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방법 논문

성인 쥐의 Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) 벡터 전달

17.2K 조회수

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DOI:

10.3791/55770

⸱

2017년 7월 13일

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1Neuroregeneration Laboratory, Department of Anesthesiology, University of California, San Diego, 2Institute of Animal Physiology and Genetics, Czech Academy of Sciences, 3Department of Neurosurgery, University of California, San Diego, 4Institute of Neurobiology, Slovak Academy of Sciences

이 논문에서

요약

본 연구의 목적은 성인 생쥐에서 새로운 subpial 유전자 전달 기술을 사용하여 척수 adeno-associated virus 9 (AAV9) 매개 유전자 전달의 효능과 안전성을 개발하고 검증하는 것이었다.

초록

성인 래트 및 돼지에서 아포 - 관련 바이러스 9 (AAV9) 벡터 전달 기술의 성공적 개발이 이전에보고되었다. AAV9 전달을 위해 subpially-placed 폴리에틸렌 카테터 (PE-10 또는 PE-5)를 사용하여, subpially-injection 척추 분절에서 척수 실질 (흰색 및 회색 물질)를 통한 강력한 형질 도입 유전자 발현이 입증되었습니다. 신경 퇴행성 질환의 광범위한 형질 전환 마우스 모델 때문에 성인 마우스에서 강력한 중추 신경계 (CNS) 표적화 된 벡터 전달 기술의 개발에 대한 강한 열망이 있습니다. 따라서, 본 연구는 성인 C57BL / 6J 마우스에서 안전하고 효과적인 척추 AAV9 전달을 허용하는 척추의 서브 벡터 전달 장치 및 기술의 개발을 기술한다. 척추 고정 및 마취 마우스에서, 피임 장치 (자궁 경부 1 및 척추 1-2 척수 분절 수준)를 XYZ 조작기를 사용하여 날카로운 34G 바늘로 절개 하였다. 두 번째 XYZ manipulator는 그 다음에 둔감한 36G 바늘을 요추 및 / 또는 자궁 경부 지방 공간으로 전진시키는 데 사용되었습니다. 녹색 형광 단백질 (GFP)을 인코딩 AAV9 벡터 (3-5 μL, 1.2 X 10 13 게놈 복사 (gc)) subpially 다음 주입되었다. 주사 후, 신경 학적 기능 (운동 및 감각)을 주기적으로 평가하고, 4 % 파라 포름 알데히드로 AAV9 전달 후 동물을 관류 고정시켰다. 수평 또는 횡단 척수 절편의 분석은 회색 및 흰 물질 모두에서 전체 척수를 통한 전이 유전자 발현을 보였다. 또한, 심한 역행위 매개 GFP 발현은 운동 피질, 핵 ruber, 및 formio reticularis에 내림차순 모터 축삭과 뉴런에서 보였다. 어떤 동물에서도 신경 학적 장애는 관찰되지 않았다. 이 데이터는 대식 성 벡터 전달 기술이 프로 시저 관련 척수 손상을 일으키지 않으면 서 성숙한 생쥐에서 성공적으로 사용될 수 있고 매우 강력한 전이 유전자 발현과 관련이 있음을 보여줍니다척추 신경근을 통한 시온.

서론

다양한 척수 및 CNS 신경 퇴행성 질환을 치료하기위한 AAV 벡터의 사용은 관심 유전자의 발현을 효과적으로 상향 조절하거나 침묵시키는 잘 받아 들여지는 플랫폼이되고있다. CNS / 척수 장애를 치료하기위한이 기술의보다 효과적인 활용에 대한 주요 제한 사항 중 하나는 성인 포유류의 심부 뇌 또는 척수 실질에 AAV 벡터를 전달하는 능력이 제한적이라는 것입니다.

그것은 성인 쥐, 고양이, 또는 인간이 아닌 영장류에서 AAV9의 전신 배달 뇌와 척수 1, 2, 3의 신경 세포에서 유전자의 발현을 유도에서만 적당히 효과가 있음을 예를 들어 설명되었다. 해부학 적으로 정의 된 뉴런 풀에서 제한된 도입 유전자 발현만을 유도하는 것으로 AAV9 벡터의보다 효과적인 척수강 내 전달이 또한 나타났다. 더 구체적으로, 그것은 악마들이었습니다.비인간 영장류, 돼지 또는 설치류에서 cisternal 또는 lumbo-sacral intrathecal AAV9 전달이 척수 α 운동 신경 세포 및 분절 지느러미 뿌리 신경절 뉴런에서 높은 수준의 전이 유전자 발현을 유도한다. 그러나 척추 신경 계통 또는 백질의 오름차순 또는 내림차순 축삭에서는 최소한 또는 전혀 발현이 4 , 5 , 6 , 7로 나타난다. 종합적으로, 이러한 데이터는 매우 효과적인 생물학적 - 해부학 적 장벽이 존재한다는 것을 보여 주며, 척수 내에서 전달 된 AAV가 더 깊은 척추 실질로 확산되는 것을 방지합니다.

성인 쥐와 돼지를 사용하여 이전 연구에서 새로운 subpial 벡터 전달 기술은 8 개발되었다. 이 접근법을 사용하여 single-bolus subpial AAV9 전달 후 매우 강력하고 다 분절 형질 전환 유전자 발현이 입증되었습니다. 강렬한 GFP 발현이 지속적으로 나타남교감 신경절 세포, 신경 교세포, 하강 / 상행 축삭에서 주입 된 척추 분절을 통해 관찰되었다. 이 연구는 피 아게트가 척수 실질 내로의 효과적인 AAV9 확산을 막을 수있는 주요 장벽임을 나타냈다. 이 이전에 개발 된 기술과 subpial 주입 장치는 대형 설치류 (쥐와 같은) 또는 성인 돼지에서 비교적 사용하기 쉽지만,이 시스템은 성인 마우스와 같은 작은 동물에서 사용하기에 적합하지 않습니다. 다양한 신경 퇴행성 장애의 이용 가능한 트랜스 제닉 마우스 모델이 매우 많기 때문에, 마우스에서 효과적인 척추 - 실질 세포 전달 기술의 개발이 분명한 필요성이있다. 이러한 기술의 이용 가능성은 세포 비 특이성 ( 예, 사이토 메갈로 바이러스 -MVV 또는 유비퀴틴) 또는 세포 특이 적 ( 예, 시냅스 또는 글라 이알)을 사용하는 특정 유전자 사일런 싱 ( 예 : shRNA 사용) 또는 상향 조절의 효과를 연구 할 수있다 섬유 성 산성단백질 (GFAP)) 프로모터를 포함한다.

따라서, 현재 연구에서, 우리는 성인 생쥐에서 효과적으로 사용할 수있는 소형 subpial 벡터 전달 시스템을 개발하고 검증했다. 유사하게, 이전의 쥐 및 돼지 연구에서와 마찬가지로,이 연구는 쥐에서 단일 - 볼 러스 서브 피알 AAV9 전달 후 척수 실질 전반에 걸쳐 강력한 전이 유전자 발현을 입증한다. 이 접근법의 단순성, subpial AAV9 전달에 주입 된 마우스의 아주 좋은 내성 및 척수 실질에서의 형질 전환 유전자 발현의 높은 효능은이 기술이 실험실 환경에서 효과적으로 수행되고 척추 유전자 발현을 목표로하는 실험에 사용됨을 시사한다.

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프로토콜

이 연구는 샌디에고 캘리포니아 대학의 동물 동물 보호 및 사용위원회의 승인을받은 프로토콜에 따라 수행되었으며 동물 실험을위한 실험실 동물 관리 지침 평가 협회를 준수했습니다. 모든 연구는 집단 크기와 동물의 고통을 최소화하는 방식으로 수행되었다.

1. 일반 동물 및 외과 준비

  1. 수술 절차를 시작하기 전에 바이러스 (AAV9 - UBI - GFP, 5 μL aliquots) 8 해동. 덱스 트란 분말을 증류수에 혼합하여 5 % 덱스 트란 (10,000 MW) 용액을 준비한다. 바이러스 용액을 5 % 덱스 트란 용액 1 : 1과 혼합하여 최종 덱스 트란 농도 2.5 %로 만든다.
    1. 바이러스 용액을 얼음에 보관하십시오 (4 ° C).
  2. 성인 C57BL / 6J 마우스 (남녀, 20-30 g)를 사용하십시오. 5 % isoflurane (O 2 , 1 L / 분)을 사용하여 마우스를 마취하고 2 에서 그들을 유지호흡 률과 발의 협착 정도에 따라 3 % 흡입 한 isoflurane (O 2 , 1 L / min).
  3. 면도 면도기로 동물의 등을 면도하고 2 % chlorhexidine으로 피부를 닦으십시오.
  4. 만성 회복 연구에서 엄격한 무균 기술을 따릅니다.
  5. 요추 subpial 주사가 수행되어야하는 경우, 메스로 Th8 - L1 척추를 덮고 Tha - 12 척추에서 paravertebral 근육을 분리 피부를 잘라 가위를 사용합니다.
    1. 마우스 척추 클램프를 사용하여 표준 stereotaxic 프레임에 동물을 탑재하십시오.
    2. 균열이 나타날 때까지 치과 용 드릴 (드릴 비트 : 0.9mm, 속도 : 20,000rpm)을 사용하여 Th10-12 척추의 얇은 판의 양 측면을 면도하십시오.
    3. 포셉로 금이 간 뼈 조각을 제거하고 요추 척수의 척수 표면을 노출.
    4. 30G 스테인레스 스틸 바늘과 포셉을 사용하여 약 1cm의 경질 뚜껑을 자르십시오.
  6. 자궁 경부 피하 주사를 시행하려면 가위를 사용하여 등쪽 목 피부 1.5-2 cm을 절개하고 C1-C2 절편을 노출 시키십시오.
    1. 23G 스테인레스 스틸 바늘과 집게를 사용하여 cisterna magna의 atlanto-occipital 막을 제거합니다.
    2. 면봉으로 조직 및 뼈 파편의 절개 부위를 닦으십시오.
    3. 30G 스테인레스 스틸 바늘과 포셉을 사용하여 약 2 ~ 3mm의 경질 뚜껑을 자르십시오.

2. Pial Membrane을 열고 AAV9 Delivery를위한 Subpial Needle 삽입

  1. 유리 모세관 홀더 ( 그림 1A 및 B )를 사용하여 XYZ 조작기의 Z-arm에 34G 피아 관통 바늘을 장착합니다.
    참고 : 피어 침투 바늘을 제조하려면 34G 바늘의 원래 경 사진 팁을 다이아몬드 연마 판이있는 유리 모세관 베벨러 (거친 모서리 크기 (5.0 μm ~ 50 μm 팁 크기) 및 연삭 각도)로 날카롭게합니다.15 - 20 °. 바늘 끝 (길이 1mm, 끝에서부터 측정)은 약 90 °로 부드럽게 구부립니다 ( 그림 1B , 왼쪽 삽입).
  2. 8-10 X 배율로 설정된 외과 해부 범위를 사용하여 피아 관통 바늘로 X 암을 사용하여 약 1 mm ( 그림 1C )로 피어를 관통시킵니다.
    1. 5 ~ 10 °의 조직 표면에 침투하는 바늘의 각도를 유지하십시오.
  3. pia가 열린 후, X-arm을 사용하여 관 공 공간 ( 그림 1 D)에서 피아 관통 바늘을 수평으로 제거합니다.
    참고 : 관통 된 부위는 혈관과 같은 랜드 마크로 기억하십시오.
  4. PE - 10 또는 PE - 20 튜빙과 주사 바늘에 연결된 50 μL microsyringe를 사용하여 AAV9 - UBI - GFP 바이러스와 무딘 36G 주사 바늘을로드합니다.
  5. 두 번째 XYZ 조작기의 Z- 아암에 바늘을 장착하십시오 ( 그림 1A 및 B )를 유리 모세관 홀더 ( 그림 1B , 오른쪽 삽입물)를 사용하여 제거합니다.
    참고 : subpial AAV9 주사 바늘을 제조하려면 36G 바늘의 둔각 팁을 다이아몬드 연마 판이있는 유리 모세관 베벨러 (거친 모서리 (5.0 μm ~ 50 μm 팁 크기))로 닦아서 날카로운 모서리를 제거합니다. 바늘 끝 (2-3 mm 길이, 끝에서부터 측정)을 약 90 °로 부드럽게 구부립니다. pia-penetrating 및 subpial 주입 바늘은 1-2cm 길이의 20G 슬레이브 스테인레스 스틸 튜브 (바늘 끝에서 10mm)에 삽입하고 에폭시로 붙입니다. 유리 모세관 홀더에 안전하게 부착하려면 20G (직경 0.91mm) 튜빙을 사용해야합니다.
  6. 두 번째 매니퓰레이터의 X, Y 및 Z 암을 조작하여 AAV9 주사 바늘의 팁을 피아 삽입 부위에 위치시킨 다음 이전의 pial 멤브레인 구멍을 통해 약 2 ~ 3mm 정도를 엑스 팔( 도 1E 및 F ).
    참고 : 1) AAV9-UBI-GFP는 이전에보고 된 프로토콜 9 , 10 에 따라 준비되고 최종 역가는 1.2 x 10 13 게놈 복사 / mL (gc / mL)로 조정됩니다. 2) 쉽게 확인할 수 있기 때문에 병 입구의 위치를 ​​표시 할 필요가 없습니다 ( 그림 1D ).
  7. 50 μL microsyringe를 사용하여 AAV9 - UBI - GFP (1.5, 3 또는 5 μL)를 subpial 공간에 주입하십시오 (실험 그룹에 대해서는 표 1 참조).
  8. AAV9 - UBI - GFP 주입이 완료되면 subpial 공간에서 주사 바늘을 제거합니다.
  9. 4.0 모노 필라멘트 봉합사와 외과 용 클립을 사용하여 근육과 피부를 닫습니다.
    참고 : 열린 척추를 봉할 필요가 없습니다.
  10. 동물이 가열 패드에서 회복되도록하십시오.
  11. 통증 조절을 위해 Buprenorphine 0.05 mg / kg / sc을 12 시간마다 주사하십시오.수술 후 2 ~ 3 일.

3. 관류 고정, 조직 Cryoprotection 및 Immunofluorescence 얼룩

  1. subpial AAV9 주사 후 미리 정해진 시점에서, 안락사 솔루션 ( 재료 의 표 참조, 0.3 ML)과 transecially 20 ML heparinized 생리 식염수와 PBS에서 4 % paraformaldehyde 20 ML 다음으로 그들을 쥐를 깊이 마취.
  2. 뼈 rongeur를 사용하여 척수와 두뇌를 해부하고 4 ° C에서 밤새 PBS에 4 % 포름 알데히드에서 사후 수정.
  3. 최소 5-7 일 동안 PBS에 30 % 자당으로 척수와 뇌를 동결 보관하십시오.
  4. 저온 유지 장치 (cryostat)에서 코로 날, 횡단 또는 세로 / 가로 동결 절편 (30 μm 두께)을 잘라내어 PBS 4 ° C에 보관하십시오.

4. 척수 및 뇌 절편의 면역 형광 염색 (표 참조)

  1. 자유롭게 떠 다니는 섹션을 primar로 배양하십시오.y 항체를 하룻밤.
  2. 일차 항체와 부화 후, PBS에서 세 번 섹션을 씻어 형광 결합 당나귀 안티 토끼, 당나귀 안티 치킨, 그리고 당나귀 안티 염소 보조 항체와 함께 품어.
  3. 현미경 슬라이드에 섹션을 마운트, 상온에서 건조하고, 안티 페이드 매체로 그들을 커버.
  4. epifluorescence 형광 현미경 (목표 : 10X, NA-0.3, 20X, NA-0.8 및 63X, NA-1.4)를 사용하여 이미지를 캡처하십시오.

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결과

하위 AAV9 주사 분획에서의 강력한 전이 유전자 발현 :
AAV9 전달 후 14 일째 척수 절편에서 transgene (GFP) 발현을 분석 한 결과, 척수 실질 전반에 AAV9- 의존성 GFP 발현이 나타났다. 첫째, 요추 하부 공간에 주입 된 AAV9-UBI-GFP의 2 회 양측 3 μL 주사는 전체 흉추 부위의 백색 및 회색 물질의 거의 완전한 감염과 연관되어 상부 흉부 분절까지 확장되었다 ( 그림 2A 및 2B , 왼쪽 및 중간 열). 요추 하부 공간에 AAV9-UBI-GFP를 양측에 1.5 μL 주사 한 결과 요추 전체의 백색 및 회색 물질이 거의 유사하게 감염되었다 (3 μL 주입 후 나타남). 그러나, 흉부 중간 뼈는 때때로 감염된 뉴런만을 나타 냈습니다 (ass = "xfig"> 그림 2B, 오...

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토론

이번 연구는 성체 마우스에서 subpial vector (AAV9) 전달 기술에 대해 설명합니다. 첨부 된 비디오에서 설명한 바와 같이,이 접근법과 기술은 필요한 장비와 피어 - 침투 바늘 및 서브 피알 주사 바늘이 적절하게 제조되고 제조되고 테스트 된 사양에 따라 제공되는 경우 효과적으로 사용할 수 있습니다.

생쥐에서 일관되고 안전하게 자궁 내 주사를 시행 할 때의 중요한 기술적 변수 :
실증 된 바와 같이, 자궁 경부 또는 요추 laminoplomy 후 성인 마취 마우스에서 subpial 주사는 쉽게 수행 할 수 있습니다. 서브 파이어 인젝션 기술의 성공을 정의하는 몇 가지 중요한 기술 변수가 있습니다. 첫째, 34 G 피아 관통 바늘의 끝은 피아의 부드러운 천공을 보장하기 위해 베벨 러를 사용하여 지속적으로 날카롭게해야합니다. 바늘을 날카롭게하는 방법에 대한 기술의 불일치로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다.피아 침투 동안 및 /...

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공개 사항

Martin Marsala는 Neurgain Technologies, Inc. (San Diego, USA)의 공동 설립자입니다.

감사의 글

이 연구는 SANPORC 및 ALSA 재단 보조금 (Martin Marsala)에 의해 지원되었습니다. 국가 지속 가능성 프로그램, 프로젝트 번호 LO1609 (체코 교육 청소년 스포츠부); 및 RVO : 67985904 (Stefan Juhas 및 Jana Juhasova).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
C57BL / 6J 마우스Jackson Labs664
Lab 표준 입체 마우스하버드 장치72-9568
마우스 척추 어댑터하버드 장치72-4811
XYZ 매니퓰레이터스톨 팅51604
수동 주입 펌프스톨 팅51218
34G 경 사진 나노 필 바늘World Precision InstrumentsNF34BV-2
36G 무딘 나노필 바늘World Precision InstrumentsNF-36BL-2
Fluriso, IsofluraneMWI 수의학 공급502017
클로르헥시딘 솔루션MWI 수의학 공급501027
20G 스테인레스 스틸 바늘Becton-Dickinson305175
23G 스테인레스 스틸 바늘Becton-Dickinson305145
30G 스테인레스 스틸 바늘Becton-Dickinson305128
면 팁 애플리케이터MWI 수의학 공급27426
유리 모세관 Beveller Narishige InternationalSM-25B
슬라이드 현미경 SuperfrostLeica MicrosystemsM80
50 μ L 마이크로주사기 Hamilton81242
BD Intramedic PE-20 튜빙Becton, Dickinson427406
BD Intramedic PE-10 튜빙Becton, Dickinson427401
4-0 모노필라멘트 봉합사VetOneV1D397
유리 모세관 Beveller NarishigePipet 마이크로 그라인더 EG-40 
5분 에폭시(에폭시 클리어)Devcon14310
안락사 용액MWI 수의학 공급11168
헤파린주 1,000 U/mLMWI 수의학 공급54254
파라포름알데히드시그마-알드리치158127
수당그마-알드리치S0389
안티 NeuN 항체EMD-MilliporeABN78일차 토끼 다클론 항체, 1:1000
항콜린 아세틸전이효소 (CHAT) 항체EMD-MilliporeAB144P일차 염소 다클론 항체, 1:100
항 GFP 항체Aves LabsGFP-1020일차 닭 다클론 항체, 1:1000
당나귀 항토끼 IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA212072차 항체, 1:1000
  당나귀 항토끼 IgG 2차 항체, Alexa Fluor 680ThermoFisher ScientificA100432차 항체, 1:1000
당나귀 항닭 IgY 2차 항체, Alexa Fluor 488Jackson Immunoresearch Labs703-545-1552차 항체, 1:1000
당나귀 항염소 IgG H& L (Alexa Fluor 647Abcamab1501312차 항체, 1:1000
슬라이드 현미경 SuperfrostFisher Scientific12-550-143
ProLong Gold Antifade MountantFisher ScientificP36930
Epifluorescence MicroscopeZeissZeiss AxioImager M2
형광 컨포칼 현미경OlympusOlympus FV1000
DextranPolysciences, Inc19411
AAV9-UBC-GFPUCSD 바이러스 벡터 코어 연구소
시

참고문헌

  1. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
  2. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
  3. Gray, S. J., et al. Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates. Mol Ther. 19 (6), 1058-1069 (2011).
  4. Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
  5. Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21 (12), 2148-2159 (2013).
  6. Passini, M. A., et al. Translational fidelity of intrathecal delivery of self-complementary AAV9-survival motor neuron 1 for spinal muscular atrophy. Hum Gene Ther. 25 (7), 619-630 (2014).
  7. Bell, P., et al. Motor neuron transduction after intracisternal delivery of AAV9 in a cynomolgus macaque. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 43-44 (2015).
  8. Miyanohara, A., et al. Potent spinal parenchymal AAV9-mediated gene delivery by subpial injection in adult rats and pigs. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16046(2016).
  9. Xu, Q., et al. In vivo gene knockdown in rat dorsal root ganglia mediated by self-complementary adeno-associated virus serotype 5 following intrathecal delivery. PLoS One. 7 (3), 32581(2012).
  10. Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).

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