Summary
Wir präsentieren Protokolle für die Anwendung unseres gezielten genetisch codierten Calciumindikators (GECI) CatchER + zur Überwachung von schnellen Calcium-Transienten im endoplasmatischen / sarkoplasmatischen Retikulum (ER / SR) von HEK293 und Skelettmuskel-C2C12-Zellen mittels Echtzeit-Fluoreszenzmikroskopie. Ein Protokoll für die in situ K d Messung und Kalibrierung wird ebenfalls diskutiert.
Abstract
Intrazelluläre Calcium (Ca 2+ ) -Transienten, die durch extrazelluläre Reize hervorgerufen werden, initiieren eine Vielzahl biologischer Prozesse in lebenden Organismen. Im Zentrum der intrazellulären Calciumfreisetzung befinden sich die wichtigsten intrazellulären Calciumlagerorganellen, das endoplasmatische Retikulum (ER) und das spezialisierte sarkoplasmatische Retikulum (SR) in Muskelzellen. Die dynamische Freisetzung von Calcium aus diesen Organellen wird durch den Ryanodinrezeptor (RyR) und den Inositol-1,4,5-Triphosphat-Rezeptor (IP 3 R) vermittelt, wobei das Nachfüllen durch die Sacco / endoplasmatische Retikulum-Calcium-ATPase (SERCA) -Pumpe erfolgt. Ein genetisch kodierter Kalziumsensor (GECI) namens CatchER wurde erstellt, um die schnelle Kalziumfreisetzung aus dem ER / SR zu überwachen. Hier sind die detaillierten Protokolle für die Transfektion und Expression des verbesserten ER / SR-zielgerichteten GECI CatchER + in HEK293 und C2C12 Zellen und deren Anwendung bei der Überwachung von IP 3 R, RyR und SERCA pumpenvermittelter Calcium transientS in HEK293-Zellen mit Fluoreszenzmikroskopie ist umrissen. Der Rezeptor-Agonist oder Inhibitor der Wahl wird in der Kammerlösung dispergiert und die Intensitätsänderungen werden in Echtzeit aufgezeichnet. Bei dieser Methode wird bei RyR-Aktivierung mit 4-Chlor-m-cresol (4-cmc), der indirekten Aktivierung von IP 3 R mit Adenosintriphosphat (ATP) und Hemmung der SERCA-Pumpe mit Cyclopiazon eine Abnahme von ER-Calcium beobachtet Säure (CPA). Wir diskutieren auch Protokolle zur Bestimmung der in situ K d und quantifizierenden basalen [Ca 2+ ] in C2C12-Zellen. Zusammenfassend können diese Protokolle, die in Verbindung mit CatchER + verwendet werden, eine Rezeptor-vermittelte Calciumfreisetzung aus dem ER mit einer zukünftigen Anwendung beim Studium von ER / SR-Calcium-verwandten Pathologien hervorrufen.
Introduction
Die räumlich-zeitlichen Attribute von intrazellulären Calcium (Ca 2+ ) transienten aktivieren verschiedene biologische Funktionen 1 . Diese Ca 2+ -Signalisierungsereignisse werden extrazellulär durch verschiedene Reize ausgelöst und intrazellulär durch die Haupt-Ca 2+ -Speicherorganelle und durch zahlreiche Ca 2+ -Pumpen, Kanäle und Ca 2+ -bindende Proteine kontrolliert. Ca 2+ -Transienten können durch Defekte mit Signalmodulation signifikant verändert werden, was zu unterschiedlichen Erkrankungen führt 2 . Aufgrund der Geschwindigkeit und Kompliziertheit des Ca 2+ -Signalisierungssystems werden mit dem endo- (ER) und dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) im Zentrum genetisch kodierte Ca 2+ -Sonden benötigt, die für die Expression von Säugetieren mit schneller Kinetik optimiert wurden Um globale und lokale Ca 2+ Veränderungen in verschiedenen Zellen zu beobachten 3 .
Die ER und die SR, Sein Gegenstück in Muskelzellen, sind die wichtigsten intrazellulären Ca 2+ -Speicherorganellen und wirken als Ca 2+ -Senken, die zur Verstärkung des Ca 2+ -Signals 4 beitragen. Das ER / SR ist ein integraler Bestandteil der Ca 2+ -Signalisierung mit Doppelrollen als Sender und Empfänger von Signalen 5 . Der Ryanodinrezeptor (RyR) und der Inositol-1,4,5-Triphosphatrezeptor (IP 3 R) sind Ca 2+ -Auslösungsrezeptoren, die sich auf den Membranen des ER / SR befinden, die durch Ca 2+ 6 reguliert werden. Andere Wirkstoffe stimulieren direkt oder indirekt die Funktion dieser Rezeptoren. 4-Chlor-m-cresol (4-cmc) ist ein starker Agonist des RyR mit einer 10fach höheren Empfindlichkeit als Koffein zur Induktion der SR Ca 2+ -Ausgabe, bei der beide regelmäßig zur Untersuchung der RyR-vermittelten Ca 2+ -Ausgabe eingesetzt werden Gesunde und kranke Zellen 7 . ATP erhöht IP 3- vermittelte Ca 2+ reLeasing durch die IP 3 R 8 . ATP bindet an den purinergischen Rezeptor P2YR, einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR), der die Produktion von IP 3 auslöst, die an die IP 3 R bindet, um Ca 2+ aus dem ER 9 , 10 freizusetzen. Die Sacco-endoplasmatische Retikulum-Calcium-ATPase-Pumpe (SERCA) ist eine PP-ATPase-Pumpe, die sich ebenfalls auf der ER / SR-Membran befindet, die das zytosolische Ca 2+ reduziert und das ER / SR durch ein aktives Pumpen des Ions in das ER / SR-Lumen auffüllt 11 Spezifische Inhibitoren der SERCA-Pumpe umfassen Thapsigargin, von Thapsia garganica und Cyclopiazonsäure (CPA), von Aspergillus und Penicillium . CPA hat eine geringe Affinität für die Pumpe und blockiert den Ca 2+ Zugangspunkt 12 reversibel. Thapsigargin hingegen bindet irreversibel an die Ca 2+ freie Pumpe am Rest F256 in der M3-Helix mit NanomolAr affinität 11 Die Analyse und Quantifizierung der Veränderungen in Ca 2+ stimulierten Ereignissen war und bleibt eine Herausforderung. Da das ER / SR das wichtigste subzelluläre Ca 2+ -haltige Kompartiment mit einer zentralen Funktion bei der Ausbreitung des Ca 2+ -Signals ist, wurde viel Arbeit auf das Verständnis der ER / SR Ca 2+ -Signalisierung 5 konzentriert.
Die Schaffung von synthetischen Ca 2+ -Farbstoffen hat dazu beigetragen, das Feld und die Praxis der Ca 2+ -Bildgebung voranzutreiben. Obwohl Farbstoffe wie Mag-Fura-2 weit verbreitet sind, um kompartimentiertes Ca 2+ in verschiedenen Zellen, 13 , 14 , 15 zu messen , haben sie Einschränkungen wie unebene Farbstoffbeladung, Photobleichung und die Unfähigkeit, auf spezifische Organellen gerichtet zu sein . Die Entdeckung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) und die Weiterentwicklung von fluoreszierendem Protein-Basierte Ca 2+ - Sonden hat das Feld der Ca 2+ - Bildgebung vorangetrieben 16 . Einige der vorhandenen GECIs sind Förster-Resonanz-Energieübertragungs- (FRET-) Paare mit gelbem Fluoreszenzprotein (YFP), Cyan-Fluoreszenzprotein (CFP), Calmodulin und dem M13-Bindungspeptid 17 , 18 . Troponin C-basierte GECIs sind auch als FRET-Paare von CFP und Citrin und als einzelne Fluorophor-Sonden 19 , 20 , 21 erhältlich. Andere, wie GCaMP2 und R-GECO sind einzelne Fluorophore-Sensoren mit Calmodulin 22 , 23 . Um die Einschränkungen der engen Abstimmung von K d 's und kooperativer Bindung zu überwinden, die mit mehreren Ca 2+ Bindungsstellen assoziiert sind, die in ihren Ca 2+ -Bindungsdomänen 24 gefunden wurden , wurde eine neue Klasse von Calcium senSors wurde durch die Konstruktion einer Ca 2+ -Bindungsstelle auf der Oberfläche des Beta-Fasses in einer chromophoreempfindlichen Stelle von verstärktem grün fluoreszierendem Protein (EGFP) 25 , 26 hergestellt. Dieser hochgeladene Sensor, genannt CatchER, hat eine Kd von ~ 0,18 mM, ak in der Nähe der Diffusionsgrenze und ak off von 700 s -1 . Catcher wurde verwendet, um die Rezeptor-vermittelte ER / SR-Calciumfreisetzung in verschiedenen Säugetierzelllinien wie HeLa, HEK293 und C2C12 25 zu überwachen. Wegen seiner schnellen Kinetik wurde CatchER in den Flexor digitorum brevis (FDB) Muskelfasern der jungen und alten Freund Virus B NIH Jackson (FVB) Mäuse verwendet, um zu zeigen, dass mehr Ca 2+ im SR nach 2 s Depolarisation in der FDB bleibt Fasern von alten Mäusen im Vergleich zu denen junger Mäuse 27 . Um seine niedrige Fluoreszenz bei 37 ° C zu überwinden, was seine Anwendungen bei der Calcium-Bildgebung von Säugetieren behindertZellen haben wir eine verbesserte Version von Catcher namens CatchER + entwickelt. Catcher + zeigt eine verbesserte Fluoreszenz bei 37 ° C für eine bessere Anwendung in Säugetierzellen. Zusätzliche Mutationen wurden in CatchER integriert, um die Thermostabilität und Fluoreszenz bei 37 ° C 28 , 29 zu verbessern, um CatchER + zu erzeugen. Catcher + zeigt eine sechsseitige Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses (SNR) gegenüber CatchER 30 .
Hier werden die Protokolle für die Kultur und Transfektion von HEK293- und C2C12-Zellen mit CatchER + und deren Anwendung zur Überwachung von ER / SR-Rezeptor-vermittelten Calcium-Transienten vorgestellt. Repräsentative Ergebnisse sind für CatchER + gezeigt, die in HEK293-Zellen exprimiert wurden, die mit 4-cmc, CPA und ATP behandelt wurden. Wir liefern auch ein Protokoll zur Bestimmung der in situ Kd von CatchER + in C2C12 Myoblastenzellen und quaNtifizierung von basal [Ca 2+ ].
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Protocol
1. Folienvorbereitung
- Platzieren Sie 22 mm x 40 mm Glasmikroskop-Objektträger in 6 cm Zellkulturschalen, 1 Folie pro Teller.
- Setzen Sie jede Seite jeder Folie sowie die 6 cm Schale zu ultraviolettem (UV) Licht für 15-20 min, um in einer sterilen Kapuze zu sterilisieren.
- Decken Sie das Geschirr mit Folien innen mit Parafilm und lagern bei 4 ° C bis zum Gebrauch.
2. Vorbereitung von Medien, Puffern, Lösungen und Reagenzien
- 1 l Hanks ausgeglichene Salzlösung (HBSS) in deionisiertem Wasser zugeben und 10 mM HEPES, 5 mM NaHCO 3 und 1 mM EGTA zugeben. Mit NaOH auf pH 7.2-7.3 einstellen. Filterpuffer mit einem 0,22 μm Filter in eine Autoklavenflasche.
- Vorbereiten von 900 ml hochglukose Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) h in deionisiertem Wasser. Addieren Sie 44 mM NaHCO 3 und stellen Sie den pH-Wert auf 7,2-7,3 mit HCl ein. Filtermedium mit einem 0,22 μm Filter in eine Autoklavenflasche. 100 ml fetales bovi hinzufügenNe Serum (FBS) an die Medien, um die FBS-Konzentration 10% zu machen. Bei 4 ° C aufbewahren.
- 1 l des intrazellulären Puffers (125 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM CaCl 2 , 0,5 mM EGTA, 0,2 mM MgCl 2 ) in deionisiertem Wasser zubereiten und den pH-Wert auf 7,25 einstellen. Die endgültige [Ca 2+ ] wird ~ 100 nM. Vor Gebrauch 0,5 mM ATP hinzufügen. Bei Raumtemperatur lagern.
- 1 l Ringer-Puffer (121 mM NaCl, 2,4 mM K 2 HPO 4 , 0,4 mM KH 2 PO 4 , 10 mM HEPES und 1,2 mM MgCl 2 ) in deionisiertem Wasser zubereiten und den pH-Wert auf 7,2 einstellen. Bei Raumtemperatur lagern. Zur Verwendung werden 50 ml in ein 50 ml-Röhrchen gegeben und 1,8 mM Ca 2+ und 10 mM Glucose zugegeben.
- 1 l KCl-Spüllösung (125 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM MgCl 2 ) in deionisiertem Wasser zubereiten und den pH-Wert auf 7,25 einstellen.
- 5 mg Ionomycin in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen. Aliquotieren Sie 30 μl in Mikroröhrchen und lagern bei -206; C.
- Bereiten Sie den Cyclopiazonsäure (CPA) -Stand vor, indem Sie CPA in DMSO auflösen. Stellen Sie sicher, dass der letzte Prozentsatz von DMSO ≤ 1% für den CPA ist, der den Zellen hinzugefügt wird, um Apoptose zu verhindern. 20 mM 4-Chlor-m-cresol (4-cmc) durch Auflösen in filtriertes H 2 O vorbereiten und über Nacht durch Schütteln bei 37 ° C auflösen lassen. Vorbereiten des ATP-Stammes durch Auflösen in gefiltertem H 2 O bis 100 mM.
- Um das in situ K d zu bestimmen, werden je 1 mM EGTA, 0,2 mM, 0,6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM und 100 mM Ca 2+ in KCl-Puffer unter Verwendung von 100 hergestellt MM-EGTA-Stamm und ein 1 M CaCl 2 -Stand, gelöst in deionisiertem Wasser.
3. Zellkultur
- Kultur C2C12 Myoblasten- und HEK293-Zellen nach ATCC-Protokollen für jeweils 10 cm Zellkulturschalen in einer sterilen UV-Haube.
ANMERKUNG: C2C12-Zellen dürfen nicht höher als ~ 70% Konfluenz wachsen, da die Myoblasten zu differenzieren beginnenTe in myotubes Sowohl HEK293- als auch C2C12-Zellen wachsen leicht und sollten nicht über 100% Konfluenz hinausgehen, um die Zellintegrität aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus sollten die Zellen nicht mehr als 10 Mal vorübergehen, bevor sie sie für ein Experiment verwenden, um die Zelle Gesundheit zu erhalten.
4. Transfektion von HEK293-Zellen
- Samen HEK293 Zellen auf sterilisierte 22 mm x 40 mm Glasmikroskop Objektträger in 6 cm Schalen, so dass sie ~ 70% konfluent am Tag der Transfektion sind.
- Am nächsten Tag folgen Sie dem Protokoll des Herstellers für das Transfektionsreagenz, um Zellen mit 2 μg CatchER + cDNA und einem 1: 3 (Gewicht / Volumen) DNA: Transfektionsreagensverhältnis im reduzierten Serummedium ( zB Opti-MEM) zu transfizieren.
- Leeren Sie das DMEM-Medium aus der Schale und fügen Sie 3 ml reduzierte Serummedien hinzu. Addieren Sie DNA: Transfektionsreagenzgemisch auf die Schale und inkubieren für 4-6 h bei 37 ° C.
- Nach der Inkubation die Zellen mit 5-6 ml HBSS waschen. Verwerfe die HBSS fIn die Schale geben und mit 3 ml frischem DMEM austauschen und sie bei 37 ° C für 48 h inkubieren, um die Expression des GECI zu ermöglichen.
- Transfektion von C2C12 Myoblastenzellen
- Für C2C12 Myoblast-Zellen, Trypsinize-Zellen durch Zugabe von genügend Trypsin, um den Boden der Schale (1-2 ml) zu decken. Legen Sie die Schale in einen 37 ° C Inkubator für 2-6 min, damit das Trypsin die Zellen von der Unterseite der Schale lösen kann.
- Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie das Trypsin und saugt die Zellen in 8 ml DMEM. Pipettieren Sie die Zellen gründlich mit dem DMEM, um Te-Zellen gleichmäßig zu dispergieren und erneut zu suspendieren und sie auf sterile Deckgläser in 6 cm Zellkulturschalen mit 3 ml DMEM zu säugen, so dass der endgültige Zusammenfluss 60% beträgt.
- Transformiere die Zellen am selben Tag wie in Schritt 4.2-4.3 skizziert. 15 h bei 37 ° C inkubieren.
- Wiederholen Sie Schritt 4.4.
5. Vorbereitung des Slide- und Fluoreszenzmikroskops
- Einschalten mMikroskop und Lichtquelle, dann öffnen Sie das Simple PCI Programm. Lassen Sie das Mikroskop für 15-20 min aufwärmen, bis die CCD-Kamera auf -65 ° C abkühlt. Bereiten Sie die Kammer vor und schieben Sie mit den Zellen beim Warten.
- Decken Sie den Boden der flachen, offenen Diamant-Bad-Bildkammer mit einer dünnen Schicht aus Dichtstoff, mit einem Wattestäbchen.
- Nehmen Sie die Folie mit transfizierten Zellen aus dem Inkubator und spülen Sie sie dreimal mit 1 ml Ringer-Puffer mit 10 mM Glucose und 1,8 mM Ca 2+ vorgewärmt auf 37 ° C.
- Lassen Sie 1 ml Ringer-Puffer in die Schale geben, um zu verhindern, dass Zellen trocknen, und verwenden Sie Pinzette, um die Rutsche aus der Schale zu nehmen. Lassen Sie überschüssige Lösung auf ein Laborgewebe aufnehmen, indem Sie den Rand des Objektträgers an ein Laborgewebe berühren. Dann auf die Seite der Kammer auftragen, die das Fett enthält, wobei die Zellen nach oben gerichtet sind und die Kammer mit einem Schraubendreher auf die Bühnenhalterung aufsetzen.
- Hinzufügen 1Ml von Ringer-Puffer in die Kammer, um zu verhindern, dass Zellen trocknen, während die Kammer auf die Bühne montiert und den Rest des Mikroskop-Setups vervollständigt wird. Sobald der Vakuumsaugschlauch an der Kammer befestigt ist, beträgt das Endvolumen, das die Kammer hält, 450 μl.
- Schalten Sie das Mikroskopobjektiv auf das 40X-Öl-Immersionsobjektiv.
- Verwenden Sie Linsenpapier und Linsenreinigungslösung, um das Ziel zu reinigen und zu trocknen. Reib nicht das objektiv Düftig, bis die Oberfläche sauber ist.
- Füge einen Tropfen des Immersionsöls zum Ziel hinzu.
- Legen Sie die Halterung auf die Mikroskopstufe und fügen Sie die Vakuumspitze zur Kammer hinzu. Sobald der Vakuumsaugschlauch an der Kammer befestigt ist und eingeschaltet ist, beträgt das Endvolumen der Kammer ~ 450 μl. Dieses Endvolumen ist mit den Seiten der Kammer eben. Es ist zwingend erforderlich, dass die Kammerlösung während des Experiments waagerecht ist, um zu verhindern, dass die Lösung durch Überfüllung in das Objektiv gelangt.
- Verwenden Sie den Hellfeldmodus, stellen Sie die Verstärkung auf 175 und die Belichtungszeit auf 0,03 s ein, um die Zellen zu fokussieren.
- Sobald die Zellen fokussiert sind, wechseln Sie in den Fluoreszenzmodus mit 488 nm Anregung. Ändern Sie die Belichtungszeit auf 0,07 s. Suchen Sie ein Gesichtsfeld, das genügend Zellen hat, die mit ausreichender Fluoreszenz zum Bild gesund sind.
- Sobald ein Gesichtsfeld gewählt wurde, fotografieren Sie im Fluoreszenz- und Hellfeldmodus.
- Umkreisen Sie eine Region von Interesse (ROI) in den Zellen oder kreuzen Sie die ganze Zelle, um die Intensität aus dem gewählten Gebiet aufzuzeichnen.
6. Imaging Drug-induzierte Ca 2+ Transienten und In Situ K d Kalibrierung
- Start-Intensitätsmessung mit jeweils 5 s eingestellter Bildrate.
- Erlaube die Baseline-Intensität für 20-30 Frames (100-150 s) zu stabilisieren. Wenn nötig, verringere die frAmes / s während dieses Schrittes, um Photobleaching zu verhindern.
- Berechnen Sie die Menge von 4 cm cm, die von einem 20 mM-Vorrat benötigt wird, basierend auf dem endgültigen Kammervolumen von ~ 450 & mgr; l, um eine Endkonzentration von 200 & mgr; M herzustellen. Verdickungen der Lagerung nach Bedarf machen.
- Nehmen Sie sorgfältig 60 μl Ringer-Puffer aus der Kammer und legen Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Mit dieser Lösung die berechnete Menge von 4 cm cm verdünnen und in die Kammer zurückkehren, um die beabsichtigte Reaktion aus den abgebildeten Zellen hervorzurufen.
- Fügen Sie die berechnete Menge von 4-cmc dem Mikrozentrifugenröhrchen hinzu und mischen Sie durch Pipettieren.
- Fügen Sie die Lösung vorsichtig über das Sichtfeld hinzu, während Sie gleichzeitig die Ereignismarkierung in der Intensitätsmessung hinzufügen.
- Erlaube die Zeit, dass das Medikament an den Rezeptor bindet und die nachfolgende Signalabnahme bindet, dann mit 3-6 ml Ringer-Puffer mit 1,8 mM Ca 2+ und 10 mM Glukose bei gleichzeitiger Zugabe des Event-Markers waschen. Da das Kammervolumen 450 &# 181; L und ist mit einem Vakuum verbunden, indem man 3-6 ml Puffer einsetzt, sorgt dafür, dass die frühere Lösung, die das Medikament enthält, weggewaschen und durch die neu hinzugefügte Lösung ersetzt wurde.
- Wiederholen Sie 6.1-6.7 für 100 μM ATP und 15 μM CPA, wobei eine neue Folie von transfizierten Zellen für jeden Assay verwendet wird.
- Sobald die Messung abgeschlossen ist, beenden Sie die Datenerfassung im Intensitätsmessfenster im Simple PCI Programm.
- Nehmen Sie Fluoreszenz und Hellfeldbilder der Zellen.
- Öffnen Sie die Datendatei für das Experiment. Hier umkreisen die Zellen oder Regionen von Interesse, um die Intensitätswerte bei Bedarf neu zu berechnen.
- Um die in situ Kd in C2C12 Myoblastzellen zu bestimmen, folgen Sie dem Protokoll, wie in Abschnitt 4.2 und Abschnitt 5 beschrieben, und legen Sie 1 ml 0 mM Ca 2+ Ringer Puffer in die Kammer.
- Permeabilisieren der Zellen mit 0,002-0,005% Saponin in intrazellulärem Puffer für 15-30 s, um die Zellen von irgendeinem zu entleerenCatcher + das kann im Cytosol sein. Waschen Sie die Zellen mit 3-6 ml 1 mL EGTA in KCl-Puffer mit 10 μM Ionomycin. Erlaube die Intensität, bis ein Plateau erreicht ist.
- Mit 3-6 ml KCl-Puffer mit 10 μM Ionomycin abspülen und die Intensität stabilisieren lassen und dann jede in Schritt 2.7 beschriebene Ca 2+ -Lösung zugeben. Erlaube die Intensität, ein Plateau zwischen jeder Addition zu erreichen.
- Zur Kalibrierung des Sensors zur basalen [Ca 2+ ] - Quantifizierung folgen Sie Schritt 6.12. Verwenden Sie den EGTA und den 100 mM Ca 2+ Puffer aus Schritt 2.7, um die minimale und maximale Fluoreszenzintensität zu erhalten.
7. Datenverarbeitung
- Laden Sie die Tabellenkalkulation der Intensitätsmessdaten herunter.
- Normalisieren Sie die Daten für jede Zelle auf die Grundlinienintensität (F / F 0 ). Zeichnen Sie die normalisierten Daten über die Zeit in jedem Grafikprogramm.
- Um die% änderung zu berechnen, subtrahiere das normalisierte SpitzenwertUe von 1 und multiplizieren mit 100. Berechnen Sie die durchschnittliche und Standardabweichung, wenn mehrere Zellen abgebildet wurden.
- Zur Berechnung des Signal-Rausch-Verhältnisses, SNR, eröffne die aus dem Experiment gespeicherte Bilddatei in einer Bildverarbeitungssoftware wie ImageJ und messe dann das Signal, transfizierte Zellen und Rauschen, Hintergrund. Berechnen Sie das SNR mit der Gleichung SNR = Signal / Rauschen.
- Um die in situ K d aus den gesammelten Fluoreszenzbildgebungsdaten zu berechnen, werden die Intensitätsdaten, die die Plateaus umfassen, nach der Zugabe jeder Ca 2+ -Konzentration und EGTA (0 mM Ca 2+ ) gemittelt. Berechnen Sie die Fraktionssättigung (relative Intensität) mit θ = (F - F min ) / (F max - F min ), wobei θ die relative Intensität ist, F die Fluoreszenz an irgendeinem Punkt ist, F min die minimale Fluoreszenzintensität ist und F max ist die maximale Fluoreszenzintensität, um die Änderung der Intensität von t zu sehenEr prüft mit der Zugabe von Ca 2+ im Vergleich zur minimalen Intensität. Zeichnen Sie die relativen Intensitätsdaten gegen das [Ca 2+ ] in jedem grafischen und Kurvenanpassungsprogramm. Verwenden Sie die 1: 1-Bindungsgleichung θ = [M T ] / (K d + [M T ]), die für jedes grafische und Kurvenanpassungsprogramm übersetzt wurde, um das K d zu berechnen. M T ist die Gesamtmetallkonzentration.
- Zur Quantifizierung des Basal-Calciums aus der in 6.13 skizzierten Kalibrierung werden die Intensitätsdaten, die die Plateaus enthalten, nach der Zugabe von 1 mM EGTA (F min ) und 100 mM Ca 2+ (F max ) gemittelt. Verwenden Sie die Kalibriergleichung [Ca 2+ ] = K d ([F - F min ) / (F max - F)], um das basale Kalzium zu berechnen.
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Representative Results
Dieser Abschnitt veranschaulicht die Ergebnisse, die mit den zuvor beschriebenen Methoden unter Verwendung des optimierten ER / SR-zielgerichteten GECI CatchER + erreicht wurden, um Änderungen in ER / SR Ca 2+ durch verschiedene Rezeptor-vermittelte Wege zu überwachen.
Abbildung 1 zeigt die ER-Entleerung durch den mit 200 μM 4-cmc stimulierten RyR. 4-cmc ist ein Agonist der RyR. Die Zugabe des Arzneimittels induziert eine Abnahme des ER-Calciums, gemessen durch die Abnahme der Catcher + Fluoreszenzintensität. Wie bereits erwähnt, erlaubt das hier beschriebene Protokoll die Visualisierung und Messung von Rezeptor-vermittelten Ca 2+ -Transienten mit CatchER + , die Informationen über die Veränderungen in ER Ca 2+ liefert.
Wie in Fig. 2 dargestellt, ist die Zugabe von 15 μM CPA, um die SERCA-Pumpe reversibel zu blockieren, erzeugt eine starke Abnahme der Fluoreszenzintensität, die ein Plateau bildet. Da die Funktion der SERCA-Pumpe gehemmt wird, werden die ER Ca 2+ -Auslösungskanäle noch aktiv Ca 2+ in das Cytosol freisetzen, wodurch die Fluoreszenzintensität abnimmt. Die Zellen erholen sich nach dem Waschen von CPA mit Ringer-Puffer, der 1,8 mM Ca 2+ und 10 mM Glucose enthält. Diese Ergebnisse bestätigen die Fähigkeit von CatchER + , die für die SERCA-Pumpe spezifischen Ca 2+ -Transienten zu überwachen.
Abbildung 3 zeigt repräsentative Daten zur indirekten Aktivierung der IP 3 R mit 200 μM ATP in HEK293-Zellen, die mit CatchER + transfiziert wurden. ATP bindet an den P2Y-Rezeptor, einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor, der IP 3 erzeugt , der die Ca 2+ -Ausgabe durch die IP 3 R aktiviertKlein ist, erzeugt die Zugabe von 200 μM ATP eine sichtbare Abnahme der Signalintensität. Das Waschen der Zellen mit Ringer-Puffer, der 1,8 mM Ca 2+ und 10 mM Glucose enthält, ermöglicht es dem ER, nachzufüllen und das Signal auf die Grundlinie zurückzukehren. Diese Ergebnisse heben die Fähigkeit von CatchER + hervor, die IP 3 R-vermittelte Calciumfreisetzung durch indirekte Stimulation zu überwachen.
In Fig. 4 wurde CatchER + in C2C12-Myoblastenzellen transfiziert, um die in situ Kd zu bestimmen. Die Daten wurden gesammelt, wie im Protokoll beschrieben. C2C12-Myoblastzellen wurden mit 0,005% Saponin für 15-30 s permeabilisiert und dann mit 1 mM EGTA in KCl-Puffer, enthaltend 10 & mgr; M Ionomycin, gewaschen. Die verschiedenen Ca 2+ -Konzentrationen wurden in KCl-Puffer mit 10 μM Ionomycin hergestellt und schrittweise zugegeben. Die Daten wurden normalisiert und mit der 1: 1-Bindung ausgestattetGleichung. Der durchschnittliche K d betrug 3,1 ± 1,4 mM für 7 Zellen. Die schwache Affinität von CatchER + erlaubt es, Ca 2+ in hohen Ca 2+ Organellen wie dem ER oder SR zu erfassen. Zur Bestimmung des basalen [Ca 2+ ] in der SR wurden C2C12-Zellen mit 0,005% Saponin für 15-30 s permeabilisiert, mit KCl-Puffer gewaschen und dann mit 1 mM EGTA in KCl-Puffer mit 10 μM Ionomycin gewaschen, um F min zu erhalten . Nach dem Waschen des EGTA mit KCl-Puffer wurde ein Maximum, F max , von 100 mM Ca 2+ mit 10 μM Ionomycin zugegeben. Das basale Ca 2+ wurde mit 0,4 ± 0,2 mM berechnet.
Abbildung 1: Stimulation von RyR mit 4-cmc in HEK293-Zellen. ( A ) Darstellung der Aktivierung von RyR mit 4-cmc. ( B ) Intensitätsaufnahme von HEK293-ZellenTransfiziert mit CatchER + , lokalisiert im ER, behandelt mit 200 μM 4-cmc. Die Stimulation des RyR mit 4-cmc bewirkt eine Abnahme der normalisierten Fluoreszenzintensität, die direkt mit einer Abnahme von [Ca 2+ ] ER korreliert. N bezieht sich auf die Anzahl der abgebildeten Zellen. Die durchschnittliche Signalabsenkung betrug 12,0 ± 2,2%. Die Anwesenheit von 1,8 mM Ca 2+ im Ringer-Puffer erleichterte das Nachfüllen des ER, das in der Intensitätsgewinnung nach der Grundlinie reflektiert wurde. Inset-Bilder zeigen die Zellen vor und nach der Behandlung mit 4-cmc. SNR wurde mit 4,3 ± 0,8 berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Abnahme von [Ca 2+ ] ER mit der reversiblen SERCA pUmp-Inhibitor CPA in HEK293-Zellen. ( A ) Die Hemmung der SERCA-Pumpe durch CPA. ( B ) Live-Imaging von HEK293-Zellen, transfiziert mit CatchER + , lokalisiert im ER, behandelt mit 15 μM CPA. Da Ca 2+ trotzdem durch die IP 3 R und RyR fließen kann, führt die Blockierung der SERCA-Pumpe mit CPA zu einer Abnahme der normalisierten Fluoreszenzintensität, die direkt mit einer Abnahme von [Ca 2+ ] ER korreliert. N bezieht sich auf die Anzahl der abgebildeten Zellen. Inset-Bilder sind HEK293-Zellen, die vor und nach der Behandlung mit CatchER + transfiziert wurden. Die durchschnittliche Signalabnahme betrug 21,0 ± 0,3%. Die Anwesenheit von 1,8 mM Ca 2+ im Ringer-Puffer erleichterte das Nachfüllen des ER, das in der Intensitätsgewinnung nach der Grundlinie reflektiert wurde. SNR wurde mit 5,5 ± 0,8 berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehendiese Figur.
Abbildung 3: ATP verringert [Ca 2+ ] ER in HEK293-Zellen. ( A ) Schema der indirekten Aktivierung von IP 3 R mit ATP durch den purinergischen Rezeptor P2YR. P2YR ist ein GPCR, der IP 3 bei der ATP-Bindung erzeugt. Die IP 3 aktiviert die IP 3 R und stimuliert die Calciumfreisetzung aus dem ER. ( B ) Echtzeit-Bildgebung von HEK293-Zellen, transfiziert mit CatchER + , lokalisiert im ER, behandelt mit 200 μM ATP. Indirekte Stimulation der IP 3 R über den P2Y-Rezeptor mit ATP bewirkt eine Abnahme der normalisierten Fluoreszenzintensität, die direkt mit einer Abnahme von [Ca 2+ ] ER korreliert. N bezieht sich auf die Anzahl der abgebildeten Zellen. Die durchschnittliche Signalabnahme betrug 6,0 ± 3,0%. SNR war cAlzuliert auf 6,7 ± 2,7. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: In situ K d von CatchER + in C2C12 Myoblastzellen. Repräsentative Spur für normalisierte Intensität, die aus permeabilisierten C2C12-Myoblastzellen gesammelt wurde, die mit CatchER + transfiziert wurden. Die Zellen wurden mit 0,005% Saponin in intrazellulärem Puffer für 15-30 s permeabilisiert. EGTA- und Ca 2+ -Lösungen wurden in KCl-Puffer hergestellt, n bezieht sich auf die Anzahl der abgebildeten Zellen. ( A ) Inset Fluoreszenzbilder sind repräsentativ für Zellen vor und nach der Behandlung. 0,3, 0,6, 2, 5, 10, 20, 50 und 100 mM Ca 2+ wurden zu permeabilisierten C2C12-Myoblastenzellen in Gegenwart von 10 & mgr; M zugegebenIonomycin, um ein K d von 3,1 ± 1,4 mM zu erhalten. ( B ) Inset-Fluoreszenzbilder sind repräsentativ für Zellen bei minimalen und maximalen Werten nach Zugabe von 1 mM EGTA und 100 mM Ca 2+ mit jeweils 10 μM Ionomycin. Das basale Ca 2+ wurde mit 0,4 ± 0,2 mM berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Live-Einzelzell-Bildgebung von fluoreszierenden Sonden wie CatchER + ist eine effektive Technik zur Analyse komplizierter ER / SR Ca 2+ -Signalisierungsprozesse in jeder Zelle als Reaktion auf Rezeptor-Agonisten oder -Antagonisten. Diese Technik eignet sich auch für die Bildgebung unter Verwendung von mehreren Wellenlängen gleichzeitig, wie sie für Fura-2 benötigt werden, oder um Catcher + und Rhod-2 zusammen zu bilden, um sowohl ER- als auch cytosolische Calciumänderungen zu überwachen. Es gibt mehrere kritische Schritte in diesem Protokoll; Zell-Transfektion kann einen großen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Bildgebung haben. Niedrige Transfektionsraten können zu einer unzureichenden Expression des GECI zur Überwachung von Calciumreaktionen führen. Auf der anderen Seite hat die Überexpression von Catcher + keinen Pufferungseffekt auf ER / ER Ca 2+ , ein Problem, das mit synthetischen Calciumfarbstoffen verbunden ist. Pufferwirkungen von Ca 2+ -Sonden werden durch die [Ca 2+ ] in der Organelle beeinflusst, die K d der pRobe und die Konzentration der Sonde, die für die Messung erforderlich ist. Cytosol [Ca 2+ ] liegt typischerweise im niedrigen Nanomolarbereich, jedoch ist die erforderliche Sondenkonzentration in einem vergleichbaren Bereich. In diesem Fall war die Menge an Farbstoffkonzentration und ihre Fähigkeit zum Puffern von zytosolischem Calcium und ist ein Hauptanliegen für die zelluläre Bildgebung. Im Gegensatz dazu ist ER / SR [Ca 2+ ] in den 100s von mikromolaren bis millimolaren Bereich 31, wie wir für verschiedene Säugetierzelllinien 25 bestimmt haben . Da 0,1-1 μM Expression von CatchER + ausreicht, um die Erkennung von ER-Calcium zu ermöglichen, ist die Pufferwirkung von Catcher vernachlässigbar. So kann CatchER + den Ca 2+ - Fluss in hohen [Ca 2+ ] - Umgebungen ohne Pufferung auf luminales ER / SR Ca 2+ 32 überwachen.
Mehrere Faktoren können die Transfektionseffizienz des GECI beeinflussen, wie die Inkubationszeit, thE-Transfektionsreagenz, die Inkubationstemperatur und die Zellkonfluenz. Die Zellkonfluenz, wenn die Zellen auf der Folie ausgesät werden, kann die Bildqualität beeinträchtigen. Eine geringe Konfluenz kann zu einer geringen Anzahl von Zellen (n) und weniger statistischer Genauigkeit führen, während hohe Konfluenzgrade zu überlappenden Schichten von Zellen führen, die große Variablen in der Bildgebung erzeugen. Die Zeit und die Temperatur für die Transfektion sollten auf der Basis des Zelltyps optimiert werden. Darüber hinaus ist die Zugabe von DMEM mit reduziertem Serummedium für längere Transfektionszeiten optimal, um Apoptose zu verhindern. Die ursprüngliche GECI-Catcher-Fluoreszenz in Säugetierzellen, wenn sie kultiviert und transfiziert wurde, betrug nur 30 ° C. Die Fluoreszenz von CatchER wurde erfolgreich optimiert und für die Expression bei 37 ° C verbessert, was zu der neuen, verbesserten Variante CatchER + führte. Ein Western-Blot unter Verwendung eines Antikörpers gegen EGFP kann durchgeführt werden, um die Expression der Ca 2+ -Sonde zu bestätigen.
Außerdem das ichThod und Konsistenz der Reagenzabgabe ist entscheidend. Reagenzien können der Kammer durch Perfusion, kleine Volumendiffusion oder durch mechanische Pumpen hinzugefügt werden, die alle unterschiedliche Reaktionen hervorrufen können. Es ist zwingend erforderlich, dass die Lösungskammer ordnungsgemäß abgedichtet wird, indem eine Schicht aus Dichtungsfett auf den Boden der Kammer aufgebracht wird, die auf den Schlitten aufgesetzt wird. Für die Sonde müssen die richtigen Wellenlängen gewählt werden. Anregungs- und Emissionswellenlängen für CatchER + sind 395/488 nm bzw. 510 nm. Für die Zellbildgebung werden nur 488 nm zur Anregung verwendet, um die nachteilige Wirkung von UV-Licht auf Zellen zu vermeiden. Daher wäre die Verwendung von optischen Filtern, die bei 488 nm anregen und die Emission bei 510 nm sammeln, für die Verwendung mit CatchER + akzeptabel. Zur Vermeidung von Photobleichen können Anstrengungen zur Optimierung der Lichtintensität und Lichtbelastung wie Rahmen / s 33 fokussiert werden.
Während dieses Protokoll ist ideal, um die eff zu analysierenEct von ER / SR-Änderungen mit CatchER + Ca 2+ ER / SR Fluoreszenzsonde, gibt es Einschränkungen wie erwartet in jedem Experiment. Da die Einzelzell-Live-Bildgebung nur einen kleinen Rahmen von Zellen analysiert, kann die Anzahl der Zellen (n) von 1-100 Zellen im Durchschnitt variieren, kann aber für größere Zelllinien niedriger sein. Dies führt zu niedrigeren Zellzahlen und statistisch unterschiedlichen Ergebnissen ohne Mehrfachversuche. Für die statistische Genauigkeit ist ein n> 6 erforderlich. Um eine größere n zu bekommen, müssen viele Gerichte abgebildet werden oder andere Techniken müssen gleichzeitig verwendet werden. Darüber hinaus ist CatchER + eine einzeilige ER / SR Ca 2+ Sonde, dies führt zu den Problemen anderer Ein-Wellenlängen-Sonden und Farbstoffen, ohne das Signal nicht quantifizieren zu können, ohne zu wissen, ob das Signal im Gegensatz zur Störung der Zellen wahr ist Artefakt und mit größerem Rauschen im Vergleich zu ratiometrischen Systemen 34 .
Diese Arbeit zeigt, dass diese optimierten Ca 2+ Sonden könnenIn verschiedenen Zelltypen oder Gewebetypen angewendet werden, um die Rezeptor-vermittelte ER / SR Ca 2+ Freisetzung zu überwachen. Catcher + ist eine einzeilige ER / SR Ca 2+ Sonde. Daher ist es wichtig, dass die experimentellen Parameter und Einstellungen für die quantitative Messung konsistent sind. Eine detaillierte Kalibrierung der Calciumkonzentration und K d des Calciumsensors in den Zelllinien sind weitere wichtige Messungen für die quantitative Analyse.
Diese entwickelten Kalziumsensoren können auch auf bestimmte Orte innerhalb des ER / SR ausgerichtet werden, um die sehr unterschiedlichen Ca 2+ Transienten zu überwachen, die im Vergleich zu globalen Ca 2+ Veränderungen in verschiedenen biologischen und pathologischen Zuständen bestehen. Diese Erkenntnisse werden weiterhin die Felder der Ca 2+ -Bildgebung und des Sondenentwurfs vorantreiben, um zukünftige Werkzeuge zur Diagnose von Ca 2+ -bezogenen Krankheiten bereitzustellen. Die gemeldeten Protokolle und der entwickelte Sensor können auch für das Medikament d angepasst werdenIscoveries gegen Krankheiten, die mit der Calcium-Signalisierung verbunden sind.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde gefördert von NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant und einem NIH Supplemental Grant an FR, BB-Stipendium an CM, CDT-Stipendium an RG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 | |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 | |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 | |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 | |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 | |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 | |
| Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm | Fisher Scientific | 12-544B | |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 | |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 | |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 | |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 | |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 | |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 | |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 | |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10x) | ThermoFisher | 15090046 |
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