Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Live-Bildgebung der Maus-Sekundär-Gaumen-Fusion mit konfokaler Mikroskopie. Dieses Protokoll kann in Kombination mit einer Vielzahl von fluoreszierenden Reporter-Maus-Linien und mit Pfad-Inhibitoren für mechanistische Einsicht verwendet werden. Dieses Protokoll kann für die Live-Bildgebung in anderen Entwicklungssystemen angepasst werden.
Abstract
Die Verschmelzung der sekundären palatinalen Regale zur Bildung des intakten sekundären Gaumens ist ein wichtiger Prozess in der Entwicklung von Säugetieren und ihre Störung kann zu Spalten-Sekundärgaumen führen, eine gemeinsame angeborene Anomalie beim Menschen. Sekundäre Gaumenfusion wurde ausführlich untersucht, was zu mehreren vorgeschlagenen zellulären Mechanismen führte, die diesen Prozess vermitteln können. Diese Studien wurden jedoch meistens an festen embryonalen Geweben zu fortschreitenden Zeitpunkten während der Entwicklung oder in festen explantierten Kulturen durchgeführt, die zu statischen Zeitpunkten analysiert wurden. Die statische Analyse ist für die Analyse von dynamischen morphogenetischen Prozessen wie eine Gaumenfusion begrenzt und welche Arten von dynamischen zellulären Verhaltensweisen die palatale Fusion vermitteln, ist unvollständig verstanden. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Live-Bildgebung der ex vivo sekundären Gaumenfusion bei Mausembryonen. Um zelluläre Verhaltensweisen der Gaumenfusion zu untersuchen, wurde epithelspezifisches Keratin14 -cre verwendet, um Gaumenepithelzellen in ROS zu etikettierenA26-mTmG- Flox- Reporter-Embryonen Um das filamentöse Actin zu visualisieren, wurden Lifeact-mRFPruby- Reporter-Mäuse verwendet. Die lebendige Bildgebung der sekundären Gaumenfusion erfolgte durch Sezieren von kürzlich adhärierten sekundären palatinalen Regalen von embryonalen Tag (E) 14,5-stufigen Embryonen und Kultivieren in agarosehaltigen Medien auf einer Glasbodenschale, um die Bildgebung mit einem umgekehrten konfokalen Mikroskop zu ermöglichen. Mit dieser Methode haben wir eine Vielzahl von neuartigen Zellverhalten während der sekundären Gaumenfusion nachgewiesen. Eine Anerkennung dessen, wie unterschiedliche Zellverhalten in Raum und Zeit koordiniert sind, trägt wesentlich zu unserem Verständnis dieses dynamischen morphogenetischen Prozesses bei. Dieses Protokoll kann auf mutierte Mauslinien angewendet werden, oder Kulturen, die mit pharmakologischen Inhibitoren behandelt werden, um das Verständnis darüber zu fördern, wie die Sekundärspalter-Fusion kontrolliert wird.
Introduction
Tissue Fusion ist ein wichtiger Schritt in der Entwicklung von mehreren Organen. Wichtige menschliche Geburtsfehler wie Spaltlippe und Gaumen, Spina bifida und Missbildungen des Herzens können aus Defekten der Gewebefusion resultieren 1 . Maus-Sekundär-Gaumen-Fusion wurde intensiv untersucht, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu identifizieren, die die Gewebefusion in der Entwicklung 2 , 3 , 4 kontrollieren. In der Maus beginnt die sekundäre Gaumenentwicklung um etwa E11.5 mit dem Auswachsen eines sekundären palatinalen Regals aus jedem der bilateralen Oberkieferprozesse. Das anfängliche Wachstum der Gaumenböden erfolgt senkrecht entlang der Zunge, bis etwa E14.0, zu welcher Zeit die Gaumenböden waagerecht über die Zunge hoch werden. Das medial gerichtete Wachstum führt zu einem physischen Kontakt zwischen den applizierten Epithelien der beiden palatinalen Regale und bildet die Mittellinie epitheliAl Naht (MES) bei E14.5. Die dazwischen MES müssen zwischen den sekundären palatal Regalen entfernt werden mesenchymale Konfluenz zu ermöglichen , und die Entwicklung eines intakten, vollständig verschmolzen Sekundär Gaumen durch E15.5 3.
Wie eine gemeinsame epitheliale MES-Zellschicht zwischen zwei getrennten Gaumenböden gebildet und dann entfernt wurde, um mesenchymale Konfluenz zu erreichen, war eine zentrale Frage in der Gaumenentwicklung. Basierend auf Maus-Histologie- und Elektronenmikroskopie (EM) -Studien, explantischen Kulturstudien und funktionellen Mausgenetik-Experimenten wurden in diesem Prozess mehrere grundlegende Zellverhalten verwickelt. Filopodienähnliche Projektionen aus dem medialen Randepithel MEE jedes palatinalen Regals erleichtern den Anfangskontakt 5 , 6 , gefolgt von einer Interkalation dieser Epithelzellen zu einer gemeinsamen MES 6 , 7 . Beseitigung der resultierenden gemeinsamen MESWurde vorgeschlagen, um durch drei nicht-exklusive Mechanismen vorzugehen. Frühe Studien mit histologischer Beobachtung und ex vivo- Linienverfolgung mit lebenswichtigen Farbstoffen zeigten, dass die MES durch epithelialen bis mesenchymalen Übergang (EMT) der MES-Zellen 8 , 9 entfernt werden könnte , obwohl in jüngster Zeit die genetische Linienverfolgung von Epithelzellen die Unsicherheit erhöht hat Der langfristige Beitrag der Epithelzellen zum Gaumenregal Mesenchym 10 , 11 , 12 . Eine signifikante Anzahl von apoptotischen Zellen und eine Verringerung ihrer Zahl in einigen Mutanten, die einer ordentlichen Gaumenfusion nicht unterliegen, hat zu der Vorstellung geführt, dass Apoptose ein wichtiger Treiber der MES-Auflösung 2 , 3 sein kann . Schließlich basiert zunächst auf Studien mit epithelialer Markierung und statischer Beobachtung zu progressiven Zeitpunkten, MES-ZellenWurden vorgeschlagen, um in den oronasalen und anteroposterioren Dimensionen 11 , 13 zu wandern, aber solche dynamischen Zellverhalten wurden zunächst unbestätigt wegen einer Unfähigkeit, sie in lebendem palatinalem Gewebe zu beobachten. In letzter Zeit konnten wir diese Verhaltensweisen direkt beobachten, indem wir eine neue Live-Imaging-Methodik entwickelten, die mäusegenetische Methoden der fluoreszierenden Markierung mit konfokaler Live-Imaging von explantierten Palastregalen kombiniert.
Zuerst, um dynamische zelluläre Verhaltensweisen in Gaumenepithelzellen während der Gaumenfusion zu visualisieren, erzeugten wir eine epithelspezifische Reportermaus, indem wir ROSA26-mTmG- Flox- Mäuse mit Keratin14-cre- Mäusen 14 , 15 kreuzten . Die konfokale Live-Darstellung der Gaumen-Explantat-Kultur der resultierenden Embryos bestätigte einige zuvor vorgeschlagene zelluläre Verhaltensweisen und identifizierte neuartige Ereignisse im Fusionsprozess 6 6 , 16 antrieb. Diese Abbildungsmethode kann mit anderen Reporterlinien verwendet werden; Wir haben Lifeact-mRFPruby- transgene Mäuse 17 , 18 verwendet , um die aktin- zytoskeletale Dynamik während des Fusionsprozesses zu untersuchen. Andere Reporter können auch eingesetzt werden, um andere spezifische Aspekte der Gaumenfusion zu beobachten, und diese Methode kann entweder auf die Laser-Scanning-konfokale Mikroskopie oder die Spinndiskette konfokale Mikroskopie angepasst werden, je nach Abbildungsbedarf und Mikroskopverfügbarkeit. Live-Imaging wird zunehmend zum Keystone-Ansatz in der Entwicklungsbiologie. PartiCulario, kraniofaziale Morphogenese ist komplex und menschliche Geburtsfehler, die das Gesicht beeinflussen, sind üblich. Diese konfokale Live-Imaging-Methode wird dazu beitragen, ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden grundlegenden Entwicklungsmechanismen sowie Ursprünge von menschlichen kraniofazialen Anomalien zu ermöglichen.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Protokollen der University of California in San Francisco Institutional Animal Care und Use Committee durchgeführt.
1. Vorbereitung von Live Imaging Media
- Herstellung von flüssigen Kulturmedien
- Fügen Sie 20% fötales Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 U / mL Penicillin, 100 μg / ml Streptomycin, 200 μg / ml L-Ascorbinsäure, 15 mM HEPES zu Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 hinzu Medien.
HINWEIS: Live-Imaging-Medien wurden direkt vor der Bildgebung frisch gemacht. Dieses Medium enthält Phenol-Rot, das zu Phototoxizität über lange Zeit Kurse der Live-Bildgebung führen kann. Die Substitution von Medien ohne Phenol-Rot kann die Langzeit-Bildgebung verbessern.
- Fügen Sie 20% fötales Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 U / mL Penicillin, 100 μg / ml Streptomycin, 200 μg / ml L-Ascorbinsäure, 15 mM HEPES zu Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 hinzu Medien.
- Herstellung von niedrigschmelzender Agarose-Lösung
- 350 mg niedrigschmelzende Agarose in 10 ml autoklaviertem destilliertem Wasser auflösen, um eine 3,5% ige Stammlösung zu bilden.
- Die Agaroselösung gut vermischen und bei 70 ° C in einem Wasserbad inkubieren, um die Agarose vollständig aufzulösen.
- Die Agarose-Lösung in einem 37 ° C-Wasserbad abkühlen lassen, bevor man sie dem lebenden Bildmedium zuführt.
- Füge 1 ml der Agarose-Stammlösung zu 5 ml des flüssigen lebenden Bildgebungsmediums hinzu, um eine Endkonzentration (0,6%) zu erreichen.
- Halten Sie das Medium mit Agarose in einem 37 ° C Wasserbad, um eine vorzeitige Erstarrung zu verhindern.
2. Vorbereitung der Palate Explant Culture für Live Imaging
- Dissektion von kürzlich eingeleiteten E14.5 sekundären palatinalen Regalen
ANMERKUNG: In unserer Erfahrung erfordert die Bildgebung die Fusion mit einem leicht angeklebten Paar von Gaumenböden; Diese Adhärenz verhindert explantische Bewegungen, die eine Verschmelzung während der Bildgebung verhindern.- E14.5 Bühnenembryonen in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zerlegen und grünes fluoreszierendes Protein (GFP) exprimieren (ausK14-cre; ROSA26-mTmG- Flox ) oder (Red Fluorescent Protein) RFP-exprimierende (von Lifeact-mRFPruby ) positive Embryos unter Verwendung eines Sektionsmikroskops, das mit Leuchtstofflampen ausgestattet ist. Übertragen von Gewebe auf vorgewärmte lebende Bildkulturmedien ohne Agarose.
- Schneiden Sie den Embryokopf und entfernen Sie den oberen Gehirnbereich, indem Sie zwei feine Zapfen Nr. 5 verwenden ( Abbildung 1 A-C ). Verwenden Sie eine Nr. 5 Pinzette, um den Embryo zu halten, während die andere Nr. 5 Pinzette, um zusätzliches Gewebe außerhalb der palatinalen Regale wegzuschneiden.
HINWEIS: Feine Scheren können verwendet werden, um den Embryokopf (den ersten Schritt) anstelle einer Nr. 5 Pinzette zu schneiden. Allerdings wird zwei Nr. 5 feine Zangen eine bessere Kontrolle geben, um präzise Schnitte zu machen. - Entfernen Sie den Unterkiefer sorgfältig, ohne die Gaumenablagen zu beschädigen, wie in Abbildung 1 D und 1E gezeigt . Um die Chance zu beschädigen, Gaumen zu beschädigen, halte die Zunge durch die Sektion des Unterkiefers, fDurch sorgfältiges Entfernen der Zunge.
- Nach dem Entfernen des Unterkiefers und der Zunge untersuchen Sie die orale Seite des Sekundärgaumens mit einem Stereomikroskop mit Fluoreszenz, um ein starkes Reportersignal im MES zu bestätigen ( Abbildung 1 M ).
- Nach dem Entfernen von Unterkiefer und Zunge ( siehe Abb. 1 F ) die hinteren Teile einschließlich Hirnhirn und Hirnstamm herausziehen.
- Entfernen Sie beide Oberkiefer mit angeklebten palatinalen Regalen ( Abbildung 1 G ).
- Schneide das vordere Oberkiefergewebe, das sowohl den primären als auch den sekundären Gaumen intakt hält ( Abbildung 1 H und I ).
- Nasenseptum auf nasale Seite des Explantats entfernen, das die MES aussetzt.
HINWEIS: Diese späteren Schritte der Sektionen müssen sorgfältig darauf achten, die Kontakte zwischen zwei sekundären Gaumenböden nicht zu stören. Die Entfernung des Nasenseptums hilftReduzieren das Hintergrundsignal aus anderen Bereichen und reduzieren auch die vertikale Gewebebewegung, was eine stabile Bildgebung ermöglicht ( Abbildung 1 J-L ). - Nach dem Sezieren der Gaumenböden, untersuchen Sie die Mittellinie Reporter Signal wieder, um sicherzustellen, dass es keine Schäden an der Epithelschicht zwischen den Geweben.
- Einrichten von Gaumenforschern in Kulturschalen mit Live-Imaging-Medien
- Setzen Sie Live-Imaging-Medien in 35-mm-Glasbodenschale.
- Setzen Sie sezierte palatale Regale mündliche Seite nach unten so nah an den Glasboden wie möglich für die Bildgebung mit einem umgekehrten konfokalen Mikroskop ( Abbildung 1 N ).
- Legen Sie Trockeneis-Pellets auf eine leitfähige Oberfläche in der Nähe der Kulturschale, um die Agaroseverfestigung zu beschleunigen, indem Sie die Temperatur schnell verringern oder die Kulturschale auf 4 ° C stellen. Eine kalte Platte, wie sie beispielsweise für die Paraffineinbettung verwendet wurde, könnte auch an dieser Stelle verwendet werdenTage
HINWEIS: Wenn Trockeneis verwendet wird, muss der Agarose-Medienwechsel sorgfältig überwacht werden, um das Einfrieren von Medien zu verhindern.
3. Konfokale Zeitraffer-Bildgebung von Gaumenforschung
- Bildgebung und Datenerfassung
- Nachdem die Agarose halbverfestigt war, die Kulturschale in ein invertiertes konfokales Mikroskop mit 37 ° C Inkubationskammer auftragen. Verwenden Sie ein weißes Licht konfokales Mikroskop und Zelle Beobachter Spinnerei konfokale Mikroskop.
HINWEIS: Wir verwendeten ein modifiziertes Medium mit 15 mM HEPES ohne CO 2 -Gas. - Setzen Sie Petroleumgelee zwischen die Kulturschale und bedecken Sie mit einer Spritze, um das Verdampfen von Medien zu verhindern ( Abbildung 1 N ).
HINWEIS: Manche Kondensation auf der Oberseite des Kulturschalendeckels nach Übernachtung (O / N) Kultur tritt auf, aber das Volumen der Medien ändert sich nicht, was darauf hindeutet, dass das Vaselinegelee das Verdampfen von Medien verhindert. - Finden Sie die Region von Interesse mit niedrigen Vergrößerungszielen (10x) und verwenden Sie höhere Vergrößerungsziele (20x Objektiv mit 3x Digitalzoom oder ein 40x Objektiv mit Immersol W) für Zeitraffer Live Imaging.
ANMERKUNG: Sektierte Sekundärpalastregale sind nicht flach. Der sekundäre Gaumen ist eine gekrümmte Struktur und das macht es schwierig, die gesamte MES in der gleichen Ebene abzubilden. Niedrige Vergrößerung (10x) Imaging kann eine ganze Gaumenabbildung ermöglichen, aber 40x Ziele werden eine bessere Bildauflösung bieten, um detaillierte zelluläre Bewegungen in tieferen Z-Positionen zu untersuchen. Die Krümmung ist im mittleren Gaumenbereich hoch. Der vordere und hintere Gaumen sind im Vergleich zum mittleren Gaumen relativ flach. Wir schauen oft auf die Mitte der Vorderseite des Sekundärgaumens, um Regionen der größten Krümmung zu vermeiden. - Mehrere Z-Stacks mit 5 μm pro Schritt für 16-24 h unter Verwendung einer geeigneten Laseranregung (488 nm für GFP und 532/561 nm für RFP) scannen ( Abbildung 2 ).
HINWEIS: Um die potentielle Phototoxizität zu reduzieren, verwenden Sie die minimale Laserleistung und die Belichtungszeit. Dies ist vor allem bei Mehrfarb-Bildgebung wichtig. Verwenden Sie 22% der 552 nm Laserleistung für MembranTomato (mT), 30% der 495 nm Laserleistung für MembranGFP (mG) und 25% der 561 nm Laserleistung für MembranRFP. Die durchschnittliche Expositionszeit betrug 550 ms. - Verwenden Sie Bildanalyse-Software, um Zellverfolgung und quantitative Analyse durchzuführen.
- Nachdem die Agarose halbverfestigt war, die Kulturschale in ein invertiertes konfokales Mikroskop mit 37 ° C Inkubationskammer auftragen. Verwenden Sie ein weißes Licht konfokales Mikroskop und Zelle Beobachter Spinnerei konfokale Mikroskop.
4. Datenbildanalyse
HINWEIS: Hier wurde Imaris benutzt. Ähnliche Datenanalysen können auch mit ImageJ- oder Volocity-Softwarepaketen durchgeführt werden.
- Rendering von dreidimensionalen (3D) Oberflächen aus Bildsequenzen.
HINWEIS: Dieser Abschnitt ermöglicht die Erzeugung einer Oberfläche aus einem Film, der mit einem Membran-GFP-Signal erzeugt wird.- Klicken Sie auf Bearbeiten | Zeigen Sie die Display-Einstellung an und verwenden Sie den Histogramm-Schieberegler, um die Signalintensität so einzustellen, dass das Membransignal klar istAus der Länge des Films heraus ( Abbildung 3 A ).
- Korrigieren Sie das Bleichsignal mit Hilfe von Image Verarbeitung | Dämpfungskorrektur . Passen Sie die Intensity Front- und Intensity Back-Werte an, so dass das Membransignal über die gesamte Länge des Films klar ist. Bei der Einstellung dieser Werte ist möglicherweise ein Versuch und ein Fehler erforderlich.
HINWEIS: Der Wert "Intensity Back" (Deerper Z position) ist kleiner als der Intensity Front (Surface Z Position) Wert aufgrund der begrenzten Laserdurchdringung. Diese Werte können daher auch geändert werden, um die Signalintensität in der Z-Serie zu normalisieren. Beide Werte können angepasst werden, um eine Bleichkorrektur zu erreichen. Die Dämpfungskorrektur wird auch als Emissionsdämpfungskorrektur 19 bezeichnet . - Um eine Oberfläche aus dem Membransignal zu erzeugen, wählen Sie Surpass | Oberflächen , wählen Sie einen Quellkanal und Threshold-Typ (Absolute Intensity) und unter den Algorithmen Einstellungen seLect Segment nur eine Region von Interesse Und Prozess des gesamten Bildes schließlich , gefolgt von einem Klick auf den Vorwärtspfeil; Fahren Sie fort, den Vorwärtspfeil zu betätigen (Standardeinstellungen vornehmen oder Bereichsdetailsebenen und Schwellenmethode durch Versuch und Irrtum angeben), prüfen, ob die erzeugte Fläche das Fluoreszenzsignal reflektiert. Um eine Region von Interesse anzugeben, wählen Sie Region und Zeit (en), die gerendert werden sollen, indem Sie X-, Y-, Z-Positionen ausrichten.
HINWEIS: Auswählen Prozess des gesamten Bildes endlich so, dass Anpassungen und Schwellenwerte über den gesamten Film angewendet werden. - Erstellen Sie eine Fläche, indem Sie erneut auf die Vorwärtspfeiltaste klicken. Stellen Sie dann die Schwelle ein, indem Sie das Histogramm in den Filtern ändern, um dem Membransignal zu entsprechen.
- Nachdem die Oberfläche erzeugt wurde, wählen Sie die Oberfläche in den Oberflächen / Einstellungen, um das Oberflächensignal zu visualisieren und den Oberflächenerzeugungsprozess zu beenden, indem Sie die Doppelwalze drückenArd Pfeiltaste ( Abbildung 3 B ).
- Gehe auf Oberfläche | Bearbeiten Sie und klicken Sie auf Maske alle in den Maskeneigenschaften , um ein maskiertes Kanalbild zu erzeugen.
- Nach dem Klicken auf OK wird das Mask Channel-Fenster automatisch geöffnet; Wählen Sie den GFP-Kanal, setzen Sie die Voxel außerhalb der Oberfläche auf den maximalen Signalintensitätswert (gefunden in Bearbeiten | Display-Einstellung ) und Voxel innerhalb der Oberfläche auf den minimalen GFP-Intensitätswert (auch gefunden in Bearbeiten | Display-Einstellung ), in Maskeneinstellungen , um eine Maske des Membransignals zu erzeugen.
- Wenn die Maske des Membransignals in der Volumenansicht angezeigt wird, erzeugen Sie invertierte Bilder mit der Bildverarbeitung | Kontraständerung | Invertieren ( Abbildung 3 C ).
- Erkennung von Flecken aus invertierten Oberflächenbildern.
HINWEIS: In diesem Abschnitt kann das Zentrum jeder Zelle seinMarkiert mit einem einzigartigen punkt und verfolgt über Raum und Zeit.- Wählen Sie Surpass Scene aus Flecken | Erstellen ; In Algorithmen Einstellungen wählen nur Segment nur eine Region von Interesse , Prozess des gesamten Bildes schließlich und Track Spots (im Laufe der Zeit) .
- Klicken Sie auf den Vorwärtspfeil und geben Sie einen Bereich von Interesse an. Wähle die Region und die Zeit (e), um Spots zu verfolgen; Fahren Sie fort, den Vorwärtspfeil zu drücken, wählen Sie den maskierten Kanal als Quellkanal und bestimmen Sie den geschätzten XY-Durchmesser der Punkte.
- Wenn Sie auf die Vorwärtspfeiltaste klicken, wird automatisch ein Filterfenster geöffnet. Anpassung der Spot-Erkennungsschwelle durch Ändern von Werten im Histogramm, um einzelne Punkte in der Mitte jeder Zelle zu erzeugen ( Abbildung 3 D ).
- Wenn Sie auf die Vorwärts-Pfeiltaste klicken, wird das Algorithmus- Fenster geöffnet. Wählen Sie Autoregressives Bewegungs-Tracking-Modell 20 und geben Sie die maximale Tracking-Di anHaltung und maximale Lückengröße, um Spuren zu verbinden, die für einen kurzen Zeitraum diskontinuierlich werden.
- Wenn Sie erneut auf die Vorwärtspfeiltaste klicken, wird das Fenster "Filter" geöffnet, indem Sie das Histogramm so einstellen, dass jede Zelle verfolgt wird. Wenn Sie auf die doppelte Vorwärtspfeiltaste klicken, wird die Spoterkennung finalisiert.
- Um die Gewebetrift zu korrigieren, klicken Sie auf Spots | Track Editor und wählen Sie Correct Drift . Ein Algorithmus- Fenster wird automatisch geöffnet. Wählen Sie die Option Translational Drift aus, geben Sie das gesamte Ergebnis ein und korrigieren Sie Objektepositionen .
- Erstellung von Aufträgen für die quantitative Analyse
HINWEIS: Das Scatterplot des Programms ist ein Werkzeug, um mehrdimensionale (X, Y, Z, Color und Scale) Graphen mit mehreren Objekten zu erzeugen. Diese Handlungen sind nützlich für die Betrachtung von Trends vieler Zellbewegungen im Laufe der Zeit.- Machen Sie 2D- oder 3D-Plots von Zellverfolgungsdaten mit demVantage-Add New Vantage Plot-Menü ( Abbildung 3 E und 3F ).
- Wählen Sie Volume oder Spots und wählen Sie Create / Category und Plot Type
- Passen Sie Plot-Werte an, um verschiedene Vantage-Graphen zu erzeugen.
- Exportieren Sie Graphen mit der Snapshot- Funktion.
HINWEIS: Statistische Daten können auch als Tabellenkalkulation für weitere quantitative Analysen exportiert werden, indem man auf Plotnummernbereich | Speichern .
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Representative Results
Live-Bildgebung der Gaumen-Explantat-Kultur zeigte mehrere zelluläre Prozesse, die die Gaumenfusion vermitteln 6 . Die Anfangskontakte zwischen zwei Epithelzellen werden durch Membranvorsprünge hergestellt ( Abbildung 2 B-2E ). Wenn sich zwei Epithelschichten treffen, bilden sie eine mehrzellige, geschichtete MES, gefolgt von einer Interkalation, um eine integrierte Einzelzellschicht MES durch epitheliale Konvergenz herzustellen ( Abbildung 2 A-2E und Abbildung 2 K-2O ). Epithelzellen in tieferen Z-Ebenen werden ebenfalls progressiv zur oralen Seite des MES verschoben, was zum epithelialen Konvergenzprozess beiträgt ( Abbildung 2 K ). Die posterior-gerichtete Zellmigration wurde im mittleren Gaumen MES beobachtet ( Abbildung 2 F-2J ). Darüber hinaus fanden wir Epithelzellen extWährend der Gaumenfusion darauf hindeutet, dass Epithelzellen im MES durch diesen aktiven Prozess entfernt werden können ( Abbildung 2 Q, 2T ). Die integrierte Epithelnähte wird letztlich zusammenbrechen, um eine mesenchymale Konfluenz zu erreichen ( Abbildung 2 S, 2T ).
Lifeact-mRFPruby- Gaumen zeigte dynamische Aktin-zytoskeletale Umlagerungen während der Gaumenfusion 6 . Der filamentöse Aktin wurde an der Grenze zwischen epithelialen und mesenchymalen Gebieten angereichert, die eine kabellose Struktur entlang der anterior-posterioren Achse bilden ( Abbildung 2 K-2T) . Actomyosin-Kontraktilität treibt die epitheliale Konvergenz und den MES-Bruch an, da die chemische Hemmung der Myosin-Aktivität oder der Aktin-Polymerisation diese dynamischen Prozesse blockiert hat 6 .
Hin-page = "1"> Software wurde verwendet, um zelluläre Verhaltensweisen während der Gaumenfusion zu verfolgen. Die beste Methode für die Zellverfolgung hängt vom Reportersignal ab. Wenn eine nukleare Reportermaus verwendet wird, kann das Programm das Zentrum der fluoreszierenden Signale als zelluläre Zentren 21 verfolgen. Eine nukleare GFP-Reportermaus wie ROSA26 GFP-NLS-lacZ ( GNZ) 22 kann daher verwendet werden, um Epithelzellen unter Verwendung von gewebespezifischen Cre-Linien zu markieren; In unseren händen zeigte dieser spezifische nukleare reporter eine schnellere bleichung über den langen zeitverlauf, der in der lebenden bildgebung verwendet wurde. Deshalb nutzten wir den Membran-GFP-Reporter ( ROSA26-mTmG- Flox ), um epitheliale Zellbewegungen in unseren Studien zu verfolgen. Dies erforderte eine Methode zur Identifizierung und Verfolgung einzelner Zellen durch ein Membransignal. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine modifizierte Zellverfolgungsmethode ( Abbildung 3 und Protokollabschnitt 4 ) verwendet.
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Abbildung 1 : Schematische Darstellung der sekundären Gaumendissektion der Maus. ( A ) Seitenansicht des E14.5-Maus-Embryos Um die Gaumenböden zu zerschneiden, wurde der Kopf auf die erste weiße, gepunktete Linie geschnitten. ( B, C ) Das obere Gehirn (oberhalb der zweiten weißen Linie, # 2) wurde entfernt. ( D, E ) Mündliche Ansicht des sezierten Kopfes Unterkiefer (# 3) wurde zerlegt und die Zunge (# 4) wurde entfernt. ( F ) Der hintere Teil des Kopfes entlang der Linie # 5 wurde ausgeschnitten. ( GI ) Sowohl die Oberkiefer (# 6, # 7) als auch der vordere Teil des Oberkiefers (# 8) wurden entfernt. ( JL ) Nasal Septum (# 9) wurde entfernt ( M ) GFP-Signale in der MES von seziertes Gaumen aus einem K14-cre; ROSA26 mTmG Maus Embryo. ( N ) Live-Imaging-Setup. Die mündliche Seite des KumpelsAß explant wurde nach unten gerichtet, um mit umgekehrtem konfokalen mikroskop abgebildet zu werden. MES wird mit weißen Pfeilspitzen ( FI ) angezeigt. Die abgebildete Fläche wird durch weiße punktierte Kästen in L und M. angezeigt. Maßstäbe = 2 cm in A, 1 cm in BI, 500 μm in JM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2 : Live-Bildgebung von Gaumen-Explantat-Kulturen. ( AE ) Live-Bildgebung des vorderen sekundären Gaumens von einem K14-cre; ROSA26 mTmG explant (5 μm Tiefe). Die weiße Pfeilspitze zeigt einen Membranvorsprung aus einer Epithelzelle ( FJ ) Live-Bildgebung des mittleren Gaumens von K14-cre; ROSA26 mTmG explant (5 μm dTiefe). Weiße Pfeile zeigen die Richtung der Zellwanderungen vom vorderen bis zum hinteren Gaumen an. ( KO ) Live-Bildgebung des vorderen Gaumens aus Lifeact-mRFPruby- Explantat (5 μm Tiefe). Epithelzellenverlagerung (gelber Pfeil) zur Mundoberfläche und Konvergenz zu einem integrierten MES mit kabelartigen Aktinstrukturen in der Mittellinie zu bilden. ( PT ) Live-Bildgebung des vorderen Gaumens aus Lifeact-mRFPruby- Explantat (25 μm Tiefe). Der rote Pfeil zeigt ein Zellextrusionsereignis ( Q, T ) an. Zukünftige Bruchstellen der Naht sind durch zwei vertikale weiße Pfeile in S und T gekennzeichnet. Maßstäbe = 20 μm. Alle Live-Bilddaten in dieser Figur stammen aus bereits in 6 veröffentlichten Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3 : Datenanalyse ( AD ) Um Epithelzellen mit Membran-GFP-Signalen von K14-cre zu verfolgen, ROSA26 mTmG Gaumen-Explantat ( A ), Eine Oberfläche wurde durch Volumenwiedergabe des Membran-GFP-Signals ( B ) erzeugt. Umgekehrte Bilder wurden nach dem Maskieren der erzeugten Oberfläche ( C ) erzeugt. Zellzentren wurden aus den invertierten Bildern unter Verwendung einer Spots-Detektionsfunktion in Imaris ( D ) identifiziert. ( E ) 3D-Rekonstruktionen erlauben die Verfolgung von Zellenbewegungen in mehreren Richtungen. A: anterior, P: posterior, N: nasal, O: oral ( F ) 2D-Analyse erzeugt ein Vantage-Diagramm, das Zellen zeigt, die von der vorderen zur posterioren Richtung im mittleren Gaumen MES wandern. Maßstäbe = 20 μm in AD, 10 μm in EF.S / ftp_upload / 56041 / 56041fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Video Abbildung 1: Live-Bildgebung von K14-cre; ROSA26-mTmG flox anterior Gaumen (5 μm Tiefe). Die Bilder wurden alle 10 min (10 min / frame) für 16 h 20 min, Scale bar = 25 μm aufgenommen. Dieses Video ist eine andere Z-Position eines Films, der zuvor in Referenz 6 veröffentlicht wurde . Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Klicken Sie mit der rechten Maustaste zum Herunterladen.)
Video Abbildung 2: Live-Bildgebung von K14-cre; ROSA26-mTmG flox Mittlerer Gaumen (5 μm Tiefe). Bilder wurden alle 15 min (15 min / frame) für 13 h 30 min, Scale bar = 25 μm aufgenommen. Dieses Video wurde zuvor in Referenz 6 veröffentlicht . Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Klicken Sie mit der rechten Maustaste zum Herunterladen.)
Video Abbildung 3: Live-Bildgebung von Lifeact-mRFPruby anterior Gaumen (5 μm Tiefe).
Bilder wurden alle 10 min (10 min / frame) für 7 h 50 min aufgenommen. Maßstab = 20 μm. Dieses Video wurde zuvor in Referenz 6 veröffentlicht . Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Klicken Sie mit der rechten Maustaste zum Herunterladen.)
Video Abbildung 4: Live-Bildgebung von Lifeact-mRFPruby anterior Gaumen (25 μm Tiefe).
Bilder wurden alle 10 min (10 min / frame) für 7 h 50 min aufgenommen. Maßstab = 20 μm. Dieses Video ist eine andere Z-Position eines Films, der zuvor in Referenz 6 veröffentlicht wurde . Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Klicken Sie mit der rechten Maustaste zum Herunterladen.)
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Discussion
Die Live-Bildgebung der Gewebemorphogenese mit der 3D-Organ-Explantat-Kultur kann detaillierte Informationen über zelluläre Prozesse liefern, die bei der herkömmlichen Färbeanalyse von festen Gewebeschnitten nicht gezeigt werden können. Unter Verwendung der in vitro explantischen Kultur des embryonalen Sekundärgaumens der Maus beobachteten wir einige interessante zelluläre Verhaltensweisen, die uns dazu führten, einen neuartigen Mechanismus der Gaumenfusion vorzuschlagen, der epitheliale Konvergenz und Zellextrusion beinhaltet.
Eine gemeinsame Herausforderung bei Studien dieser Art ist die Photobleichung durch kontinuierliche Laseranregungen über einen langen Zeitverlauf. In unseren Studien wurde ein weißes Licht konfokales und ein spinnendes Disk konfokales Mikroskop verwendet. Eine gewisse Abnahme der Signalintensität über die Zeit konnte durch Bleichkorrekturen in der Imaging-Software (LAS-AF) (Protokoll 4.1) korrigiert werden. Da die Bleichkorrektur begrenzt ist, ist es wichtig, die Laserleistung und die Belichtungszeit in jedem Bildsystem sorgfältig zu optimieren. Wir haben auch überprüftDiese Gaumenfusion tritt normalerweise in den lebenden Bildgebungsmedien nach 3-tägiger Kultur 6 auf .
Eine zweite gemeinsame Frage in der Live-Bildgebung ist Gewebedrift. Es ist entscheidend, die Drift zu minimieren, um konsistente Bilder während der Live-Bildgebung zu erhalten, da Änderungen in der Brennebene ein Verständnis von morphogenetischen Veränderungen im Laufe der Zeit vermitteln können. Während die Steuerung der thermischen Drift in vielen konfokalen Mikroskopen erreicht werden kann (definierter Fokus im Mikroskop), kann die Drift des Gewebes relativ zum Glasboden nicht durch diese Methoden korrigiert werden. Die Verwendung von Agarose sowie die Platzierung des Explantats gegen den Glasboden hilft, dies zu minimieren, aber es muss noch darauf geachtet werden, nur die Filme zu analysieren, die eine relativ konstante Position beibehalten. Dies kann bestimmt werden, indem man mehrere Kontrollpunkte im Bildgebungsfeld über die Zeit hinweist, um festzustellen, ob sie konstant bleiben, sich mit einem ähnlichen Trend bewegen oder sich anders bewegen. In gewissem Maße, mit Nachbearbeitung fuNationen erlauben eine Korrektur einiger Gewebedrift in der Live-Bildgebung (Protokoll 4.2).
Niedrigschmelzende Agarose wurde bei einer Endkonzentration von 0,6% in dem lebenden Bildgebungsmedium verwendet, um die explantierten Gewebe zu immobilisieren. Als wir höhere Konzentrationen von Agarose untersuchten, schienen sie die Gewebemorphogenese möglicherweise aufgrund mechanischer Einschränkung zu beeinträchtigen. Es ist daher wichtig, die richtige Agarosekonzentration zu verwenden, um die Gewebedrift zu minimieren, während die Morphogenese nicht gestört wird.
Aufgrund der konfokalen Bildgebungstiefe stellt diese Methode bei der Untersuchung sehr tiefer Z-Ebenen der Gaumenfusion Grenzen. Sowohl die WHITE LIGHT als auch die Spinndisketten-Konfokalmikroskope konnten Signale von 100 μm Tiefen erfolgreich abgebildet werden, obwohl das Bild über diese Grenze hinaus langweilig und schwach wurde. Weil die Gaumenfusion ein progressiver Prozess in den oronasalen und anteroposterioren Achsen ist, schlagen wir vor, dass die Abbildung mehrerer Positionen effektiv die Abbildung von verschiedenen Abtastungen ermöglichtHs der Gaumenfusion, aber zwei-Photonen- oder Lichtbogen-konfokale Mikroskopie kann in der Zukunft verwendet werden, um die Tiefe der Bildgebung zu verbessern. In den meisten unserer Experimente wurde die mündliche Seite der Gaumenforschungen abgebildet. Die Bildgebung der Nasenseite des Gaumen-Explantats ist schwierig, weil das Nasenseptum verschmolzen ist oder ganz in der Nähe der sekundären Gaumenböden liegt. In unseren Versuchen, die Fusion von der Nasalseite aus zu bildlich zu machen, war es auch notwendig, das zusätzliche Nasengewebe zu entfernen, so dass es das Signal des Gaumenepithels nicht störte. Obwohl es möglich war, war die Bildgebung der Nasenseite des Gaumen-Explantats schwierig, da die Sezierung des Nasenseptums oft die Gaumen-Explantate beschädigte.
Live-Imaging von Reporter Maus Gewebe Explantate ist eine leistungsstarke Methode, um zelluläre Mechanismen der Gewebe-Morphogenese während der embryonalen Entwicklung zu studieren. Mit konfokalen mikroskopischen Techniken und quantitativen Bildgebungsanalyse können grundlegende Entwicklungsprozesse wie Sekundärgaumenfusion seinAuf zellulärer Ebene untersucht
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Herrn Douglas Benson für erste Gespräche über die Sekundärgaumenabbildung. Wir bestätigen auch David Castaneda-Castellanos (Leica) und Chris Rieken (Zeiss) für ihre Hilfe, um die bildgebenden Bedingungen in der konfokalen Mikroskopie anzupassen. Wir schätzen Lynsey Hamilton (Bitplane) für hilfreiche Vorschläge für die quantitative Bildanalyse mit Imaris Software. Diese Arbeit wurde von NIH / NIDCR R01 DE025887 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
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