Summary
Цель настоящего Протокола заключается в изоляции эндотелиальной прогениторных клеток из пуповинной крови. Некоторые из приложений включают, используя эти клетки в качестве биомаркеров для выявления пациентов с сердечно-сосудистого риска, лечение ишемической болезни, и создание ткани инженерии сосудов и сердца клапан конструкций.
Abstract
Существование эндотелиальной прогениторных клеток (ПЭК) в периферической крови и ее участие в vasculogenesis был впервые сообщил Ашара и коллеги-1. Позже другие документированы существование аналогичных типов Пэк, происходящих из костного мозга2,3. Совсем недавно Йодер и Ингрэм, показал, что Пэк вытекает из пуповинной крови был выше пролиферативный потенциал, по сравнению с них изолированы от взрослого периферической крови4,5,6. Помимо участия в послеродовом vasculogenesis, Пэк также показали обещание как источник клеток для создания ткани инженерии сосудов и сердца клапан конструкции7,8. Существуют различные протоколы изоляции, некоторые из которых связаны с сортировки мононуклеарных клеток (МНК), полученные из источников, упомянутых ранее с помощью маркеров эндотелиальной и гемопоэтических клеток, или культивирование эти МНК с специализированный эндотелиальной роста Средний, или сочетание этих методов9. Здесь, мы представляем собой протокол для изоляции и культуры ПЭК с помощью специализированных эндотелиальной среднего дополнена факторов роста, без использования immunosorting, следуют характеристика изолированных клеток, используя Западный blotting и иммуноокрашивания.
Introduction
Некоторые следователи изучили характеристики и потенциал человека Пэк5,10,11,12,13. Пэк может быть описана как циркулирующих клеток, которые имеют возможность присоединиться к эндотелиальной тканей в местах гипоксии, ишемии, травмы или образования опухоли и способствовать формированию новых сосудистых структур4,14. Их наблюдаемых участие в неоваскуляризация, в форме послеродовой vasculogenesis, привело к пониманию патофизиологии этих клеток и их использования в терапевтического применения4,15, 16. количество Пэк в лицо было показано, быть связаны с сердечно-сосудистой патологии9,,1516,,1718,19 ,20. Другие исследования также дифференцированы Пэк в клапан фибробластоподобных фенотип и предложил, что эти клетки могут использоваться для тканевой инженерии сердца клапаны7,21.
Конкретной ячейке поверхности молекул, необходимо изолировать Пэк не были четко определены из-за расхождений между исследования4. Адгезии МНК к матрице, с воздействием различных условий культуры, было выполнено несколько групп1,17,22,23, предполагая, что предполагаемый Пэк может Отображение различных фенотипических свойств. Эти свойства включают в себя отсутствие phagocytotic способности, формирования трубки в Matrigel и поглощение Dil ацетилированные уровня липопротеидов низкой плотности. Два свойства с которой Пэк может быть структурировано5высокий колониеобразования и пролиферативным потенциалом. Пэк могут также образовывать в vitro трубочки, когда cocultured с человеческих легких плода фибробластов4. Эти клетки, как известно, чтобы выразить эндотелиальных клеток поверхностных маркеров и поделиться некоторыми из гемопоэтических маркеры13,24,25. Положительно выраженное маркеров, которые широко принимаются фенотипирование Пэк, CD31, CD34, Сосудистый эндотелиальный фактор роста рецепторов 2 (VEGFR2), Виллебранда фактор (vWF), CD133, c комплект и сосудистого эндотелия Кадгерины (VE-Кадгерины)4 , 18. клетки, которые совместно Экспресс CD90, CD45, CD14, CD115 или альфа гладких мышц актина (α-SMA) не считаются Пэк из-за их ограниченного пролиферативный потенциал, способность фагоцитоз бактерий и неспособности сформировать de novo человека судов в vivo4,7. Эта статья конспектирует измененный Протокол для изоляции клеток эндотелия прародителем от человеческой пуповинной крови без необходимости в любую ячейку Сортировка протоколы. Для этой статьи мы использовали CD31, CD34 и VEGFR2 как положительных маркеров, с α-SMA как отрицательный показатель.
В этой статье мы предлагаем, что метод изоляции и культивирования эндотелиальной прогениторных клеток из пуповинной крови без ячеек, сортировка с использованием специализированных среднего роста эндотелия сосудов, дополнена факторов роста (СГЭ). Этот внеочередного общего собрания акционеров содержит Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и фактор роста фибробластов (ФБП), которые увеличивают миграцию эндотелиальных клеток26выживания и распространения. Она также включает в себя аскорбиновую кислоту, которая отвечает за поддержание булыжником морфологию клеток; инсулиноподобный фактор роста-1 (ИФР-1), которая обеспечивает ангиогенных и мигрирующих функции; и гепарин, который вызывает повышение долгосрочной стабильности факторов роста в среднесрочной26. Другие факторы роста, добавляется эндотелиальных клеток питательной среды включает в себя добавки с эпидермального фактора роста (EGF), который помогает в стимулировании пролиферации и дифференциации и гидрокортизон, который знакомит клетки EGF26 . Мы покажем, что использование этой конкретной роста среднего дает более высокие числа Пэк, по сравнению с эндотелиальной базальной средний (МВБ) или Дульбекко изменение средних орла (DMEM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
это исследование было проведено с одобрения университета Арканзас, институциональных Наблюдательный Совет (номер 16-04-722 утверждения). Были собраны в цитрата фосфат декстрозы (ДСП) на Арканзас пуповинной крови Банк пуповинной крови единиц, и подразделения, которые не отвечают требованию для хранения были пожертвованы для исследований. Пуповинной крови единиц был доставлен в лабораторию в течение 24 часов коллекции при температурах.
1. изоляция эндотелиальной прогениторных клеток из пуповинной крови
- Подготовка реагентов.
- Подготовить EGM, добавив эндотелиальной базальной среднего (МВБ) до 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) дополнены 20 нг/мл инсулина подобный фактор роста (IGF), аскорбиновой кислоты 1 мкг/мл, 5 нг/мл рекомбинантного человеческого эпидермального фактора роста (rhEGF), 22,5 мкг/мл гепарин и 0,5 нг/мл Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), наряду с 10 нг/мл рекомбинантного человеческого фактора роста фибробластов B (rhFGF-B), гидрокортизон 0,2 мкг/мл и 2% пенициллин стрептомицином глутамина. Стерилизовать питательную среду, используя вакуумный фильтр мембраны Полиэфирсульфон (PES) 0,2 мкм.
- Подготовка крысы хвост я коллагена раствор в концентрации 50 мкг/мл, используя 0,02 N уксусной кислоты. Стерилизовать это решение, с помощью шприца фильтра 0,2 мкм.
- До пальто 6-ну пластины с 2 мл подготовленных крысы хвост я коллагена раствор для каждой скважины. Поместите их в инкубаторе, составляла 5% CO 2 и 37 ° C для по крайней мере 1 час перед посевом.
- Разбавить приблизительно 25 мл пуповинной крови с Хэнкс сбалансированный соли раствора (HBSS) в концентрации 1:1.
- Подготовка радио иммуно осадков пробирного буфера (RIPA), используя натрия хлорида 150 мм, 1% X-100 Тритон, Дезоксихолат натрия 0,5%, 1 мм β-метронидазол, 0.1% SDS и 50 мм трис (рН 8,0).
- Изоляции клеток эндотелия прародителю.
- Тепло все подготовленные реагентов на водяной бане, поддерживается при 37 ° C до изоляции.
- Добавить 20 mL реагента градиент средней плотности 50 мл пластиковых пробирок.
- Тщательно слоя 20 мл разбавленной пуповинной крови в пластиковых пробирок, содержащие средний градиент плотности не нарушая этот слой, стремясь пипетки на боковые стенки трубки.
- Отдельные компоненты крови, основанный на их плотности ( рис. 1) центрифугированием на 800 x г за 30 мин при комнатной температуре, с тормоза ротора центрифуги выкл. Не беспокоить различные слои.
- Удалить плазменный слой, тщательно закупорить ее из трубки не нарушая других клеток, которые слои до кончика пипетки сможет достичь НСМ слоя (см. Рисунок 1). Отбросить удалены плазмы.
Примечание: При использовании пипетки советы для удаления плазмы, оставить небольшой слой плазмы выше MNC слоя ( рис. 1), чтобы уменьшить помехи. - Собирать Баффи слой, содержащий МНК, с помощью шприца для 18-иглы и перенести его на свежий пластиковых пробирок.
- Добавить равное количество EBM собранных МНК. Центрифуга эти трубы на 500 x g 10 мин в 4 ° C. удалить супернатант.
Примечание: Гранулы ячейки появится красный ввиду наличия красных кровяных клеток/эритроцитов. - Добавить 5 мл раствора хлорида аммония чтобы лизировать красных кровяных клеток. Инкубировать эту трубку на льду на 5-10 мин, с время от времени встряхивая.
Примечание: Следует проявлять осторожность во время этого шага не превышает продолжительность времени, как это может быть вредным для МНК. - Центрифуга трубы на 500 g x 10 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант. Если сохраняются эритроцитов, повторите шаги 1.2.8 и 1.2.9 до тех пор, пока не красный цвет наблюдается в Пелле.
- Ресуспензируйте гранулы в подготовленных EGM и использовать Горяева для подсчета МНК.
- Аспирата крысы хвост я коллагена покрытием 6-ну пластины (от шага 1.1.3) и Промыть лунки три раза с 1 x фосфат амортизированное saline (PBS).
- Семя MNC Пелле высокомобильна в EGM коллагеновые пластины в концентрации 1 x 10-7 МНК в каждой скважине. Поместите его в 37 ° C, 5% CO 2 инкубатора.
- После 24 ч, аспирационная среднего и Промыть лунки с СГЭ. Добавить 3 мл EGM среды в каждой скважине и поместить его обратно в 37 ° C, 5% CO 2 инкубатора.
- Пополнения пластины с свежими EGM среднего каждый день в течение 7 дней. После 7 дней, изменить EGM среднего каждый день.
- С помощью микроскопа ярко поле, принимать образы пластину 6-ну каждый день для отслеживания прогрессирования колоний эндотелиальных клеток. Марк пластину, где колонии возникают для их роста.
Примечание: Обычно это занимает от 5 до 9 дней для колоний в культуры.
- Расширение клеток эндотелия прародителю.
- Пальто T-25 культуры колбу с крысы хвост я коллагена (50 мкг/мл) и поместите его в 37 ° C, 5% CO 2 инкубатора для по крайней мере 60 мин аспирата и мойте колбу культуры клеток T-25 три раза с ПБС до посева клетки.
- Trypsinize колоний эндотелиальных клеток, когда они достигают около 3 мм в размер с помощью 150 мкл 0,05% раствор трипсина-ЭДТА в каждой скважине. Место пластину 6-Ну обратно в 37 ° C, 5% CO 2 инкубатора для 2-3 мин
- Легко вбейте пластину 6-ну выбить прилагаемый клетки. Сразу же добавить 2 мл внеочередного общего собрания акционеров и восстановить клетки в пластиковых пробирок 15мл.
- Подсчитать ячейки, используя Горяева и рассчитать Начальная плотность посева.
- Отжима центрифуги 15 мл трубки на 400 g x 5 мин Ресуспензируйте Пелле клеток в внеочередного общего собрания акционеров и семян T-25 колбу с ~ 500 000 ячеек. Пометить этот настой как проход 1 и место T-25 колбу обратно в 37 ° C, 5% CO 2 инкубатора.
Примечание: Клетки может быть покрытием EBM и DMEM сравнивать рост с СГЭ. - Для дальнейшего проходы, когда настой достигает 90% слияния, выполните шаги 1.3.1 - 1.3.5 и повторное заполнение ячеек на 10 4 клетки/см 2 фляги культуры клеток T-75 или T-175. Перейти к характеристике изолированных клеток (шаги 2 и 3).
2. Характеристика изолированных клеток с помощью западный Blotting
- Добавить лизис 50-100 мкл буфера на каждый проход, когда после расширения шаги, чтобы характеризовать изолированных клеток. Собирать белки от приблизительно 500 000 или более ячеек.
- Пипетка вверх и вниз энергично разрушения клеток и освободить белки. Собирать и передавать буфер пробки microcentrifuge.
- Спина пробки microcentrifuge на 500 x g и тщательно передать новые пробки microcentrifuge супернатант. Этикетки и хранить трубы на-80 ° C для долгосрочного хранения.
- Подсчитать количество белков в каждой тюбике, с помощью либо Брэдфорд ' s или BCA пробирного 27 , , 28- 29.
- Осуществляют западной blotting, используя стандартные процедуры 27 , , 28 29. Анализ 5 мкг общего белка для выражения CD31 и CD34, VEGFR2, α-SMA. Использовать для нормализации данных α-тубулина.
3. Непрямой иммунофлюоресценции
- Sonicate coverslips 18-мм стекла в 50% этанола и высушите их. Оставьте чистый coverslips в 12-ну пластины на ночь в капюшоне биобезопасности с УФ света на стерилизовать их.
- Пальто coverslips с 50 & #181; г/мл крысы хвост я коллагена и передачи пластины до 37 ° C, 5% CO 2 инкубатора для по крайней мере 60 мин
- Аспирационная коллагена и добавьте 1 mL ПБС к пластине 12-ну мыть coverslips. Аспирационная ПБС и повторять дважды.
- Семя 250,000 культивированный Пэк в каждой скважины и место их обратно в 37 ° C, 5% CO 2 инкубатора для по крайней мере 3 дней перед проведением иммуноокрашивания.
- Мыть пластину 3 раза с ПБС. Добавьте 1 mL ледяной метанола для каждой скважины и инкубировать при комнатной температуре 15 мин исправить клетки и.
- Проводят с использованием стандартного протокола по 27 , 28 , 29 иммуноокрашивания. Использование антител на их соответствующих разведений (например, CD31 (1:20), CD34 (1:50), α-SMA (1: 100) и VEGFR2 (1:50)).
- Принимать образы immunostained coverslips, с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Изоляция и расширение клеток эндотелия прародителя:
Схема (рис. 1) предоставляется с изображением общий протокол. Слои компонент различных крови наблюдались следующие плотность градиентного центрифугирования человеческой пуповинной крови с средний градиент плотности. После посева МНК на коллаген лечение пластин, нарост колоний впервые наблюдалось между дней 5 и 7(Рисунок 2). Эти колонии продолжает расти и имел морфология веретеновидной формы клеток (рис. 2A-2D) на ранних этапах, которые позднее продвинулись на булыжник как морфология (E-2FРисунок 2). Рисунок 3 A показывает общее количество клеток по сравнению с время в культуре, и каждая точка данных представляет собой совокупное количество клеток, собирают в каждом прохождении. Рисунок 3 B изображает среднее время для первой колонии возникают в пластину 6-ну коллаген лечение после посева МНК.
Характеристика, используя западный Blotting:
Рисунок 4 A показывает представитель результаты западной помарки мембраны, которая была испытана в отношении различных антител. Наши результаты показывают, что клетки были позитивными для CD31 и CD34. Выражение CD31 (рис. 4B) и CD34 (рис. 4C) представляется уменьшить над последующие ходы, тогда как VEGFR2 (рис. 4D) была выражена одинаково в последующих проходах, с первым проход с выше выражения. Мы также наблюдали, что Пэк не выразить мезенхимальных клеток маркер α-SMA (Рисунок 4E). Человека пупочной вены эндотелиальных клеток (HUVEC) и клапанной интерстициальных клеток (Вик) lysates клетки были использованы в качестве положительной и отрицательной контроля, соответственно. HUVECs известны выразить CD31, CD34 и VEGFR2, в то время как Викс Экспресс α-SMA.
Рисунок 1 : Схема EPC изоляции. Начало изоляции путем разбавления пуповинной крови с HBSS и слои его внимательно на вершине средний градиент плотности, как показано. Плотность градиентного центрифугирования слоистых крови осуществляется для получения различных слоев крови, которая состоит из МНК (Баффи пальто), средний градиент плотности, гранулоциты и эритроцитов. Подмножество изображение при условии показывает эти различные слои. МНК собираются и заполнения на тарелку культуры клеток коллагена лечение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Прогрессирование клетки колонии. (A-E) Представитель светлые области изображения EPC колонии прогрессии с течением времени. Обратите внимание, что колонии веретеновидной формы клетки на ранних стадиях, приняв морфология булыжником. (E) представитель изображение EPC, культивируемых в T-75 колбу в проход 3. Шкалы бар = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Кривые роста ПЭК. (A) График изображает количество клеток, растет в течение определенного периода времени, и каждый из точки данных обозначает ячейки номер собирают во время каждого прохода (P0 - P10) (n = 4). (B) время, необходимое для первой колонии EPC, появляются в пластину 6-ну (n = 4). Планки погрешностей обозначают Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM). Не статистической значимости был найден с помощью односторонней ANOVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Западный Blotting. (A) Западная помарка мембрана витражи с различных антител. HUVEC lysate и Вик lysate были использованы в качестве позитивных элементов. (B) средняя интенсивность CD31 полос, нормализуется с α-тубулина. (C) средней интенсивности полос CD34 нормализован с α-тубулина. (D) средняя интенсивность VEGFR2 полос, нормализуется с α-тубулина. (E) средней интенсивности полос α-SMA нормализованной с α-тубулина (n = 3-6). Планки погрешностей обозначают SEM. Не статистической значимости был найден с помощью односторонней ANOVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Иммуноокрашивания. Представитель изображения Пэк культивировали в EGM за 7 дней и immunostained в различных отрывков для CD31 и CD34, VEGFR2, α-SMA. Шкалы - 100 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительные рисунок 1: График изображает количество клеток на единицу площади в течение 7 дней когда культивировали в ВОСА, EBM и DMEM. ЭГМ показал высокий рост клеток, по сравнению с СМИ (EBM и DMEM). Согласно данным статистической значимости, с p < 0.01, используя односторонний дисперсионный анализ (n = 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
/ > Дополнительные рисунок 2: представитель изображений Пэк, культивируемых в ДМ для 7 дней и immunostained для CD31 и CD34, VEGFR2, α-SMA. Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительная цифра 3: Представитель изображения Пэк, культивируемых в среде DMEM за 7 дней и immunostained для CD31 и CD34, VEGFR2, α-SMA. Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как упоминалось ранее, сторонник Пэк обладают булыжником морфологии. Наши изолированные МНК перешла от колонии веретеновидной формы клеток (рис. 2A-2D) на ранних стадиях булыжником колонию (Рисунок 2E-2F) в течение десяти дней в культуре. Пэк были помечены по-разному в различных исследовательских групп, а именно конце клетки эндотелия прародитель10, эндотелиальные колонии, формируя клетки5, или клетки эндотелия прародитель12. Следует отметить, что эти клетки функционально идентичны и выразить аналогичные клетки поверхностных маркеров. Количество клеток во время периода культуры (рис. 3), возросло до почти 10 клеток8 , аналогично предыдущим публикациям и типичные Высокий пролиферативный потенциал Пэк3,5. Действительно было установлено, что Пэк полученных из человеческой пуповинной крови показал высокий пролиферативный потенциал и продемонстрировал несколько населения удвоений перед прохождением старения по сравнению с Пэк, изолированных от периферической крови взрослого человека5 , 10.
Наши западные blotting результаты (рис. 4A) показало наличие CD31, CD34 и VEGFR2 на lysates клетки получены Пэк, по сравнению с положительный контроль, HUVEC. HUVECs Экспресс-CD31, CD34 и VEGFR2 и активирован Вик Экспресс α-sSMA. Как и в предыдущих докладов10,18, выражение CD31 уменьшилась с выше отрывков. Выражения также был похож в случае CD34 и VEGFR2, где сильно обоих маркеров были выражены в первый проход и в сравнительно ниже, но равных количествах в последующих проходах. Эти данные показывают тенденцию, которая согласуется с результаты предыдущих групп, в которых на основе immunosorting протоколы использовались для изоляции пуповинной крови производные Пэк12. Как правило, Пэк не выражают мезенхимальных маркеры и, чтобы убедиться, что изолированные клетки не были мезенхимальных в природе, мы полученных наши западные мембраны помаркой с α-SMA. Наши результаты ясно показывают, что существует выражение не α-SMA в культивированный ПЭК по сравнению с позитивного управления lysates клетки собранные от Викс, которые exhibit сильное выражение α-SMA антитела.
Чтобы продемонстрировать, что ЭГМ позволяет увеличению пролиферации, по сравнению с другие носители культуры Пэк, мы культивируемых клеток в трех различных типов носителей: DMEM, EBM и внеочередного общего собрания акционеров (т.е., EBM, дополнена факторов роста, как указано выше). Все были дополнены с 10% FBS. Мы посеян клетки различных отрывков в каждой скважине 12-ну плиты. Дополнительные рисунок 1 показывает количество клеток на единицу площади в каждой скважине с течением времени в культуре в формулировках различных средств массовой информации. Мы отмечаем, что Пэк культивировали в EGM показал устойчивый рост числа клеток и для ячеек в EBM, было увеличение количества клеток в течение первых трех дней, которые впоследствии перестала расти медленнее. Это предполагает, что ПЭК по-прежнему могли бы выжить в EBM, но отсутствие роста факторов препятствуют распространению. Мы также отмечаем, что Пэк культивировали в среде DMEM сокращение числа, предполагая, что эта конкретная формулировка среднесрочной не подходит для их выживания и распространения. Наши иммуноокрашивания данных показывает, что Пэк культивировали в ВОСА (рис. 5) выразил CD31 больше по сравнению с Пэк, культивируемых в дм (дополнительная цифра 2) и DMEM (Дополнительные рис. 3). Сравнивая Рисунок 5 дополнительных рисунок 2 и дополнительная цифра 3, можно увидеть, что клетки не были загрязнены с другими типами клеток. Кроме того при сравнении immunostained ПЭК (рис. 5), мы можем качественно заявить что выражение CD31 и CD34 снизился над выше отрывков, поддерживая наших иммуноблоттинга данных (Рисунок 4).
Подтвердить, основная цель нашей предлагаемого протокола является продемонстрировать, что один можно изолировать эндотелиальной прогениторных клеток путем культивирования крови МНК в специализированных селективного СМИ. Это должно показать, что Пэк могут быть изолированы без сложного оборудования и процедур, в отличие от других методов, которые предусматривают использование проточной цитометрии - либо сразу же после MNC изоляции1,3,20 , 30 или после колонии превратились в монослое - после replating4,10,12,13,23. EPC колонии обычно появляются между 5 и 9 дней. Наш метод является таким образом быстрее и более экономически эффективным методом для изоляции ПЭК. Основным ограничением этой методики является, что выражение CD31 и CD34 уменьшается с последующими проходами, которых можно предположить, что клетки теряют их прародителем фенотип. Таким образом рекомендуется, что следует использовать клетки, полученные из прохода 5 или ниже для проведения экспериментов, если использование этого протокола.
Меры предосторожности должны приниматься после центрифугирования плотность не беспокоить различные слои при принятии центрифугировали трубок обратно в капюшон, а также при удалении плазмы. Еще один важный шаг относится к Лизис эритроцитов, где более длиннее время инкубации могут потенциально повредить МНК. Таким образом рекомендуется, чтобы не повторять этот шаг более чем в два раза. Действительно поскольку средний стремление осуществляется 24 часа после покрытия, следовые количества эритроцитов, удаляются, как они не сторонник. Альтернативные субстраты, как фибронектин или желатин, пока не проверены нами, может также использоваться согласно конкретных протоколов для создания клеток культуры покрытий. Используя незначительные изменения в первоначальные шаги, исследователи могут изолировать non сторонник Пэк30.
В заключение мы сообщали метод изоляции Пэк из пуповинной крови. Важно отметить, что Пэк не выражают маркеры как α-SMA, предполагая, что они не являются мезенхимальные подобных клеток. Действительно α-SMA служит важным маркер при попытке исследование эндотелиальной мезенхимальных перехода (Эндо MT) ПЭК. Эндо-MT представляет собой процесс сотовой transdifferentiation, во время которого эндотелиальные клетки известны потерять их определенных маркеров и преобразовать фенотип мезенхимы подобных клеток. Было показано, что Пэк можно выполнить этот переход в присутствии преобразования фактор роста β7 и может выпустить внеклеточного мембранных белков на их ткани инженерии леса8. Все эти наблюдения показывают обещание Пэк для использования в качестве источника аутологичных клеток для создания клапан сердца или других сердечно-сосудистых тканей инженерных конструкций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Этот материал основан на работе, поддержке Национального научного фонда под Грант № CMMI-1452943 и отличием колледж университета штата Арканзас. Мы хотели бы также признать Арканзас пуповинной крови Банк за предоставление нам единиц крови шнура.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A) For isolation and culturing | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1x Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
| Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antibodies and cell lysates | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2,500 dilution for Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
| Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
| C) Western blotting and immunostaining | |||
| 10x Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
| 10x Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
| Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
| 4x Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
| Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |
References
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105 (1), 71-77 (2000).
- Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92 (2), 362-367 (1998).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Sales, V. L., et al. Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation. 114, 1 Suppl 193-199 (2006).
- Sales, V. L., et al. Endothelial Progenitor Cells as a Sole Source for Ex Vivo Seeding of Tissue-Engineered Heart Valves. Tissue Eng Pt A. 16 (1), 257-267 (2010).
- Liew, A., Barry, F., O'Brien, T. Endothelial progenitor cells: diagnostic and therapeutic considerations. Bioessays. 28 (3), 261-270 (2006).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
- Ingram, D. A., Caplice, N. M., Yoder, M. C. Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells. Blood. 106 (5), 1525-1531 (2005).
- Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).
- Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 006692 (2012).
- Siddique, A., Shantsila, E., Lip, G. Y. H., Varma, C. Endothelial progenitor cells: what use for the cardiologist. J Angiogenes Res. 2 (6), (2010).
- Camci-Unal, G., et al. Surface-modified hyaluronic acid hydrogels to capture endothelial progenitor cells. Soft Matter. 6 (20), 5120-5126 (2010).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
- Young, P. P., Vaughan, D. E., Hatzopoulos, A. K. Biologic properties of endothelial progenitor cells and their potential for cell therapy. Prog Cardiovasc Dis. 49 (6), 421-429 (2007).
- Mehta, J. L., Szwedo, J. Circulating endothelial progenitor cells, microparticles and vascular disease. J Hypertens. 28 (8), 1611-1613 (2010).
- Nevskaya, T., et al. Circulating endothelial progenitor cells in systemic sclerosis are related to impaired angiogenesis and vascular disease manifestations. Ann Rheum Dis. 66, 67-67 (2007).
- Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, 1 Suppl 132-137 (2006).
- Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
- Vasa, M., et al. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 103 (24), 2885-2890 (2001).
- Wu, X., et al. Tissue-engineered microvessels on three-dimensional biodegradable scaffolds using human endothelial progenitor cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 480-487 (2004).
- Boyer, M., et al. Isolation of endothelial cells and their progenitor cells from human peripheral blood. J Vasc Surg. 31 (1), Pt 1 181-189 (2000).
- Huber, B., Czaja, A. M., Kluger, P. J. Influence of epidermal growth factor (EGF) and hydrocortisone on the co-culture of mature adipocytes and endothelial cells for vascularized adipose tissue engineering. Cell Biol Int. 40 (5), 569-578 (2016).
- Sturdivant, N. M., Smith, S. G., Ali, S. F., Wolchok, J. C., Balachandran, K. Acetazolamide Mitigates Astrocyte Cellular Edema Following Mild Traumatic Brain Injury. Sci Rep. 6, 33330 (2016).
- Lam, N. T., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N., Balachandran, K. Valve interstitial cell contractile strength and metabolic state are dependent on its shape. Integr Biol (Camb). 8 (10), 1079-1089 (2016).
- Tandon, I., et al. Valve interstitial cell shape modulates cell contractility independent of cell phenotype. J Biomech. 49 (14), 3289-3297 (2016).
- Cockshell, M. P., Bonder, C. S. Isolation and Culture of Human CD133+ Non-adherent Endothelial Forming Cells. Bio-Protocol. 6 (7), (2016).
