Optisk koherenstomografi: Imaging mus Retinal Ganglion celler In Vivo

Summary

Detta manuskript beskriver ett protokoll för den in-vivo imaging av mus näthinnan med högupplösta spektrala domänen optisk koherenstomografi (SD-okt). Den fokuserar på retinala ganglionceller (RGC) i peripapillary regionen, med flera scanning och kvantifiera metoder beskrivs.

Abstract

Strukturella förändringar i näthinnan är gemensamma manifestationer av oftalmologiska sjukdomar. Optisk koherenstomografi (OCT) gör deras identifiering i vivo— snabbt, upprepande och i hög upplösning. Det här protokollet beskriver OCT imaging i mus näthinnan som ett kraftfullt verktyg att studera fiberoptiska neuropatier (OPN). Systemets OCT är ett interferometri-baserad, icke-invasiva alternativ till vanlig besiktning histologiska analyser. Det ger en snabb och korrekt bedömning av retinal tjocklek, möjlighet att spåra ändringar, till exempel retinal gallring eller förtjockning. Vi presenterar den imaging process och analys med exemplet av raden Opa1^delTTAG mus. Tre typer av skanningar föreslås, med två metoder för kvantifiering: standard och hemmagjord bromsok. Det senare är bäst för användning på peripapillary näthinnan under radiella skanningar; att vara mer exakt, är att föredra för att analysera tunnare strukturer. Alla metoder som beskrivs här är designade för retinala ganglionceller (RGC) men är lätt att anpassa till andra cellpopulationer. Sammanfattningsvis, OCT är effektiv i mus modell fenotypning och har potential att användas för tillförlitlig utvärdering av terapeutiska interventioner.

Introduction

OCT är ett diagnostiskt verktyg som underlättar granskningen av retinal strukturer¹, inklusive synnervspapillen (ONH). Under åren har det blivit en pålitlig indikator för sjukdomsprogression i människor^2,3, liksom i gnagare^4,5. Det använder interferometri för att skapa tvärsnittsdata bilder av näthinnans skikt 2 µm axiella upplösning. Det innersta lagret är retinal nerve fiber lager (RNFL), som innehåller RGC axoner, som följs av det ganglion celllagrar (GCL), som innehåller mestadels RGC organ. Nästa är det inre plexiform lagret (IPL), där RGC dendriter möts bipolär, horisontella och amakrina celler axoner. Dessa, tillsammans med horisontella celler, bildar det inre nukleära lagret (INL) och deras utskjutande delar ansluta med ljusmätare axoner i det yttre plexiform lagret (OPL). Detta följs av det yttre nukleära lagret (v), med ljusmätare cell organ, och är separerad från ljusmätare lagret av det yttre begränsande membranet (OLM), även kallad inre segment/yttre segmentet (IS / OS) lager. Slutligen är de sista observerbara lagrarna i mus näthinnan pigmentepitelet (RPE) och åderhinnan (C). RNFL ensam är normalt för tunn för att mätas i möss; analysera de RNFL/GCL istället är alltså att föredra^4,5. En annan möjlighet är den GC komplexa lager, som innehåller den senare utöver IPL, gör det tjockare och därmed ännu lättare att mäta på OCT File⁴. OCT kan följaktligen ge inblick i patologiskt status av näthinnan, såsom i OPNs.

Alternativt, tjockleken på mus näthinnan analyseras ofta med besiktning histologi. Men kan inte denna teknik ansikten begränsningar som rör vävnad samling, fixering, skärning, färgning, montering, etc. därför vissa defekter, såsom subtila tjocklek förändringar, identifieras. Slutligen, eftersom samma mus inte kan testas på flera tid pekar, antalet djur per studera kraftigt ökar, till skillnad från för ULT-länder. Alla, icke-invasivt, högupplöst, möjligheten för repetition, övervakning i tid och användarvänlighet av OCT tekniken gör den metoden för val i näthinnesjukdom studier.

Mus-modeller används för att identifiera genen defekter och att klarlägga molekylära mekanismer bakom retinopati⁶. OPN är en form av retinopati med verklig skada på synnerven (på), som består av ungefärligt 1.2 miljon RGC axoner. OPN kan inriktas på ON eller kan vara sekundärt till andra sjukdomar, medfödda eller inte⁷, leder till synfältsbortfall och senare, blindhet. Karakteristiska drag av OPN är RGC förlust och skador, som kan observeras i mänskliga okt som RNFL och GCL gallring^2,3. Samtidigt patofysiologin av OPN är fortfarande bristfällig och därmed behovet av att testa musen näthinnor förblir.

Detta manuskript beskriver imaging och kvantifiering av retinal skiktets tjocklek, med exemplet av Opa1^delTTAG mus linje^8,9, en modell av dominerande Optikusatrofi (DOA)¹⁰. För att bedöma RGC patofysiologi, kvantifierades radiell, rektangulär och ringformiga skanningar. Detta gjordes med standard bromsok som tillhandahålls av programvaran OCT eller med en hemmagjord makro som utvecklats för en öppen källkod bild bearbetningsprogram. Standard oken är svåra att manipulera och ofta tjockare än RNFL/GCL, medan hemmagjord oken är lätt att använda, reproducerbar och mer exakt. Makrot utför en mätning för ett automatiskt identifierade lager, i 5 Poäng och på fasta positioner, på båda sidor av ONH i peripapillary regionen. Målet med protokollet presenterade är att beskriva OCT scan förvärv för att ange retinal positionering, med fokus på RGCs.

Protocol

experimentella protokollet godkändes av den Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm; Montpellier, Frankrike), är förenligt med de europeiska direktiven, och överensstämmer med uttrycket ARVO för användning av djur i oftalmologiska forskning. Det genomfördes enligt avtalet av Languedoc Roussillon hövlighet av etik i djur experiment (CEEALR; nuCEEA-LR-12123).

1. utrustning Setup och före imaging förberedelse

Obs: här, OCT utfördes på mus näthinnor med spektrala domain (SD) oftalmologiska imaging system ( figur 1A). SD-okt apparaten består av en bas och en djur imaging fäste (AIM) med en gnagare justering skede (RAS) ( figur 1B). Basen innehåller datorn, OCT motorn, SD-okt sonden och mus-specifika objektivet. Sonden är monterade på syftet, vilket inkluderar Z-översättaren. RAS används för mus positionering tack vare tabellen med X - och Y-översättaren, kassett som kan vridas och vridas, och baren flyttbara bettet med näsan bandet. Den programvara som tillhandahålls av tillverkaren möjliggör förvärv och analys av OCT filer, även om den senare kan också göras med en öppen bild bearbetningsprogram.

1. Fast placera sonden i målet.
2. Ansluta mus-specifika objektivet till sonden.
3. Justera referens arm inställningarna för specifika objektivet (här, effekt vid 086 och position på 964).
4. För att se till att mus-specifika objektivet är tillräckligt långt från kassett, bifoga baren bita näsan bandet på kassett.
   Obs: Avståndet mellan linsen och kassetten kan justeras med Z-översättare skruven, sitter bakpå syftet. Näsa bandet är en kommersiellt tillgänglig resårband, och dess spänning bör anpassas beroende på storleken på musen.
5. Aktivera strömförsörjningen (nedre högra hörnet av vagnen) och sedan datorn.
6. Att starta bildprogrammet, dubbelklicka på genvägen till lämpliga på skärmen.
   Obs: Detta beror på vilken typ av lins; här, mus näthinnan.
7. Skapa en ny klinisk studie och lägga till de önskade protokollen. Annars kan du använda den befintliga kliniska studie eller protokoll.
   1. Lägg till en ny studie genom att välja de " studera NameŔ " IDŔ " behandling Arm specifikationer " (här, " Uncategorized "); och fördefinierade " Skanna protokoll ", om de finns.
8. Välj en " examinator " i den " klinisk studie " avsnitt.
   Obs: för en ny " examinator ", gå till " Setup examinatorer & läkare " att definiera den.
9. Lägg till en ny Patient i Patient/examen avsnitt genom att klicka på Lägg till Patient; in de " ID ", " namn ", " efternamn ", " sex ", och " födelsedatum " (tillval).
   Obs: Gör detta precis innan testning varje mus, om mer bekväm. Kontrollera att ID är längre än 10 tecken. För musen, brytningsfel på båda ögonen är 0 och axiell längd är 23,0.
10. Klicka på " lägga till tentamen " och välj önskad " protokoll " genom att lägga till " förinställda File " listan börjar med ögat som kommer att mätas först (här, höger öga), eller genom att anpassa skanningar.
11. Att anpassa en scan, antingen använda en befintlig scan som mall och redigera den eller skapa det från början genom den " lägga till Anpassad skanning " alternativet. Efter att alla skannar till listan, definiera ett nytt protokoll med den " Enter " nya protokollnamn " alternativ (OS: oculus sinister, vänster öga; OD: oculus dexter, höger öga).
    Obs: Här protokollet innebär tre skanningar: (i) en radiell scan, med en 1,4 mm i diameter, 0 mm horisontella och vertikala förskjutningar, 1000 rader av A-skanningar/B-scan, 100 B-skanningar/volym, 1 frame/B-scan, 80 linjer av inaktiva A-skanningar/B-scan och 1 volym; (ii) en rektangulär scan, med en 1,4 mm längd och bredd, 0° vinkel, 0 mm horisontella och vertikala förskjutningar, 1000 rader av A-skanningar/B-scan, 100 B-skanningar, 1 frame/B-scan, 80 linjer av inaktiva A-skanningar/B-scan och 1 volym; och (iii) en ringformig skanna, med en 0,4 mm minsta och 0.6-mm diameter, 0 mm horisontella och vertikala förskjutningar, 1000 rader av A-skanningar/B-scan, 3 B-skanningar/volym, 48 ramar/B-scan, 80 rader av inaktiva A-skanningar/B-scan och 1 volym.

2. Mus förberedelse

1. Eye dilatation och immobilisering
   1. minst 15 min innan datainsamling, ingjuta ögondroppar 10% fenylefrin in mus ögon, ta bort överskottet och ingjuta ögondroppar 0,5% Tropikamid.
      Obs: Den första dilatation kan göras på en gång för alla möss som kommer att testas i sessionen. Kontrollera att vätskor vid rumstemperatur.
   2. Omedelbart efter inducerande narkos (steg 2.2), administrera 0,4% Oxibuprokain hydroklorid ögondroppar, håller dem på plats för 3 s att söva och immobilisera ögonen. Efteråt, torka av dropparna och upprepa instillationen av 10% fenylefrin och 0,5% Tropikamid att kontrollera att ögonen är väl dilaterade.
      Notera: Se till att vätskorna är vid rumstemperatur och att musen inte svälja Oxibuprokain.
2. Narkos
   1. förbereda ett bedövningsmedel lösning av ketamin (20 mg/mL) och xylazin (1,17 mg/mL) i saltlösning. Förvaras vid 4 ° C i högst 2 veckor.
   2. Ca 5 min innan testning, intraperitonealt injicera 5-10 µL av bedövningsmedel lösning per 1 g av kroppsmassa, beroende på ålder och storlek av musen.
      Obs: Ung och/eller tunn möss behöver mindre bedövningsmedel, ta mindre tid att söva, men också väcka snabbare. Här, 8 µL/g (160 mg/kg av ketamin, 9,33 mg/kg av xylazin).
   3. Du kan också smörja ögonen med trögflytande ögondroppar eller en oftalmologiska gel för att undvika korneal torrhet.

3. Mus positionering

1. smörj ögon med trögflytande glykol-baserade ögat sjunker till ge korneal hydrering.
   Obs: Om ögonen verkar torr under tentamen, återapplicera ögondropparna.
2. Linda musen i ett ark av kirurgiska kompress att hålla den varm.
3. Använda en svamp eller bomull veke, applicera ett tunt lager av en oftalmologiska gel med 0,3% hypromellos på varje öga, för att minimera ljusbrytning, undvika opaciteter och säkert korneal hydrering. Samtidigt göra det, åt ögonfransar och morrhår.
4. Placera musen i kassett, med huvudet rakt och pekande framåt.
5. Försiktigt öppna bett bar klämman och placera baren i munnen; Använd näsan bandet för att säkra positionen.
   Anmärkning: Se till att bita baren är i mitten av kassett.
6. Plats en bomull rulla under till höger (vänster) om höger (vänster) öga testas.
7. Samtidigt att clip-on syftar spetsen på mus-specifika objektivet, ta mot ögat genom att rotera Z-översättare skruven moturs.
8. Av roterande och justerbart kassetten och genom att vrida bita baren och X-översättare skruvar, förinställda positionen för musen, målet är att ha högra öga utseende direkt in i linsen, och därmed anpassa optiska axlarna av ögonen och linsen.
   Obs: Om musen är för hög eller för låg, Y-översättare skruven ska användas först.
9. Välja den första sökningen i den " examen ", klicka på " börja sikta ", och göra ytterligare manuella justeringar för retinal imaging.
   1. Med Z-översättare skruven, flytta näthinnan vertikalt på den vänstra panelen ( bild 2, horisontell B-scan justering) och horisontellt på right panel ( bild 2, vertikala B-scan anpassning).
   2. Rotera kassett att föra ONH mitt i den högra panelen genom att flytta ONH uppåt eller nedåt. Använd den bita bar skruven att räta ut näthinnan på den högra panelen. Vridbar kassetten när du placerar ONH i mitten av den vänstra panelen.
   3. Använda X-översättare skruven till nivå näthinnan på den vänstra panelen. Med tanke på den stora funktionen av varje modulator, ytterligare justera positionen på näthinnan att centralisera ONH.
      Obs: Använd Y-översättare skruven för att flytta ONH upp och ner på den högra panelen, vid behov. Positionen kan förfinas när som helst mellan skanningar.

4. SD-okt Imaging av ONH och Retina

1. när innehåll med justeringar, klickar du på " börja Snapshot " att börja SD-okt skanning.
   1. Om det inte krävs en 3D imaging, avmarkera alternativet OCU.
2. Spara sökningen och rapporten.
3. Fortsätt med nästa skanningar.
4. För att bild det andra ögat, efter Upprullningskraften linsen, vänd kassetten med detta och upprepa steg 3,6-4.3.

5. Förvärv avslutad

1. när förvärvet är klar, ta bort musen från kassetten, applicera oftalmologiska gel med 0,3% hypromellos till varje öga, och Placera musen på en värmeplattan till vaknar
2. Efter senaste förvärvet, stänga programmet och Stäng av datorn och OCT maskinen (leverans strömknappen).
3. Rengör kassett med desinfektionsmedel.

6. Analys

1. för näthinnans skikt tjockleksmätning, använda automatiserad segmentering programvaran som tillhandahålls av tillverkaren.
   1. Klicka på den " patienten ", Välj önskad " examen " från sedan lista, och klicka på den " i examen " alternativet.
   2. Ladda önskad OCT data på OCT programvaran genom att högerklicka på mappikonen i önskad scan.
   3. Höger klicka på B-Skanna; konfigurera oken genom att aktivera upp till 10 mäta bromsok; och ange deras namn, vinklar och färger.
   4. Att välja önskad klaven genom en att högerklicka på B-scan, placera den med detta på näthinnan för mätning.
      Obs: För skanningar centrerad på ONH, ange 5 bromsok på varje sida av det, lika långt från varandra. Kontrollera att klaven inte är placerad för långt från ONH peripapillary analysen. För radiella skanning, analysera 10 bilder per skanning som valdes ut av programvaran OCT. Deras antal kan hittas i den " rapporter " mapp.
   5. Spara resultaten för analys i ett kalkylprogram för programvara genom att högerklicka på B-scan och klicka " Spara resultaten ".
      Obs: Resultaten kan hittas i samma mapp som scanning data.
2. Alternativt använda makrot hemmagjord bromsok, " MRI näthinnan verktyg ", utvecklade för en öppen källkod bild bearbetningsprogram (se tabell av materialen).
   1. Se till att den " MRI näthinnan verktyg " och " ändra avsnittet polygonverktyget " makron är aktiva. Läsa in bilden. Klicka på knappen m att starta mätningen.
      Obs: Makrot skapas automatiskt en 0,2 mm långa mäta kassett på båda sidor av ONH. Varje kassett innehåller 5 mätpunkter som fungerar som bromsok. Deras sidoläge är oföränderlig och är anpassad för peripapilla i de radiella genomsökningar. Den horisontella positionen av korgarna är fördefinierade för att mäta RNFL/GCL tjockleken, men det är lätt modifierbara att mäta GC komplexa lagret istället. Om scan kvaliteten är dålig, den horisontella positionen behöver justeras eller bilden behöver undantas från analysen.
   2. För horisontell justering, klicka på e-knappen. I det nyöppnade " ROI Manager " fönster, välja den första kassetten.
   3. Klicka på den blå polygonen knappen och justera positionen för den första kassetten genom att klicka på gränsar av det uppmätta lagret i bilden.
   4. Upprepa för andra kassetten genom första att välja det i den " ROI Manager " fönstret och sedan klicka på en lämplig avbildning. Klicka på knappen r för att åter mäta. Visa resultaten i den " mätningar " fönster.
      Obs: Resultaten kan kopieras till ett kalkylblad program som helst. De innehåller följande värden för den rätt kassett (r) och vänster kassett (l) totalt: Intden - integrerad täthet inom kassett; Område: område av mätningen, i mm ². Len: längden på klaven inom kassett, i mm. Medelvärde: menar intensitet av signalen inom kassett; och Std: standardfel på genomsnittliga intensiteten i signalen.
   5. Fortsätt med nästa bild.
   6. Ytterligare analysera data i ett kalkylbladsprogram.
      Obs: För att hitta den genomsnittliga tjockleken på lagret, ta tio Len värden.

Representative Results

SD-okt tekniken möjliggör retinal föreställa och tjocklek analys som är jämförbar med histologi, men är snabbare och mer detaljerad (figur 3). Som presenteras med vildtyp C57Bl/6 möss, även om kvaliteten på en SD-okt scan (figur 3A, höger) är inte lika bra som en bild av en retinal tvärsnitt (figur 3A, vänster), det visualiserar fler lager (t.ex. OLM). Dessutom tar det bara ca 40 min, inklusive mus beredning, jämfört med dagar eller veckor för histologisk analys. Slutligen, det kräver inte behandling och färgning, exempelvis hematoxylin eosin och saffran, vilket kan skada vävnad och orsaka insamling av felaktiga data. De retinala lagrarna enkelt mätbara i okt omfatta den RNFL/GCL, IPL, INL, OPL, Onlinekanaler, IS / OS, RPE och C (figur 3B), därför möjliggör en komplex undersökning av hela näthinnan. Som sådan, återspeglar strukturella retinala förändringar sjukdomsutvecklingen. När det gäller OPNs gäller detta RGCs på, och således RNFL/GCL och IPL.

DOA är en av de vanligaste OPNs och kännetecknas av RGC degeneration och förlust av RNFL¹¹. På grund av mutationer i genen OPA1 ¹²leder det till synnedsättning och blindhet. Med Opa1^delTTAG musmodell som bär mänskliga återkommande c.2708delTTAG mutationen, upptäckte man att Opa1 haplo-insufficiens hindrar vision i en sex-beroende sätt^8,9. Detta fastställdes på grundval av OCT mätningar av retinal tjocklek, som visade en progressiv förtjockning av GC komplexa lagret (figur 4A) och peripapillary RNFL (figur 4B, 4 C) i Opa1^{+ /} honor. I dessa experiment gjorda beräkningarna med standard oken för rektangulära skanningar och med en öppen bild bearbetningen program för ringformig skanningar. För radiella skanningar, vilka ofta är av lägre kvalitet och producera ett minimum av 10 bilder per näthinnan för analys, en hemmagjord makro utvecklades. En jämförelse mellan standard och hemmagjord oken (figur 4 d) visade en signifikant lägre tjocklek av RNFL/GCL och GC komplexa lager mätt med den senare. Detta beror på att standarden oken är mycket tjockare och svårare att placera på gränsen till lagret. Därför är det bäst att undvika att använda standard oken för tunna lager, särskilt på radiella genomsökningar.

Sammanfattningsvis möjliggör SD-ULT mus visuella fenotypning som kan upprepas över flera tidpunkter. Dock måste den OCT skanningstypen och mätmetod anpassas till de undersökta sjukdomen, och därmed det retinala lagret i fråga. Ändå, OCT ger tillräcklig information för att identifiera brister i näthinnans struktur. Men måste detta ytterligare analyseras med en annan metod för att ge en fullständig förståelse av de bakomliggande mekanismerna.

Figur 1: SD-okt oftalmologiska Imaging System. (A) Översikt över basen och syfte-RAS delar av SD-okt enheten. (B) översikt av mål-RAS komponenter. A: datorn, B: strömförsörjning, C: OCT motor referens arm, D: SD-okt sond, E: mus-specifika objektivet, F: Z-översättare, G: AIM-RAS bord, H: Y-översättare, I: kassett (rotatorkuffen), J: bita bar, K – näsa band, L: kassett vridbar, M: X-översättare och N: siktar spets. Denna figute är färgkodade som i figur 2, med icke-modulatorer av retinal position markeras i rosa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: placering näthinnan. Horisontell (vänster) och vertikala (höger) syn på B-scan justeringen. Pilarna motsvarar rörelser induceras av de färgkodade modulatorer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: näthinnans skikt. (A) vildtyp mus näthinnan histologi efter hematoxylin eosin, och saffran färgning (vänster) och SD-okt (höger); skalstapeln: 50 µm. (B) Retinal tjocklek mätningar för 3 månader gamla vildtyp möss; n = 14, menar ± SEM, skalstapeln: 50 µm. GC: ganglion celler, RNFL/GCL: retinala nervfiber skikt/ganglion celllagrar, IPL: inre plexiform lagret, INL: inre nukleära lagret, OPL: yttre plexiform lagret, ONL: yttre nukleära lagret, IS / OS: ljusmätare inre segment/yttre segment, RPE: pigmentepitelet och C: åderhinnan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: exemplariskt SD-okt mätningar. (A), GC komplexa skiktets tjocklek i rektangulära genomsökningar centrerad på den ONH, mätt med standard oken; Opa1^delTTAG mus linje, n = 4, menar ± SEM, ** p < 0,01 bedömas med Students t-test. (B) Peripapillary RNFL i SD-okt (C) Peripapillary RNFL tjocklek i ringformig genomsökningar, bestäms som RNFL område beräkningen per fält; Opa1^delTTAG honmöss, n = 5-11, menar ± SEM, * p < 0,05 bedöms med Students t-test. (D) RNFL/GCL och GC komplexa skikttjocklek i radiell genomsökningar, mätt med standard eller hemmagjord oken för 3 eller 10 skanningar, respektive; vildtyp möss, n = 8, menar ± SEM, ** p < 0,01, *** p < 0,001 bedömas med Students t-test. RNFL/GCL - retinala nervfiber skikt/ganglion celllagrar, GC: ganglion celler. Siffror A-C anpassad från Sarzi et al. ⁹. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Discussion

OCT systemet, en icke-invasiv i vivo imaging metod, ger högupplöst retinal Cross-Country-section-liknande sökningar. Således är dess största fördel dess potential för detaljerad analys, med en underbar möjlighet att införliva protokoll rutinmässigt tillämpas på människor till musmodeller.

I exemplet med Opa1^delTTAG muterade möss resultat SD-okt visade en ökning av RNFL och GC komplexa skiktets tjocklek, som möjliggjorde ytterligare utforskning av DOA patofysiologi⁹. Det hade inte varit möjligt enbart med histologisk analys. I jämförelse ger histologi inte möjlighet att visualisera hela näthinnan, till skillnad från ringformig eller radiella OCT skanningar. Dessutom är det mer tidskrävande och dyrt, med tanke på det ökade antalet djur i studier med flera tidpunkter. I själva verket banade SD-okt väg vittna mot en ny retinal celltyp i DOA, Müller cell⁹. Detta skedde trots att varken encelliga upplösning eller viss cell identifieringar är möjligt med systemet. Tvärtom, räcker tjocklek-fokuserad och/eller allmänna tillstånd-fokuserad analys av peripapillary regionen till stor del att upptäcka cellulära försämring. Ytterligare utredningar med histologi kan sedan utföras med en tydlig idé om vad man ska leta efter. Samma metod kan därför också tillämpas till utvärderingen av terapeutiska interventioner för att förhindra eller bromsa retinal degeneration.

För att ytterligare förbättra nyttan av OCT, Hemmagjord bromsok utvecklades och hade en mycket högre precision än de som är standard. Även om standarden är tjockare än den RNFL/GCL, använda vissa lag den iaf, men för större lager¹³. Här, fokuserade vi den jämförande analysen på RGCs i 10 radial scanningar per näthinnan, alla i peripapillary regionen. RNFL ensam var inte mätbara på radiella genomsökningar Hursomhelst. Detta lager var alltför tunn och vag; Därför värderats den RNFL/GCL och GC komplexa lagret i stället. Samtidigt lyckades vi mäta den RNFL använder ringformig skanningar, som visat sig vara fördelaktigt för mus fenotypning. Tillförlitligheten kan dock kontroversiell. I alla dessa synsätt var det kritiska steget centrera skanningar på ONH och visualisera näthinnan utan skuggor och opaciteter. Den förstnämnda kan enkelt justeras genom att följa stegen i protokollet när det gäller placeringen av näthinnan. Det senare beror på överföringen av hornhinnan och den kristallina. Till exempel om oftalmologiska gelen sprids ojämnt, skanningen är suddiga eller näthinnan visas böjda. För att åtgärda detta, skulle det räcka till ordentligt åter Applicera gelen. Om den kristallin är ogenomskinlig, är skanningen mörk eller ofullständig. Lösningen här vore att upprepa sökningen en annan dag, om insyn i den kristallina returnerar. En annan möjlig orsak för en dålig kvalitet genomsökning är förekomsten av hinder, till exempel morrhår eller ögonfransar. Dessa kan lätt avlägsnas genom att avsätta och tillämpa lite av oftalmologiska gel som håller dem på plats. Andra analytiska metoder som skiljer sig vad gäller utrustningstyp, Skanningstyp, vinkel och andra parametrar finns också och har olika antal analyserade bilder. Detta måste beaktas om resultat är fortfarande inte tillfredsställande. Exempelvis tog Liu et al. radiella skannar flera vinklar¹³, i jämförelse med våra radiella skanningar bara på en, rapportering något tjockare lager. Ändå, OCT förvärv och analytiska metoder som föreslås i detta manuskript är lämpade för att analysera RGCs i peripapillary mus näthinnan.

Sammanfattningsvis, är OCT en teknik med stor potential. Det möjliggör upptäckt av subtila förändringar i näthinnans struktur — inklusive RGCs, särskilt i fråga om OPNs — och bevisar oumbärliga för vision science. Därför är presenteras protokollet praktiska för OPN mus modell fenotypning, samt när det gäller utvärdering av nya behandlingar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
Opa1delTTAG mouse	Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France	-	Opa1 knock-in mice carrying  OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System	Bioptigen, Leica Microsystems, Germany	-	Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software	Bioptigen, Leica Microsystems, Germany	-	Software for OCT acquisition and analysis
ImageJ 1.48v	Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA	-	Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool
Self-regulating heating plate	Bioseb, France	BIO-062	Protection against hypothermia
Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Nose Band	-	-	Elastic band
Gauze pads 3" x 3"	Curad, USA	CUR20434ERB	Protection against hypothermia
Dual Ended Cotton tip applicator	Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA	-	Gel application
Cotton Twists	CentraVet, France	T.7979C.CS	Mouse positioning
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Drugs
Néosynéphrine Faure 10%	Laboratoires Europhtha, Monaco	-	Eye dilatation
Mydriaticum 0.5%	Laboratoires Théa, France	3397908	Eye dilatation
Cebesine 0.4%	Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France	3192342	Local anesthesia
Imalgene 1000	Merial, France/CentraVet, France	IMA004	General anesthesia
Rompun	Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France	ROM001	General anesthesia, analgesia, muscle relaxation
NaCl 0.9%	Laboratoire Osalia, France	103697114	Physiological serum
Systene Ultra	Alcon, Novartis, USA	-	Hydration of eyes
GenTeal'	Alcon, Novartis, USA	-	Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities
Aniospray Surf 29	Laboratoires Anios, France	59844	Desinfectant