Isolement des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical humain

Résumé

Ce protocole vise à isoler les cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical. Parmi les applications incluent l’utilisation de ces cellules comme biomarqueur pour identifier les patients à risque cardiovasculaire, traitement des maladies ischémiques, et constructions de création valve tissulaire cardiaque et vasculaire.

Résumé

L’existence de cellules endothéliales progénitrices (EPCs) dans le sang périphérique et son implication dans la vasculogénèse a été signalée par Ashara et ses collègues¹. Plus tard, d’autres documenté l’existence de types similaires de EPCs provenant de la moelle osseuse^2,3. Plus récemment, Yoder et Ingram a révélé que EPCs provenant du sang de cordon ombilical avaient un potentiel prolifératif plus élevé par rapport à ceux isolés d’adulte périphérique de sang^4,5,6. En dehors de n’être impliqué en postnatal vasculogénèse, EPCs ont également montré des promesse comme une source de cellules pour créer tissulaire cardiaque et vasculaire vanne constructions^7,8. Il existe différents protocoles d’isolement, dont certaines impliquent le tri cellulaire des cellules mononucléaires (PTM) dérivés les sources mentionnées plus tôt avec l’aide de marqueurs endothéliales et hématopoïétiques, ou cultivant ces multinationales avec la croissance endothéliale spécialisée moyenne, ou une combinaison de ces techniques⁹. Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement et culture des CPE à l’aide spécialisée endothélial additionné de facteurs de croissance, sans utiliser d’immunosorting, suivie de la caractérisation des cellules isolées à l’aide de Western Blot et immunomarquage.

Introduction

Plusieurs chercheurs ont étudié les caractéristiques et le potentiel humain EPCs^{5,10,11,12,13}. CPE peut être qualifiée de circuler les cellules qui ont la capacité d’adhérer aux tissus endothéliales dans les sites d’hypoxie, ischémie, des blessures ou la formation de tumeurs et contribuent à la formation de nouvelles structures vasculaires^4,14. Leur implication observée dans la néovascularisation, sous forme de vasculogénèse postnatal, a conduit à l....

Protocole

cette recherche a été menée avec l’approbation de l’Université de l’Arkansas, Institutional Review Board (numéro d’agrément 16-04-722). Unités de sang de cordon ombilical ont recueilli dans une solution de dextrose (CPD) citrate phosphate à l’Arkansas Cord Blood Bank, et les unités qui ne respectent pas l’obligation de stockage ont été données pour la recherche. Unités de sang de cordon ont été envoyées au laboratoire au sein de la collection à une température ambiante de 24 h.

1. isolement des progénitrices endothéliales de sang de cordon

1. préparation des réactifs.
   1. Préparer EGM en ajoutant le milieu bas....

Résultats

Isolement et l’Expansion des cellules progénitrices endothéliales :
Un schéma (Figure 1) est fourni en décrivant le protocole global. Les couches de composants sanguins différents ont été observés après centrifugation en gradient de densité du sang de cordon ombilical humain avec milieu de gradient de densité. Après ensemencement MNCs sur les plaques imprégnées sur le collagène, l’excroissance des colonies fut observée entre 5 jours et 7 (.......

Discussion

Comme mentionné précédemment, adhérent EPCs possèdent une morphologie pavées. Nos multinationales isolés a progressé d’une colonie de cellules fusiformes (Figure 2A-2D) dans les premiers stades à une colonie de pavées (Figure 2E-2F) sur une période de dix jours de culture. CPE ont été étiquetés différemment par les différents groupes de recherche, à savoir comme fin de cellules progénitrices endothéliales¹⁰

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
A) Pour l’isolement et la culture
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162	Ce produit est livré avec tous les facteurs de croissance nécessaires pour rendre le Croissance endothéliale Medium Fetal
Bovin	Serum Thermofisher Scientific	26140079
Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	Thermofisher Scientific	10378016
Ficoll-Paque	GE Heatlhcare	17-1440-02
Solution saline équilibrée de Hank	Thermofisher Scientific	14170-112
Chlorure d’ammonium	Stem Cell Technologies	7850
1x tampon de phosphate Saline	Thermofisher Scientific	14190250
Rat Tail I Collagen	Corning	354236
Acide acétique glacial	Amresco	0714-500ML
0,05 % Trypsine-EDTA	Thermofisher Scientific	25300054
tampon HEPES	Thermofisher Scientific	15630080
Dulbecco’s Modified Eagle’s	Medium Thermofisher Scientific	10566-016
B) Anticorps et lysats cellulaires
CD31 ;	Abcam	ab28364	dilution 1:250 pour Western blot
CD34	Santa Cruz Biotechnology	sc-7045	dilution 1:100 pour Western blot
&alpha ;-SMA	abcam	ab5694	dilution 1:100 pour Western blot
&alpha ;-tubuline	abcam	ab7291	dilution 1:2 500 pour Western blot
VEGFR2	abcam	sc504	Dilution 1:100 pour Western blot
Lysat de cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine	Santa Cruz Biotechnology	sc24709  ;
		cellules interstitielles valvulaires	Lignée cellulaire primaire cultivée en laboratoire et lysée avec un tampon RIPA
C) Western blot et immunomarquage
10x tampon Tris/Glycine/SDS	Biorad	161-0772	Utilisé comme tampon courant
10x tampon Tris/Glycine	Biorad	161-0771	Utilisé comme tampon de transfert
Membrane de transfert Immobilon-FL	Merck Millipore	IPFL0010	Il s’agit d’une membrane de transfert PVDF qui a 45 & micro ; m taille des pores et est mentionné dans le protocole comme membrane western blot
4x tampon d’échantillon Laemmli	Biorad	161-0747
2-mercaptoéthanol	Biorad	161-0710
10 % Criterion TGX gel préfabriqué	Biorad	5671033
Prolong Gold antifade	Thermofisher Scientific	P36930	Utilisé pour le montage de lamelles immunocolorées pour le stockage à long terme
Méthanol	VWR Analytique	BDH1135-4LP

Lysat de