Semi-geautomatiseerde analyse van muis skeletspieren morfologie en vezel-achtige samenstelling

Samenvatting

Immunohistochemische kleuring van myosin zware ketting isoforms heeft ontpopt als de state-of-the-art-discriminator van skeletale spiervezel-type (d.w.z., typ ik typ IIA, typ IIX, type IIB). Hier presenteren we een kleuring protocol samen met een nieuwe semi-automatische algoritme, dat vergemakkelijkt de snelle beoordeling van de morfologie van het type vezel en vezels.

Samenvatting

Jarenlang waren best onderscheid tussen skelet spiervezel typen gevisualiseerd door myosin-ATPase kleuring. Meer recentelijk heeft immunohistochemische kleuring van myosin zware ketting (MyHC) isoforms ontpopt als een fijnere discriminator van fiber-type. Type I, type IIA, typ IIX en type IIB vezels kunnen nu worden geïdentificeerd met precisie op basis van het profiel van hun MyHC; Handmatige analyse van deze gegevens kan echter traag en omlaag-rechts vervelend. Snelle, nauwkeurige beoordeling van het type vezel samenstelling en morfologie is in dit verband een zeer wenselijk hulpmiddel. Hier presenteren we een protocol voor state-of-the-art immunohistochemische kleuring van MyHCs in bevroren secties muis stuk spier in concert met een nieuwe semi-automatische algoritme, dat versnelt de analyse van de morfologie van het type vezel en vezels verkregen. Zoals verwacht, de Musculus soleus weergegeven kleuring voor type I en type IIA vezels, maar niet voor type IIX of type IIB vezels. Aan de andere kant, de tibialis anterior spier bestond voornamelijk uit type IIX en type IIB vezels, een klein deel van het type IIA vezels en weinig of geen typ ik vezels. Meerdere afbeelding transformaties werden gebruikt voor het genereren van waarschijnlijkheid kaarten met het oog op het meten van de verschillende aspecten van de morfologie van de vezel (d.w.z., doorsnede (CSA), maximale en minimale Feret diameter). De waarden voor deze parameters vervolgens met handmatig verkregen waarden vergeleken werden. Geen significante verschillen werden waargenomen tussen beide modus van analyse met betrekking tot CSA, maximale of minimale Feret diameter (alle p > 0,05), met vermelding van de nauwkeurigheid van onze methode. Dus kan onze immunokleuring analyse protocol worden toegepast op het onderzoek van de effecten op de spier samenstelling in vele modellen van veroudering en myopathie.

Inleiding

Het is gekend voor enige tijd dat skeletspier uit één vezels van vele typen^{1 bestaat}. Aanvankelijk twee soorten vezels werden gekenmerkt op basis van hun contractiele eigenschappen en genoemd, naar behoren, slow-twitch (type I) en fast-twitch (type II). Deze categorieën werden verder onderscheiden op basis van glasvezel metabolisme. Daar typ ik vezels zijn rijk aan mitochondriën en afhankelijk van het oxidatieve metabolisme, ze werden toegelicht door krachtig positieve nicotinamide adenine dinucleotide-tetrazolium reductase (NADH-TR) diaphorase² of succinaat dehydrogenase (SDH)³ kleuring. Daarente....

Protocol

alle procedures waarbij muizen door de Universiteit van Colorado-Anschutz medische Campus institutionele Animal Care en gebruik Comité zijn goedgekeurd (91813(05)1D).

1. dag 1: primaire (1°) immunokleuring met boviene serumalbumine (BSA) blokkeren

1. luchtdroge bevroren secties van muis stuk spier (bijvoorbeeld tibialis anterior, soleus) gemonteerd op geladen geleiders voor ~ 30 min ¹¹. een rand rond de secties met een hydrofobe barrière PAP pen tekenen.
2. Plaats ~ 250 µL 5% BSA/fosfaatgebufferde zoutoplossing (BSA/PBS) op elke dia te blokkeren van niet-specifieke antilichaam binding. Incub....

Resultaten

Stuk spieren (dat wil zeggen, tibialis anterior, soleus) ontleed van een mannelijke C57BL/6 muis van onbekende leeftijd waren flash bevroren door het zinken van een plastic mal de spier in LGO met samengestelde in vloeibare stikstof-gekoelde tolueen. Met behulp van een cryotome, waren 8-10 µm seriële secties Knip bij-20 ° C en vervolgens overgebracht naar verschillende positief-geladen glas dia's¹².

Discussie

Wij hebben hier nuttig richting voor de identificatie van skeletale spiervezel typen verstrekt. Daarbij beschrijven we een nieuw algoritme voor analyse van de gegevens.

Omdat onze resultaten grotendeels die van eerdere verslagen^5,-^8,10 te bevestigen en onze eigen handmatige metingen weerspiegelen, weergegeven het algoritme nauwkeurig te zijn. Nog steeds, ondervonden we sommige zeldzame experimentele v.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9418-100G	5% in PBS
Hydrophobic Barrier Pap Pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
Microscope Slides	Globe Scientific	1358W
Coverglass	Fisher Scientific	12-544-E
Immumount	Thermo Scientific	9990402
Nail Polish	L'Oreal
Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope		Discontinued
SPOT RT/KE	SPOT Imaging Solutions	RT940
Dell Optiplex
BA-F8 Primary Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa		monoclonal mouse IgG2b; 1:50
SC-71 Primary Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa		monclonal mouse IgG1; 1:50
BF-F3 Primary Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa		monoclonal mouse IgGM; 1:50
6H1 Primary Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa		monoclonal mouse IgGM; 1:50
Alexa Fluor 594 anti-IgG2b	Invitrogen	A21145	goat anti-mouse; 1:200
Alexa Fluor 488 anti-IgG1	Invitrogen	A21121	goat anti-mouse;1:200
Alexa Fluor 594 anti-IgGM	Invitrogen	A21044	goat anti-mouse;1:200
OCT	Sakura Finetek	4583
isopentane	Fisher Scientific	O3551-4	cool with liguid nitrogen
PBS	Fisher Bioreagents	BP665-1	10x, dilute to 1x
Kim wipes	Kimberly-Clark	06-666A