Chondrogene Pelletbildung aus Cord Blut-induzierten induzierten pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Hier schlagen wir ein Protokoll für die chondrogene Differenzierung von Nervenblut mononuklearen Zell-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen vor.

Zusammenfassung

Der menschliche Knorpelknorpel fehlt die Fähigkeit, sich selbst zu reparieren. Knorpeldegeneration wird also nicht durch kurative, sondern durch konservative Behandlungen behandelt. Derzeit werden Anstrengungen unternommen, um beschädigten Knorpel mit ex vivo expandierten Chondrozyten oder Knochenmark-abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen (BMSCs) zu regenerieren. Die eingeschränkte Lebensfähigkeit und Instabilität dieser Zellen begrenzen jedoch ihre Anwendung bei der Knorpelrekonstruktion. Menschliche induzierte pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) haben wissenschaftliche Aufmerksamkeit als neue Alternative für regenerative Anwendungen erhalten. Mit unbegrenzter Selbsterneuerungsfähigkeit und Multipotenz wurden hiPSCs als neue Ersatzzellenquelle für die Knorpelreparatur hervorgehoben. Allerdings ist die Erlangung einer hohen Menge an hochwertigen chondrogenen Pellets eine große Herausforderung für ihre klinische Anwendung. In dieser Studie verwendeten wir Embryoidkörper (EB) -geleitete Auswuchszellen für die chondrogene Differenzierung. Die erfolgreiche Chondrogenese wurde durch PCR undD-Färbung mit alcianblauem, Toluidinblau und Antikörpern gegen Kollagenarten I und II (COL1A1 bzw. COL2A1). Wir bieten eine detaillierte Methode zur Differenzierung von Nervenblutmononukleären Zellen-abgeleiteten iPSCs (CBMC-hiPSCs) in chondrogene Pellets.

Einleitung

Die Verwendung von hiPSCs stellt eine neue Strategie für Arzneimittel-Screening und mechanistische Studien verschiedener Krankheiten dar. Aus einer regenerativen Perspektive sind hiPSCs auch eine potentielle Quelle für den Ersatz von beschädigten Geweben, die eine begrenzte Heilfähigkeit aufweisen, wie z.B. Gelenkknorpel ^{1 , 2} .

Die Regeneration des nativen Knorpelknorpels ist seit Jahrzehnten eine Herausforderung. Gelenkknorpel ist ein weiches, weißes Gewebe, das das Ende der Knochen beschichtet und sie vor Reibung schützt. Allerdings hat es begrenzte regenerative Fähigkeit, wenn....

Protokoll

Dieses Protokoll wurde vom institutionellen Überprüfungsausschuss der katholischen Universität von Korea (KC12TISI0861) genehmigt. CBMCs, die für die Umprogrammierung verwendet wurden, wurden direkt von der Cord Blood Bank des Seoul St. Mary's Hospital erhalten.

1. Chondrogene Differenzierung von iPSCs

1. CBMC-iPSC Generation
   1. Generiere CBMC-hiPSCs mit dem in unserer vorherigen Arbeit gezeigten Protokoll ²³ .
   2. Sammle die Blutzellen in einem 15 ml konischen Röhrchen und zähle sie mit einem Hämocytometer.
   3. 3 x 10 ⁵ Zellen vorbereiten und 5 min bei 515 ....

Ergebnisse

In dieser Studie erzeugten wir chondrogene Pellets aus CBMC-hiPSCs, indem sie Auswuchszellen aus EBs induzierten. Die chondrogene Differenzierung wurde mit CBMC-hiPSCs mit bestätigter hoher Pluripotenz induziert ¹¹ . Ein einfaches Schema unseres Protokolls ist in Fig. 1A gezeigt . Vor der Differenzierung wurden iPSC-Kolonien erweitert (Abbildung 1B ). Die erweiterten iPSCs wurden als EBs zusammengesetzt, .......

Diskussion

Dieses Protokoll hat erfolgreich HIPSCs von CBMCs generiert. Wir programmierten CBMCs zu hiPSCs unter Verwendung eines Sendai Virusvektors, der Yamanaka Faktoren enthält ²⁴ . Drei Fälle wurden in der Differenzierung verwendet, und alle Experimente erzeugten erfolgreich chondrogene Pellets unter Verwendung dieses Protokolls. Zahlreiche Studien haben Protokolle für die Differenzierung von hiPSCs in Chondrozyten ^{25 , 26 ,}

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Plasticware
100 mm Schale	TPP	93100
6-Well-Platte	TPP	92006
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Einwegpipette	Falcon	7551
5 mL Einwegpipette	Falcon	7543
12-Well-Platte	TPP	92012
Name	Company	Katalognummer	Beschreibung
E8 Medium Materialien
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	E8 Medium (500 mL)
Natriumbicarbonat	Life Technologies	25080-094	E8 Medium (Konz.: 543 μ g/mL)
Natriumselenit	Sigma Aldrich	S5261	E8 Medium  (Konz.: 14 ng/mL)
Humanes Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	E8 Medium (Konz.: 10.7 μ g/mL)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	E8 Medium  (Konz.: 100 ng/mL)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	E8 Medium (Conc.: 20 μ g/mL)
Menschliches TGFβ 1	Peprotech	100-21	E8 Medium (Konzentration: 2 ng/ml)
Ascorbinsäure	Sigma Aldrich	A8960	E8 Medium (Konz.: 64 μ g/mL)
DPBS	Life Technologies	14190-144
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Name<	strong>Company<	strong>Katalognummer	Beschreibung
Quality Control Materials
18 mm Deckglas	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Rinderserum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antikörper	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antikörper	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antikörper	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antikörper	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antikörper	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antikörper	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Antikörper	Molekulare Sonde	A11029
Alexa Fluor 594 Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) Antikörper	Molekulare Sonde	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong Gold Antifading-Reagenz	Invitrogen	P36934
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
Rinderserum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-Kollagen II Antikörper	abcam	ab34712	1:100
Alcian blue	Sigma Aldrich	A3157-10G
Fast Green	FCF Sigma Aldrich	F7252-25G
Safranin O	Sigma Aldrich	090m0039v
Nuclear fast red	Americanmastertech	STNFR100
Xylol	Duksan	115
Ethanol	Duksan	64-17-5
Mayer's Hämatoxylin-Lösung	wako pure chemical industries	LAK7534
DAP	VECTOR LABORATORIES	SK-4100
Objektträgerglas, beschichtet	Hyun il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalkohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid Erststrang-cDNA-Synthesekit	Thermo Scientfic	K1622
Name	Company	Katalognummer	Beschreibung
Chondrogene Differenzierungsmaterialien
DMEM	Life Technologies	11885	Chondroggene Medienkomponente (500 mL)
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333	Chondroggene Medienkomponente (Konz.: 1%)
Ascorbinsäure	Sigma Aldrich	A8960	Chondroggene Medienkomponente (Konz.: 64 μ g/mL)
MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x)	Life Technologies	11140-050	Chondroggene Medienkomponente (Konz.: 100 mM)
rhBMP-2	R& D	355-BM-050	Chondroggene Medienkomponente (Konzentration:100 ng/ml)
Rekombinante Hman TGF-beta3	R& D	243-B3-002	Chondroggene Medienkomponente (Konzentration: 10 ng/ml)
KnockOut Serum Replacement Life	Technologies	10828-028	Chondrogene Medienkomponente (Konzentration: 1%)
ITS+ Premix	BD	354352	Chondrogene Medienkomponente (Konzentration: 1%)
Dexamethason-Wasserlöslich	Sigma Aldrich	D2915-100MG	Chondroggene Medienkomponente (Conc.:10-7 M)
GlutaMAX Supplement	Life Technologies	35050-061	Chondroggene Medienkomponente (Conc.: 1%)
Natriumpyruvatlösung	Sigma Aldrich	S8636	Chondroggene Medienkomponente (Conc.: 1%)
L-Prolin	Sigma Aldrich	P5607-25G	Chondrogene Medien Komponente (40 μ g/ml)