen nicht als richtig betrachtet werden und neue müssen genommen werden.

Abbildung 5
Abbildung 5: Einrichtung für Experimente in Agar. ( A ) Einrichten für das Experiment in verdünntem Agar (Schritte 6.1-6.5): Ein kleiner, poröser Behälter, der mit verdünntem Agar gefüllt ist, der in eine laufende Perfusionskammer gelegt wird. Eine Iontophorese-Mikroelektrode (linke Seite) und eine ISM (rechte Seite) werden von Mikroelektrodenhaltern gehalten; Mikroelektrodenhalter werden in die Arme von Roboter-Mikromanipulatoren eingepasst. Eine Temperatursonde wird in Agar-Gel gelegt, und eine gleichgültige Masseelektrode ist plInnerhalb der Unterwasserkammer. ( B ) Vergrößerte Ansicht von Mikroelektroden in Agar: Eine Ionentophorese-Mikroelektrode (linke Seite) und eine ISM (rechte Seite) werden in Agar unter Verwendung eines 10fachen Wassereintauchobjektivs (Ziel, das hier in 150 mM NaCl eingetaucht ist) sichtbar gemacht. Mikroelektroden werden mit Mikromanipulatoren bis zu einer Tiefe von 1.000 μm positioniert; Der Abstand zwischen den Mikroelektroden beträgt 120 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6
Abbildung 6: Wanda Computer Software Interface. ( A ) Navigieren von Wanda grafische Benutzeroberfläche (GUI): Der Bildschirm, der nach dem Öffnen der Wanda Software erscheint. In Kasten (1) werden das entsprechende Medium, das Iontophorese-Molekül und die Technik ausgewählt. (2) "Kalibrieren" wird angeklickt, um zu öffnenDie Wanda Kalibrierbox. Nach dem Kalibrieren des ISM (siehe Abbildung 6b und Supplement B) wird das ISM in Agar oder Gehirn positioniert, wie in den Schritten 6 und 8 des Protokolls beschrieben. In Feld (6) werden alle geeigneten Werte für das durchgeführte Experiment eingegeben. (7) "Acquire" wird angeklickt, um eine Aufnahme zu machen. Ein Diagramm der Spannung über der Zeit erscheint im oberen rechten Teil der Wanda GUI. ( B ) Kalibrieren von ISM in Wanda : Das Fenster, das nach dem Klicken auf (2) "Kalibrieren" in der Wanda GUI öffnet. Die Werte aus Schritt 3.29 werden in Feld (3) eingetragen und (4) "Anpassen von Daten" ausgewählt. Die Eichkurve wird als linear bezeichnet. (5) "Accept" wird angeklickt, um zur Wanda GUI zurückzukehren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

7. Agarose-Datenanalyse

  1. Öffne dasWalter Programm auf dem Computer (PC). Klicken Sie im Menü "0. Records From:" auf die Schaltfläche "Wanda / VOLTORO", um die von Wanda erzeugten Aufzeichnungen zu lesen ( Abbildung 7a ). Wenn Sie diese Ausgabe in eine Tabellenkalkulation eintragen möchten, öffnen Sie die entsprechende Software. Klicken Sie auf "Blatt 1,3" in der "1. Schreiben Excel?" Menü ( Abbildung 7b ).
  2. Wählen Sie im nächsten Popup-Fenster die zu lesenden Datensätze aus und klicken Sie auf "Öffnen" ( Abbildung 7b ); Beachten Sie, dass die Aufzeichnungen automatisch erfasst werden. Um die Anpassungsprozedur zu beginnen, führen Sie die folgenden Schritte aus.
    1. Klicken Sie im Menü "2. Optionen" auf die Schaltfläche "Select rec". Im Popup-Fenster " Bild 2 " mit der Maus das Fadenkreuz über den ersten zu verarbeitenden Datensatz verschieben ( Abbildung 7c ); Drücken Sie eine der beiden Maustasten, um den Datensatz auszuwählen.
    2. Klicken Sie auf oN "Fit Kurve" im Menü. Wählen Sie die gewünschte Anzahl von Iterationen aus. Verwenden Sie mindestens 20 Iterationen der Montage, um eine genaue Passung der Daten zu erhalten.
    3. Wählen Sie im Menü "alle", um alle Datenpunkte zu platzieren und wählen Sie "Weiter". Das Programm passt die angezeigte Kurve an. Beachten Sie die Montage und vergleichen Sie die experimentelle Aufzeichnung mit der besten angepassten Kurve erhalten.
  3. Wählen Sie die Option, um das Ergebnis in das entsprechende Tabellenkalkulationsprogramm zu schreiben, indem Sie im Menü "7. Ergebnisse" auf "Excel" klicken ( Abbildung 7d ). Beachten Sie die folgenden kritischen Daten, die zur Bestimmung der Funktionalität der Iontophorese-Mikroelektrode verwendet werden: ' D (E5) ', ' Referenz D (E5) ', ' r_app ', Transportnummer ' n t ', ' Scheinbar N t '.
    HINWEIS: " D (E5) ": Gemessene freie DiffusionskoeffizientenTx 10 5 (cm 2 / s); " Referenz D (E5) ": Theoretischer freier Diffusionskoeffizient x 10 5 (cm 2 / s). Dieser Wert wird aus einer Datenbank in Walter basierend auf dem Ion, dem Medium und dem Temperatureingang extrahiert. " R_app ": Scheinbarer Mikroelektrodenabstand (cm), berechnet auf der Grundlage der gemessenen und Referenz D (E5) . " N t ": Transportnummer (dimensionslos). Diese Zahl bestimmt den Bruchteil des Iontophorese-Stroms, der zur Freisetzung von TMA 4 verwendet wird . " Scheinbar n t ": Scheinbare Transportnummer (dimensionslos). Dies ist eine von r_app berechnete Transportnummer . Diese Zahl sollte in der Nähe der gemessenen n t liegen .
  4. Wiederholen Sie die Schritte 7.1-7.3 für jedes der Datensätze für ein ausgewähltes Paar von Mikroelektroden.
  5. Bestimmen Sie, ob die Iontophorese-Mikroelektrode verwendbar ist, indem Sie folgendes verwenden.
    1. Vergleiche " r_app" mit dem aktuellen r ( dh 120 μm); Dieses Kriterium ist erfüllt, wenn die Durchschnittswerte aus allen Prüfungen innerhalb von 4% liegen.
    2. Vergleiche " D (E5)" mit der Referenz D (E5) ; Dieses Kriterium ist erfüllt, wenn die Durchschnittswerte aus allen Prüfungen innerhalb von 8% liegen.
    3. Vergleichen Sie die " n t " zwischen Versuchen mit der gleichen Mikroelektrode; Dieses Kriterium ist erfüllt, wenn die Durchschnittswerte aller Prüfungen innerhalb von 10% liegen.
  6. Wenn eines der Kriterien aus Schritt 7.5 nicht erfüllt ist, beheben Sie die Iontophorese-Mikroelektrode oder beginnen Sie, eine andere zu testen.
  7. Wenn die Ionophorese-Mikroelektrode für das Experiment als geeignet erachtet wird, notieren Sie die durchschnittliche Transportnummer aus allen Versuchen im Feld "Transport Num N" im Wanda GUI ( Abbildung 6a ).

Jove_content "> Abbildung 7
Abbildung 7: Walter Computer Software Interface. ( A ) Auswahl des Datenerfassungsprogramms in Walter: Nach dem Start der Walter-Software öffnet sich das Menü "0. Records From:". Die Option zum Laden der von Wanda gespeicherten Datensätze wird durch Klicken auf die Schaltfläche "Wanda / Voltoro" ausgewählt. ( B ) Auswahl der Daten- und Datenanalyse Ausgabeort in Walter: [Links] Nach dem Öffnen des entsprechenden Tabellenkalkulationsprogramms wird "Blätter 1,3" gewählt, um alle Walter-Datenanalysen an das zuvor geöffnete Tabellenkalkulationsprogramm auszugeben. [Right] Nach dem Auswählen der Datenanalyse wird ein Popup-Fenster geöffnet, das es dem Benutzer ermöglicht, die ersten und letzten Aufnahmen von Walter zu lesen. ( C ) Auswahl der Aufnahme in Walter zu analysieren: [Rechts] Nachdem die zu lesenden Dateien ausgewählt sind, öffnet sich ein Popup-Fenster mit allen ausgewählten DatensätzenAls Grafik gespielt (" Abbildung 2 "). [Links] Im Menü "2.Options" wird "select rec" geklickt, und die Maus wird verwendet, um das Fadenkreuz zu bewegen, um die erste Aufzeichnung für die Analyse zu identifizieren. Es wird entweder die Maustaste gedrückt, um die Aufnahme zu wählen. ( D ) Export der Datenanalyse von Walter in eine Tabellenkalkulation: Nach dem Anpassen der Daten erscheint ein Popup-Fenster und das Menü "7. Ergebnisse". [Links] Grafik der gewählten Aufnahme (blau) mit der durch Walter (rot) erzeugten Diffusionskurve. [Rechts] Das Menü "7. Ergebnisse" ermöglicht es dem Benutzer, die Daten aus der Analyse in ein Tabellenkalkulationsprogramm zu schreiben, indem man auf die Schaltfläche "Excel" klickt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

8. Echtzeit-Iontophorese in Gehirnscheiben

  1. Lege ein 400 μm dickes Gehirn sLäuse in der Aufnahmekammer, um sicherzustellen, dass es vollständig in den fließenden ACSF untergetaucht ist. Positionieren Sie die Scheibe mit einem Aquarell-Pinsel und sichern Sie sie vorsichtig mit einem Raster.
  2. Bewegen Sie sowohl die Iontophorese-Mikroelektrode als auch die ISM über dem interessierenden Bereich auf der Gehirnscheibe. Tauchen Sie beide in die fließende ACSF, aber über die Scheibe.
  3. Versetzen Sie die Spannung sowohl für die Referenz- als auch die Ionen-Sensorkanäle auf "0" mV. Warten Sie, bis sich die Spannung in beiden Kanälen stabilisiert hat. Markieren Sie auf dem Kartenrekorder die auf dem Ionensensorkanal des ISM gemessene Spannung. Verwenden Sie diese Option, um den Grundlinien-V-Parameter in Wanda zu berechnen.
  4. Legen Sie die ISM- und Iontophorese-Mikroelektrode 200 μm tief in die Scheibe und 120 μm voneinander weg. Warten auf die Stabilisierung des Signals nach dem Bewegen der Mikroelektrode in die Gehirnscheibe.
    HINWEIS: Der Bias-Strom, der auf die Iontophorese-Mikroelektrode angewendet wird, bewirkt eine kleine Akkumulation von TMA. Es ist ein häufiger Fehler, ar zu nehmenEcording zu früh und unterschätzen den Signalaufbau.
  5. Auf dem Kartenrekorder markieren Sie die stabilisierte Spannung, die in der Hirnscheibe auf dem Ionenerkennungskanal des ISM gemessen wird. Berechnen Sie die Spannungsdifferenz zwischen dem in Schritt 8.3 und Schritt 8.4 gemessenen TMA-Signal und geben Sie diesen Wert in das Feld "Baseline V (mV)" in der Measuring Electrode Box der Wanda GUI ein ( Abbildung 6a ).
  6. Auf der linken Seite der GUI sicherstellen, dass alle experimentellen Parameter korrekt aufgezeichnet / eingegeben werden. Setzen Sie "Medium" auf "Gehirn", "Transportnummer" auf den Mittelwert, der für die Iontophorese-Mikroelektrode in Schritt 7.4 berechnet wurde, und "Temperatur" auf die Temperatur des Bades, das die Scheibe enthält.
    HINWEIS: V muss für jeden Satz von Messungen aufgezeichnet werden. Die Grundlinie V wird von Wanda in den Baseline- C (mM) -Parameter ( dh die Konzentration von TMA im Hirngewebe) umgewandelt.
  7. Starten Sie die Aufnahme, indem Sie auf "Acquire" klicken und es erlauben, eine vollständige Aufnahme zu machen. Warten Sie, bis das TMA-Signal vor dem Erwerb einer neuen Aufnahme zur Grundlinie zurückkehrt.
  8. Nehmen Sie zwei bis drei aufeinanderfolgende Aufnahmen, bevor Sie die Mikroelektroden aus dem gewählten Gehirnort entfernen. Geben Sie die Temperatur vor der Aufnahme sofort in die Wanda Software ein.
  9. Bewegen Sie beide Mikroelektroden diagonal zurück auf die Oberfläche der Scheibe. Heben Sie beide auf mindestens 50 μm über der Scheibe an. Mit dem Kartenrekorder legen Sie jede Änderung zwischen dem nun gemessenen V und seiner Messung aus Schritt 8.3 fest.
  10. Zentrieren Sie die Spitzen des ISM und die iontophoretischen Mikroelektroden relativ zueinander in den x-, y- und z-Achsen. Erhalten Sie Abstandsänderungen, falls vorhanden, aus der Anzeige der Mikromanipulator-Steuerbox.

9. Hirndatenanalyse

  1. Öffnen Sie eine neue Kalkulationstabelle für die Analyseausgabe.
  2. Wiederholen Sie die Schritte 7.1-7.4 in Walter, um zu analysierenDie Aufnahmen aus dem Gehirn.
  3. Schreiben Sie die Daten in das Tabellenkalkulationsprogramm, indem Sie im Walter-Menü auf "Excel" klicken. Aufzeichnen des α , Volumenanteils des Gehirns ECS; Λ , Tortuosität des Gehirns ECS; Und k (s -1 ), unspezifischer Abstand.

10. Transportnummer und ISM-Kalibrierung überprüfen

  1. Messen Sie die ISM-Transportnummer ( n t ) am Ende des Experiments mit dem untenstehenden Protokoll. Alternativ können Sie n t nach kritischen Studien oder bei Messungen anomal erscheinen. Allerdings kann die Überprüfung von n t zu viele Male zu Trauma auf die Gehirnscheibe führen.
  2. Neue Aufnahmen in Agarose aufnehmen. Siehe Schritte 6.4, 6.11, 6.12, 6.14, 6.15 und 6.17-6.22.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 7.1-7.4 in Walter, um die n t aus den neuen Agaroseaufnahmen zu erhalten. Überprüfe die Kalkulationstabelle: Wenn sich das n t um mehr verändert hatAls 10% aus dem vor der Gehirnmessung erhaltenen n t , sind die mit dieser iontophoretischen Mikroelektrode erhaltenen Daten nicht zuverlässig.
  4. Führen Sie eine neue Kalibrierung durch (siehe Schritt 3.29) für das ISM, nachdem alle Gehirndaten gesammelt wurden. Verwenden Sie neu eingegebene ISM-Kalibrierdaten als Eingabe in der Wanda Calibrate Box (siehe Schritte 6.9 und 6.10) und prüfen Sie, ob sich der Slope-Wert um weniger als 10% gegenüber der vorherigen Kalibrierung unterscheidet.
    HINWEIS: Die mit diesem ISM erhaltenen Daten sind nicht zuverlässig, wenn sich der Neigungswert um mehr als 10% gegenüber der vorherigen Kalibrierung unterscheidet.

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Representative Results

Der Nutzen der RTI-Technik wird in einem Experiment demonstriert, das entworfen ist, um die Änderungen in α und während einer hypoosmolaren Herausforderung zu messen ( Abbildung 8 und Abbildung 9 ). Es wurde bereits gezeigt, dass die Verringerung der Osmolarität des ECS durch Waschen auf hypotonischem ACSF eine Abnahme von & agr; und eine Erhöhung von & lgr; 13 bewirkt.

In diesem Experiment wurde RTI auf Rattenhirnscheiben unter den Kontrollbedingungen und während des Wash-ons des hypotonischen ACSF durchgeführt. Ein ISM wurde hergestellt, und seine Kalibrierungsparameter wurden in Wanda eingegeben, um die Nicolsky-Gleichung anzupassen, die eine Steigung ( M ) von 58,21 mV berechnete. Die ISM- und Iontophorese-Mikroelektroden wurden in Agar platziert und 120 μm voneinander getrennt, um den Transport nu zu messenMber Es wurden drei Aufnahmen aufgenommen und die Kurven wurden nach dem Verfahren in Schritt 6 des Protokolls angepasst und analysiert ( Abbildung 8a ). Die eingepasste Kurve jedes Versuches überlappte sich mit der Rohkurve ( Abbildung 8a ). Der gemessene Diffusionskoeffizient ( D x 1E5 ), die Transportnummer ( n t ) und die Differenz zwischen dem scheinbaren Abstand der Mikroelektroden ( r_app ) und ihrem tatsächlichen Abstand ( r ) unterscheiden sich nicht signifikant zwischen den drei Aufnahmen ( Abbildung 8b , Aufnahmen a1-3). Basierend auf diesen Kriterien wurde diese Iontophorese-Mikroelektrode als akzeptabel angesehen, um mit dem Experiment fortzufahren.

Sobald die stabile Iontophorese-Mikroelektrode gewählt wurde, wurden Kontrollwerte für α und λ in der Rattenhirnscheibe genommen, um eine Grundlinie für diese Parameter zu bilden. VorDass die Ratten-Neocortex α = 0,18-0,22 und λ = 1,54-1,65 1 betrug. Um diese Werte in diesem Experiment zu replizieren, wurden die ISM- und Iontophorese-Mikroelektrode 200 & mgr; m tief in den Rattenneocortex und 120 & mgr; m voneinander entfernt platziert. Die durchschnittliche n t, aus den Daten in 8b berechnet, wurde in das Wanda Programm zur Verwendung in den Berechnungen von α und λ eingegeben. Eine Verschiebung der Grundlinie V von der Platzierung der beiden Mikroelektroden von etwa 200 μm Tiefe im Gehirn wurde aufgezeichnet, und der Spannungssprung wurde in Wanda eingegeben, um die Grundlinie TMA ( dh die Baseline- C- Parameter) -Konzentration zu korrigieren. Drei Aufnahmen wurden aufgenommen, und ihre Kurven wurden angebracht ( Abbildung 9a , Abbildung 9d und Abbildung 9f ). Die Anfälle zeigten einen DurchschnittΑ = 0,192 und λ = 1,69 ( Fig. 9e ). Der Abstand und die Verschiebungen in der Grundlinie V wurden nach dem Aufnehmen der Aufzeichnungen überprüft und die korrigierten Werte wurden in Wanda eingegeben, um die Daten neu zu analysieren (wie in Schritt 8 des Protokolls beschrieben). Die neu berechneten Werte unterscheiden sich nicht signifikant, und die in Abbildung 9d angegebenen Werte wurden akzeptiert.

Die normale Osmolarität von ACSF beträgt 300 mOsm. Um die Wirkung von hypotonischem ACSF auf α und λ im Ratten-somatosensorischen Neocortex zu testen, wurde ACSF mit einer Osmolarität von 150 mOsm durch Reduktion der NaCl-Konzentration hergestellt. Es wurde vermutet, dass diese hypotonische ACSF zu einer Schwellung der Gehirnzellen führen würde, was zu einem niedrigeren α und einem potentiell höheren λ 13 führt . Die Hirnscheibe wurde mit dem hypotonischen ACSF für ca. 30 min superfundiertMit dem Gehirn äquilibrieren Während dieser Zeit blieben die Mikroelektroden an der gleichen Stelle im Neocortex, wie sie bei früheren Messungen der Kontrollbedingungen waren. Fünf Aufnahmen wurden unter hypotonischen Bedingungen aufgenommen ( Abbildung 9b und f ). Dies erzeugte einen Mittelwert α = 0,13 und λ = 1,84 ( Fig. 9e ). Diese Werte stimmten mit der Hypothese überein, dass die Hypoosmolarität α verringert und λ erhöht. Die Abstände und Änderungen der Baseline V wurden gemessen und bei der Analyse und Montage berücksichtigt.

Recovery-Parameter wurden auch durch Waschen auf regulärem ACSF (300 mOsm) gemessen und nehmen neue Aufnahmen an der gleichen Stelle im Neocortex. Da die Quellungseffekte reversibel sein sollten, wurde erwartet, dass sich α und λ auf Kontrollniveaus erholen würden. Die Werte avÜber vier Aufzeichnungen, die nach 30 min des regulären ACSF-Waschens aufgenommen wurden, wurden α = 0,37 und λ = 1,61 ( Abbildung 9c , Abbildung 9e und Abbildung 9f ). Dies zeigte, dass es bei der Erholung von α unter diesen Bedingungen ein unerwartetes Überschwingen gab ( Abbildung 9e und Abbildung 9f ). Danach wurden die Mikroelektroden zu Agar zurückgeführt, um zu bestätigen, dass die Transportnummer der Iontophorese-Mikroelektrode unverändert war ( Abbildung 8c ). Die ISM wurde dann neu kalibriert, und die neue Passform der Nicolsky-Gleichung zeigte, dass die Steigung 58,21 mV betrug.

Dieses Experiment ist ein klares Beispiel dafür, was RTI unter idealen Bedingungen aussieht. Die folgenden Elemente des Experiments waren der Schlüssel zum Erfolg. Zuerst wurden experimentelle Daten gesammeltAgarose und das Gehirn zeigten eine adäquate Überlappung mit den von Wanda erzeugten theoretischen Kurven ( Abbildung 8a und Abbildung 9a und Abbildung 9c ). Die Ähnlichkeit in Hang, Peak und Rückkehr zu einer ähnlichen Grundlinie sind alle wichtig bei der Bestimmung der Stärke des Spiels. Diese Abschnitte der Kurve sind bei der Aufzeichnung in Agarose häufig problematisch, und es ist üblich, daß mehrere Aufnahmen genommen werden müssen, bevor man die Bedingungen findet, die gut abgestimmte Kurven ( dh gute Mikroelektroden) erzeugen. Zweitens waren die durchschnittlichen Transportzahlen vor und nach dem Experiment innerhalb von 10% voneinander ( Abbildung 8b und Abbildung 8c ). Wenn dies nicht geschehen wäre, konnten die im Gehirn aufgezeichneten Werte nicht vertraut werden. Dies ist bei weitem das häufigste Problem, das bei RTI-Experimenten auftritt. Drittens sind die ISM-Kalibrierungen in standardisierten TMA-Lösungen vor und afDas Experiment abgestimmt (Daten nicht gezeigt). Typischerweise sind die Kalibrierungen eines funktionierenden ISM innerhalb von 10%, was dies zu einer ungewöhnlichen Quelle von Experimentversagen macht.

Abbildung 8
Abbildung 8: Ideale Kurvenanpassungsdaten in Agar vor und nach dem Experimentieren im Gehirn. ( A ) Repräsentative Daten aus einer Studie in Agar: [Weit links] Repräsentative Daten aus einer einzigen Studie, die in Agar erhalten wurde, die die Konzentrationskurve von TMA demonstriert. Vor den Diffusionsmessungen wurde ein konstanter Biasstrom von +20 nA durch die Iontophorese-Mikroelektrode aufgebracht. Zur Zeit = 10 s wurde TMA aus der Iontophorese-Mikroelektrode in den Agar gepulst, indem ein +60 nA-Hauptstrom für 50 s angelegt wurde. Eine Diffusionskurve wurde durch Messung von [TMA] über die Zeit unter Verwendung eines ISM, das 120 & mgr; m von der Quelle positioniert wurde, erzeugt. [Mitte] Eine eingepasste Kurve aus Daten p erhaltenIn Walter zerreißen [Richtig] Die Überlappung der Daten und die eingepasste Kurve zeigt, dass die von Walter durchgeführte Kurvenanpassung die Diffusion in dieser Studie genau modelliert. ( B ) Tabelle der Agar-Messungen vor dem Experimentieren im Gehirn: Daten, die aus drei Studien (a1, oben dargestellt) vor den hypotonischen Stress-Experimenten erhalten wurden ( Abbildung 9 ). Alle Studien wurden mit der Iontophorese-Mikroelektrode durchgeführt und ISM für die hypoosmotischen Stressversuche verwendet. Die Daten erfüllten die Kriterien, die erforderlich waren, um mit dem Experiment in Hirnschnitten fortzufahren. Diese Kriterien umfassen eine ausreichende Überschneidung zwischen den Daten und der angepassten Kurve (wie oben) und weniger als 10% Veränderung der Transportnummer. Zusätzliche Kriterien sind in Schritt 7.6 skizziert. ( C ) Tabelle der Agarmessungen nach dem Experimentieren im Gehirn: Daten, die aus drei Studien erhalten wurden, die in Agar nach den hypoosmotischen Stress-Experimenten durchgeführt wurden ( Abbildung 9 ). Das bestehen aus Ency, die zwischen den Versuchen a1-3 und a4-6 gezeigt wurde, deutet stark darauf hin, dass die ISM- und Iontophorese-Mikroelektroden während der Gehirnversuche stabil waren. Rec = Aufzeichnung oder Versuch; R = Abstand zwischen der ISM und der Iontophorese-Mikroelektrode; Cb = Grundlinienkonzentration; Ref D x1E5 = theoretischer freier Diffusionskoeffizient x 10 5 (cm 2 s -1 ) basierend auf einem vorberechneten Standard; N t = Transportnummer (dimensionslos); D (E5) = gemessener Diffusionskoeffizient x 10 5 (cm 2 s -1 ); R_app = scheinbarer Mikroelektrodenabstand (cm) bezogen auf die gemessene und Referenz D (E5); N t offensichtlich = scheinbare Transportnummer basierend auf r_app . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

"> Abbildung 9
Abbildung 9: Hypoosmotischer Stress verringert Alpha und erhöht Lambda
Ac. Repräsentative Daten aus Versuche im Gehirn unter ( a ) Kontrolle, ( b ) hypoosmotischen und ( c ) Wiederherstellungsbedingungen: Feste Linien repräsentieren Daten und gestrichelte schwarze Linien sind Kurven. Die drei Bedingungen zeigen deutlich unterschiedliche Diffusionskurven, einschließlich unterschiedlicher Pisten, Amplituden und Breiten. ( D ) Datentabelle aus Kontrollversuchen: Datentabelle von drei Kontrollversuchen (b1, oben dargestellt); Α und λ sind in allen Versuchen ähnlich und in Übereinstimmung mit den veröffentlichten Daten für den Ratten-Neocortex. Für alle Versuche im Gehirn wurde für das Gehirn n t die durchschnittliche n t aus Vor- und Nachexperiment-Agar-Messungen ( Abbildung 8b und 8c ) verwendet D ref wurde auf 1,25 × 10 -5 cm 2 s -1 eingestellt , basierend auf einer Datenbank von Diffusionskoeffizienten (in Walter), die im Rattenhirn bei T = 34,5 [° C] erhalten wurde. Der Parameter k ' [s -1 ] berücksichtigt die geringe Menge an TMA, die während der Diffusionsmessungen aus dem ECS verloren geht. Obwohl k ' typischerweise sehr klein ist, einschließlich des Parameters in der Kurvenanpassung, verbessert sich die Genauigkeit des RTI-Verfahrens. Der Verlustparameter k ' stellt wahrscheinlich die zelluläre Aufnahme oder den Verlust von TMA an den ACSF dar. ( E ) Vergleich der Kontroll-, Hypoosmotik- und Wiederherstellungsbedingungen: Mittelwerte aus allen Studien im Gehirn unter Kontrolle, hypoosmotischen und Wiederherstellungsbedingungen. Die Daten zeigen, dass die hypoosmotische Belastung α verringert und λ erhöht. Während einer Erholungsperiode nach hypoosmotischen Bedingungen überschreitet α die Grundlinie (Kontrolle), während λKehrt zur Grundlinie zurück. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Änderungen in ECS bei hypoosmotischen Herausforderungen teilweise reversibel sind. Die RTI-Methode eignet sich ideal zum Studieren dieser akuten reversiblen Wirkung. ( F ) Graph, der Daten-Clustering demonstriert: Der Volumenanteil (x-Achse) und die Tortuosität (y-Achse) aus jedem Versuch werden als ein einzelner Punkt aufgetragen. Der Graph zeigt die Gruppierung von Daten innerhalb jeder Gruppe ( dh Kontrolle, Hypoosmolar und Wiederherstellung), was darauf hindeutet, dass RTI die Empfindlichkeit hat, um die reproduzierbaren Effekte einer hypoosmolaren Herausforderung im Gehirn ECS zu erkennen. Rec = Aufzeichnung oder Versuch; R = Abstand zwischen ISM und Iontophorese Mikroelektrode; Cb = Grundlinienkonzentration; Alpha = Volumenbruch; Lambda = Tortuosität; K ' = unspezifischer Abstand der Sonde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ergänzende Dateien: Bitte klicken Sie hier, um die Dateien herunterzuladen.

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Discussion

Abbildung 10
Abbildung 10: Nicht-ideale Daten, die gemeinsame technische Probleme demonstrieren. ( A ) Diagramme allgemeiner technischer Fragen mit Iontophorese-Mikroelektroden: Vergleich der normalen Freisetzung von TMA aus einer funktionierenden Iontophorese-Mikroelektrode mit drei Quellen, die technische Probleme zeigen. [Hohe Vergrößerung, a1] Der Strom in einer idealen iontophoretischen Quelle wird gleichmäßig durch TMA-Freisetzung und Chloridaufnahme getragen. [Hohe Vergrößerung, a2] Eine Iontophorese-Mikroelektrode mit niedrigem n t gibt weniger TMA frei und nimmt mehr Chlorid als normal ein. [Hohe Vergrößerung, a3] Eine Ionentophorese-Mikroelektrode, die Elektroosmose zeigt, gibt TMA, Chlorid und Lösungsmittel frei. [Hohe Vergrößerung, a4] Eine Iontophorese-Mikroelektrode, die eine wachsende Freisetzung über die Zeit zeigt ( dh "Aufwärmen"). ( B ) Diagramm der nicht-idealen Daten oGeträgert in Agar: Die Daten sind nicht adäquat modelliert durch die Kurve von Walter gepasst und können daher nicht genau interpretiert werden; Die genaue Ursache der Diskrepanz ist unklar. ( C ) Tabelle der nicht-idealen Daten, die in Agar erhalten wurden: Normale oder erwartete Ergebnisse in Agar werden in der obersten Zeile (in Abbildung 8a dargestellt ) zum Vergleich mit den nicht-idealen Daten in der zweiten Zeile (in Abbildung 10b ) dargestellt dargestellt. Die schlechte Überlappung zwischen den Daten und der angepassten Kurve in Fig. 10b bedeutet, daß die eingepasste Kurve die Diffusionsdaten nicht genau modelliert; Daher können die berechneten Werte (markiert mit *) nicht interpretiert werden. Dies könnte durch Probleme mit der Iontophorese-Mikroelektrode ( zB Aufwärmen) oder dem ISM ( zB langsame Reaktion) verursacht worden sein. Fehlersuche: Austausch von Mikroelektroden einzeln, beginnend mit der Iontophorese-Mikroelektrode. Rec = Aufzeichnung oder Versuch; R= Abstand zwischen ISM und Iontophorese Mikroelektrode; Cb = Grundlinienkonzentration; Ref D x1E5 = theoretischer freier Diffusionskoeffizient x 10 5 (cm 2 s -1 ) basierend auf einem vorberechneten Standard; N t = Transportnummer (dimensionslos); D (E5) = gemessener Diffusionskoeffizient x 10 5 (cm 2 s -1 ); R_app = scheinbarer Mikroelektrodenabstand (cm) bezogen auf die gemessene und Referenz D (E5); N t offensichtlich = scheinbare Transportnummer basierend auf r_app . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Während das in Abbildung 8 und Abbildung 9 dargestellte Experiment eine stabile und arbeitende Iontophorese-Mikroelektrode und ISM hatte, gibt es viele Experimente, bei denen entweder oder boDie Mikroelektroden sind kompromittiert und liefern keine idealen Ergebnisse. Eine „normale“ TMA Iontophorese Mikroelektrode hat einen Wert von n t Gleichung 0,3 Abbildung 10a zeigt drei häufige Probleme mit der Iontophorese-Mikroelektrode, die bei RTI-Experimenten auftreten kann.

Niedrige Freisetzung Die Iontophorese-Mikroelektrode gibt sehr wenig TMA frei, wenn Biasstrom oder Hauptstrom angelegt wird, was zu n t <0,1 führt. Strom ist immer noch durch die Spitze, aber die meisten davon wird von der Cl-Anion in die Spitze und sehr wenig durch die TMA Kation verlassen die Spitze getragen. Wenn n t in mehreren aufeinanderfolgenden Versuchen stabil ist, können diese Iontophorese-Mikroelektroden verwendet werden. Dies wird jedoch nicht empfohlen, da sie nicht optimal funktionieren, was bedeutet, dass sich weitere Fragen entwickeln können. Ein noch größeres extremTritt auf, wenn die Spitze der iontophoretischen Mikroelektrode blockiert ist und keine Ionen verlassen oder in die Spitze gelangen. In diesem Fall wird keine Kurve erzeugt. In solchen Fällen sollte nach der Überprüfung, dass alle elektrischen Verbindungen ordnungsgemäß und sicher sind, die Iontophorese-Mikroelektrode verworfen werden.

Hohe Freisetzung (Elektroosmose). Zusätzlich zu TMA gibt die Iontophorese-Mikroelektrode auch Wasser ab, was zu n t > 0,5 führt. Wenn die n t über mehrere Versuche stabil ist, können diese Iontophorese-Mikroelektroden verwendet werden, aber dies wird nicht empfohlen, da sich weitere Fragen entwickeln können. Der einzige Schritt zur Fehlerbehebung ist, den Hauptstrom zu reduzieren. Dies beseitigt manchmal die Wasserfreisetzung und bewirkt, dass das n t unter 0,5 sinkt.

Wachsende Freisetzung ("Aufwärmen"). In diesem Fall steigt die TMA-Freigabe im Laufe der Zeit. Wenn das "Aufwärmen" schnell ist,Die Diffusionskurve hat eine Form ähnlich der in Fig. 10b gezeigten, und sie kann nicht zuverlässig angebracht werden. In diesem Fall zeigt die Diffusionskurve einen langsamen Anstieg der TMA-Konzentration während der Anfangsphase des Hauptstroms, und die TMA-Konzentration ist kein Plateau. Eine unzuverlässige Passung erzeugt ein ungenaues gemessenes D , das die Konsistenz der gemessenen Transportnummer und der r_app- Werte beeinflusst. Wenn das "Aufwärmen" allmählicher ist, hat es keinen signifikanten Einfluss auf die Form der einzelnen Diffusionskurven, aber es manifestiert sich in einem n t , das über aufeinanderfolgende Versuche zunimmt. Ein "Aufwärmen" -Zustand kann manchmal durch "Pulsieren" der Iontophorese-Mikroelektrode für einen Zeitraum (etwa 30 min) behoben werden. Dies geschieht durch Wechsel zwischen einem Biasstrom und einem hohen Hauptstrom (+200 nA) für einige Sekunden zu einem Zeitpunkt. Wenn eine Iontophorese-Mikroelektrode noch kein stabiles gibtEs ist am besten, einfach nur eine neue zu testen.

Die genaue Messung der Transportnummer und der Stabilität während des gesamten Experiments ist von wesentlicher Bedeutung, um einen genauen Wert für α zu gewährleisten. Die Aufrechterhaltung des Abstandes zwischen Mikroelektroden ist entscheidend für die Bestimmung von sowohl α als auch λ . Wenn sich der Abstand nach einer Messung entweder in Agarose oder im Gehirn ändert, kann der geradlinige Abstand zwischen den Spitzen der Mikroelektroden in die Ausgabekalkulation eingegeben und von Walter neu analysiert werden. Wenn sich die Werte zu stark unterscheiden, muss die Messung verworfen werden. Temperaturschwankungen können auch ein Faktor für die Ungenauigkeit sein, so dass eine genaue Temperatursonde und ein zuverlässiges Kammer-Heizelement wichtig ist.

Die Iontophorese-Mikroelektrode ist die häufigste Problemquelle in der RTI-Technik; Machen und mit einem stabilen ISM ist entscheidend für die Erlangung guter Daten. OEin mögliches Problem mit dem ISM kann eine träge Reaktion sein, die durch sehr hohe Impedanz in der Spitze verursacht werden kann. Bei einem langsam reagierenden ISM scheinen alle Ionophorese-Mikroelektroden einen "Aufwärm" -Effekt zu haben ( Abbildung 10b ), aber die Kurve wird einfach durch die Unfähigkeit des ISM verursacht, die sich ändernden TMA-Konzentrationen schnell genug zu erkennen. Die Erhöhung des Abstandes zwischen den Mikroelektroden (bis zu 150 μm) kann mehr Zeit für das ISM ermöglichen, zu reagieren und die Kurvenanpassung zu verbessern. Eine träge Reaktion kann darauf hindeuten, dass sich der Ionenaustauscher innerhalb der Spitze zurückgezogen hat. Dies ist unter einem zusammengesetzten Mikroskop zu sehen und, falls vorhanden, bedeutet die Silanisierung schlecht und das ISM muss verworfen werden. Darüber hinaus können Drifts im ISM-Signal zu ungenauen Anpassungen der Daten führen. Es liegt an dem Experimentator, festzustellen, ob die Drift die Daten über die Toleranz hinaus beeinflusst.

Einschränkungen von RTI

THier sind einige Einschränkungen für die RTI-Methode aufgrund von Annahmen, die der Datenanalyse zugrunde liegen. Diese Annahmen beinhalten eine Anforderung an die Gewebehomogenität und die Gewebeisotropie sowohl im interessierenden Gehirnbereich als auch in einem sphärischen Volumen, das diesen Bereich umgibt. Im Rahmen von RTI erfordert die Gewebehomogenität, dass die Diffusionsparameter innerhalb des interessierenden Bereichs konstant sind. Gewebeisotropie bedeutet, dass ein einziger Wert von D * für alle drei Raumachsen gilt. Jedes Molekül, das von einer Quellenmikroelektrode freigesetzt wird, nimmt einen zufälligen Pfad ein, bevor er an der Position des Aufzeichnungs-ISM ankommt. Die Spannung auf dem ISM, die die Anzahl der zu einem einzigen Zeitpunkt aufgezeichneten Moleküle ( dh Konzentration) darstellt, schließt Moleküle ein, die in allen drei Raumachsen gereist sind, sowie einige Moleküle, die über das ISM hinausgekommen sind und zur Messung zurückgekehrt sind Punkt ( Abbildung 1c ). Während der RTI-Datenanalyse generiert das Walter-ProgrammAts Durchschnitt α und λ , die die Diffusion aller Moleküle einschließen, die sich in allen Achsen von einer Punktquelle zum ISM bewegen. Wenn die Diffusionsrate in einer der drei räumlichen Achsen (Anisotropie) signifikant unterschiedlich ist oder wenn das Gewebe nicht homogen ist, sind zusätzliche Datenerfassung und Datenanalyse erforderlich, um α und λ 8 , 14 zu berechnen.

Zusätzlich zu den obigen Gewebevoraussetzungen erfordert das RTI-Verfahren, dass der Abstand zwischen einer Punktquelle und ISM, der als r bezeichnet wird, etwa 80 - 130 μm beträgt. Wenn r unter 50 μm abnimmt, kann die ISM-Antwort nicht schnell genug sein, um diffusionsabhängige Änderungen der Konzentration des Sondenmoleküls aufzuzeichnen. Dies könnte in Zukunft mit konzentrischen ISMs mit schnelleren Reaktionszeiten 10 , 15 behoben werden. Größere rEntfernungen minimieren auch Hirnregion-unabhängige Unterschiede im ECS-Milieu, ISM-Spitzengröße und Hirngewebeschäden während der ISM-Platzierung. Umgekehrt, wenn r über 150 μm hinaus erhöht wird, ist die Diffusion von Molekülen aus der iontophoretischen Punktquelle anfälliger für den Einfluss durch nicht-isotrope, inhomogene Elemente, die den interessierenden Gehirnbereich oder die Gewebeperfusatgrenze 14 umgeben .

Einbindung von RTI und alternativen Techniken zur Erforschung von ECS

Die RTI-Methode gehört zu einer größeren Gruppe von Techniken, die eine molekulare Sonde verwenden, um die ECS zu studieren; Jede Methode hat ihre eigenen Vorteile und Unzulänglichkeiten. Während RTI eine genaue Berechnung von sowohl α als auch λ in Echtzeit ermöglicht, erfordert das Verfahren eine geladene molekulare Sonde, die von einem Ionenaustauscher detektiert werden kann. In Experimenten, bei denen Iontophorese nicht geeignet ist, wie das Studium einer ungeladenen Sonde, iDie Ontophorese kann durch Druckauswurf ersetzt werden. Unglücklicherweise erlauben gegenwärtige Techniken die Berechnung von α mit Druckausstoß nicht, da das freigesetzte Volumen von den Eigenschaften des eingespritzten Mediums 16 abhängt. Um eine Sonde zu verwenden, für die kein Austauscher existiert, kann die Sonde fluoreszenzmarkiert sein und ihre Diffusion durch ECS, gemessen durch Epifluoreszenzmikroskopie. Diese Technik, die als integrative optische Bildgebung (IOI) bekannt ist, ist durch die Größe und Verfügbarkeit von fluoreszenzmarkierten Molekülen und das Potential für die zelluläre Aufnahme 17 , 18 begrenzt . Die IOI-Technik hat den Vorteil, dass Makromoleküle als Sonden verwendet werden können, und dies hat ergeben, dass λ mit der Molekülgröße zunimmt. Schließlich hat eine wichtige Klasse von Diffusionsmethoden Radiotracer eingesetzt, aber sie sind nicht mehr gemeinsam 2 .

Zukünftige Anwendungen von RTI

in vivo zuverlässig zu implementieren und ihr Potential 1 , 4 , 6 zu erweitern . Es kann auch verwendet werden, um die Auswirkungen einer Vielzahl von Veränderungen in der Gehirnphysiologie zu testen, wie jene, die durch Veränderungen in der chemischen Umgebung, Pharmakologie, Trauma oder genetischem Knockout induziert werden 1 . Solange die im ECS induzierte Veränderung für einen Zeitraum von etwa 2 min oder mehr andauert, kann RTI eine genaue Quantifizierung des ECS-Volumenanteils und der Tortuosität liefern.

Während in den letzten 50 Jahren bedeutende Einblicke in die Struktur und Funktion des Gehirns ECS generiert wurdenBleiben viele unbeantwortete Fragen. Zum Beispiel ist es noch unklar, ob und wie homöostatische Mechanismen α und wie sich die Veränderungen in der α- Hirnfunktion beeinträchtigen. Computermodelle haben dazu beigetragen, die relativen Beiträge der Zellgeometrie und andere Faktoren, die λ beeinflussen, abzuschätzen, aber es wird mehr Arbeit benötigt 1 . Schließlich ist die Rolle des ECS bei der Pathogenese der neurologischen Erkrankung (und umgekehrt) weitgehend unerforscht. In naher Zukunft könnten RTI-Messungen die gezielte Arzneimittelabgabe an spezifische Hirnregionen verbessern 19 .

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Die Arbeit wurde von NIH NINDS bewilligt R01 NS047557 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A/D and D/A converter National Instruments Corporation NI USB-6221 DAQ The NI USB-6221 is still sold as a 'Legacy' device by NI. They recommend using NI USB-6341 X Series DAQs for new installations, however we have not tested the newer units. We describe the use of the NI USB-6221 with MATLAB and Windows 7 (32-bit). Alternatives: the much older PCI-MIO-16E-4 A/D converter (Used under Windows XP or older OS only) with BNC-2090 BNC connector panel and SH68-68-EP cable. As noted in the Wanda Manual, an experimental MATLAB program to use Axon Binary Files is available.
agarose Lonza NuSieve GTG Agarose #50081 to prepare dilute agarose gel for RTI measurements
amplifier for ISM Dagan Model IX2-700 Dual Intracellular Preamplifier ion and reference voltage amplifier with N=0.1 (for reference barrel) and N=0.001 (for ion barrel) headstages
biological compound miscroscope (with 4x and 10x objective) for chipping the microelectrode tips and inspecting microelectrodes; various suppliers, e.g. AmScope
borosilicate theta capillary glass tubing Harvard Apparatus Warner Instruments model TG200-4; order #64-0811 double-barreled glass tubing for ion-selective microelectrodes and iontophoretic microelectrodes; O.D. 2.0 mm, I.D. 1.4 mm, septum 0.2 mm, length 10 cm
brush Winsor & Newton University Series 233, size 0 round shoft handle brush, available from Amazon
bunsen burner Fisher
camera for visualizing micropipettes Olympus OLY-150 requires monitor, IR filter on substage illuminator is optional
chart recorder to record continuously voltages on ion-selective microelectrode during calibration in tetramethylammonium standards and during RTI experiment; e.g. Kipp & Zonen type BD112 dual-cannel chart recorded, available refurbished
chlorotrimethylsilane, puriss., > 99% Sigma-Aldrich catalog # 92360 for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, reacts violently with water, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description
Commercial Software The MathWorks MATLAB, Data acquisition toolbox for data acquisition and analysis using Wanda and Walter programs. Note that an academic license is available.
eye protective goggles Fisher
fixed-stage compound microscope Olympus BX51WI can use other compound microscopes with fixed stages
forceps Fine Science Tools #11251-10 to chip glass capillary; Dumond #5, preferably used and no longer needed for fine work
fume hood for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; various supliers, e.g. Captair with approriate filter sold by Erlab
glass microscope slide Fisher #12-550A to chip microelectrode tips
heater/stirrer Fisher Corning PC-420D to prepare dilute agarose gel and stir solutions
iontophoretic unit Dagan ION-100 and PS-100 ION-100 is a single channel iontophoresis unit +/- 130 V compliance; PS-100 is an external power supply; alternatives: e.g. Axoprobe-1A made by Axon Instruments (now Molecular Devices), out of production, check for availability of refurbished units (eBay and other sites)
liquid ion exchanger (LIX) for tetramethylammonium World Precision Instruments IE190 Potassium Ion Exchanger Note: this is equivalent to the original Corning potassium exchanger 477317 based on tetraphenlyborate - do not confuse with neutral carrier potassium exchanger originating from the laboartory of Dr. Simon, ETH, Zurich, which does not sense tetramethylammonium, and is sold by Fluka. You can also make liquid ion exchanger for tetramethylammonium yourself: 3% by weight potassium tetrakis = (p-chlorophenyl) borate dissolved in 2,3-dimethylnitrobenzene. Buy chemicals from Fluka (now part of Sigma). See Oehme and Simon (1976) Anal. Chim. Acta 86: 21-25; CAUTION: The toxicological properties of this liquid ion exchanger have not been fully determined. Ingestion or contact with the human body may be harmful. Exercise due care! Liquid ion exchangers should be stored in a cool place out of direct sunlight.
microelectrode holder WPI M3301EH to hold ion-selective microeletrode prefabricate for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; WPI sells two versions of this holder, clear M3301EH and black M3301EH. In our experience, the clear M3301EH appears to be sturdier then the black M3301EH.
micromanipulator Narishige MM-3 to position ion-selective microelectrode prefabricate during silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; can be substituted with any three-axis micromanipulator in good working condition
micropipette puller Sutter Instruments Model P-97 to pull double-barreled glass tubing; other pullers can be used as long as they can accommodate large diameter double-barreled glass tubing
microprobe thermometer Physiotemp Model BAT-12R fine probe of this thermometer is placed close to recording site
needle BD Syringes and Needles # 305122 (25 gauge) for silanization; BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in (0.5 mm x 16 mm)
objective 5X dry Olympus MPlan N
objective 10X water immersion Olympus UMPlan FL N 10X objective is water immersion, numerical aperture is 0.3, working distance is 3.3 mm
plastic containers (with lids) Fisher #14-375-148 to store tetramethylammonium standard solutions and microelectrodes
platform and x-y translation stage for fixed-stage microscope EXFO Gibraltar Burleigh platform holds slice chamber, micromanipulators and accesorries, x-y translational stage moves microscope without compromising recording stability
porous minicup for RTI measurements in a dilute agarose gel; homemade
reusable adhesive Bostik Blu-Tack for securing microelectrodes to holding vessel and other uses; various suppliers, available from Amazon
robotic micromanipulator with precise x,y,z positioning Sutter Instruments MP-285 two mircomanipulators are needed to hold separately ion-selective microelectrode and iontophoretic microelectrode. Also possible to glue micropipettes in a spaced array (see text).
signal conditioning unit with low-pass filter Axon Instruments CyberAmp 320 or 380 no longer available from the manufacturer but may be available from E-Bay; alternatives: e.g. FLA-01 Filter/Amplifier from Cygnus Technology. This is a single channel instrument with a minimum cutoff at 10 Hz using a multipole Bessel filter but the company may be willing to modify it for a lower cutoff frequency (2 Hz) if needed.
silver wire A-M Systems #7830 diameter 0.015", bare (no coating)
slice chamber Harvard Apparatus Warner Model RC-27L this is submersion slice chamber; do not use interface slice chamber
stereomicroscope for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; horizontally mounted; various suppliers
syringe, 10 mL BD Syringes and Needles #309604 to backfill microelectrodes and for silanization; BD Luer-Lok tip
syringe filter 0.22 µm pore Whatman #6780-1302 to filter backfill solutions; available from Fisher
syringe needle, 28 gauge, 97mm World Precision Instruments MicroFil MF28G-5 to backfill microelectrodes
Teflon (=PTFE) tubing Component Supply STT-28 PTFE tube light wall (28 gauge) for silanization of ion-selective barrel; fits on BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in. Note: Teflon is essential, PVC tubing would melt by hot wax.
temperature control system Harvard Apparatus Warner Models TC-344B and SH-27A TC-344B is a dual automatic temperature controller, SH-27A is an in-line heater; controller and heater work with Warner slice chambers
tetramethyammonium (TMA) chloride Sigma-Aldrich T-3411 5 M solution; CAUTION: acute toxicity (oral, dermal, inhalation), carcinogenicity, hazardous to the aquatic environment, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description
vibrating blade microtome Leica VT1000S to cut brain slices
xylenes Fisher X5-1 for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, carcinogenicity, see Fisher Safety Information for full description

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References

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Neurowissenschaften Ausgabe 125 Gehirn Diffusion extrazellulärer Raum Echtzeit-Iontophorese ionenselektive Mikroelektroden Tortuosität Volumenbruch
Echtzeit-Iontophorese mit Tetramethylammonium zur Quantifizierung der Volumenfraktion und Tortuosität des Gehirns extrazellulären Raumes
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Odackal, J., Colbourn, R., Odackal,… More

Odackal, J., Colbourn, R., Odackal, N. J., Tao, L., Nicholson, C., Hrabetova, S. Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space. J. Vis. Exp. (125), e55755, doi:10.3791/55755 (2017).

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