Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Live-Bildgebung der Maus-Sekundär-Gaumen-Fusion mit konfokaler Mikroskopie. Dieses Protokoll kann in Kombination mit einer Vielzahl von fluoreszierenden Reporter-Maus-Linien und mit Pfad-Inhibitoren für mechanistische Einsicht verwendet werden. Dieses Protokoll kann für die Live-Bildgebung in anderen Entwicklungssystemen angepasst werden.
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Methodenartikel
Live Imaging der Maus Sekundärer Gaumen Fusion
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Verschmelzung der sekundären palatinalen Regale zur Bildung des intakten sekundären Gaumens ist ein wichtiger Prozess in der Entwicklung von Säugetieren und ihre Störung kann zu Spalten-Sekundärgaumen führen, eine gemeinsame angeborene Anomalie beim Menschen. Sekundäre Gaumenfusion wurde ausführlich untersucht, was zu mehreren vorgeschlagenen zellulären Mechanismen führte, die diesen Prozess vermitteln können. Diese Studien wurden jedoch meistens an festen embryonalen Geweben zu fortschreitenden Zeitpunkten während der Entwicklung oder in festen explantierten Kulturen durchgeführt, die zu statischen Zeitpunkten analysiert wurden. Die statische Analyse ist für die Analyse von dynamischen morphogenetischen Prozessen wie eine Gaumenfusion begrenzt und welche Arten von dynamischen zellulären Verhaltensweisen die palatale Fusion vermitteln, ist unvollständig verstanden. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Live-Bildgebung der ex vivo sekundären Gaumenfusion bei Mausembryonen. Um zelluläre Verhaltensweisen der Gaumenfusion zu untersuchen, wurde epithelspezifisches Keratin14 -cre verwendet, um Gaumenepithelzellen in ROS zu etikettierenA26-mTmG- Flox- Reporter-Embryonen Um das filamentöse Actin zu visualisieren, wurden Lifeact-mRFPruby- Reporter-Mäuse verwendet. Die lebendige Bildgebung der sekundären Gaumenfusion erfolgte durch Sezieren von kürzlich adhärierten sekundären palatinalen Regalen von embryonalen Tag (E) 14,5-stufigen Embryonen und Kultivieren in agarosehaltigen Medien auf einer Glasbodenschale, um die Bildgebung mit einem umgekehrten konfokalen Mikroskop zu ermöglichen. Mit dieser Methode haben wir eine Vielzahl von neuartigen Zellverhalten während der sekundären Gaumenfusion nachgewiesen. Eine Anerkennung dessen, wie unterschiedliche Zellverhalten in Raum und Zeit koordiniert sind, trägt wesentlich zu unserem Verständnis dieses dynamischen morphogenetischen Prozesses bei. Dieses Protokoll kann auf mutierte Mauslinien angewendet werden, oder Kulturen, die mit pharmakologischen Inhibitoren behandelt werden, um das Verständnis darüber zu fördern, wie die Sekundärspalter-Fusion kontrolliert wird.
Einleitung
Tissue Fusion ist ein wichtiger Schritt in der Entwicklung von mehreren Organen. Wichtige menschliche Geburtsfehler wie Spaltlippe und Gaumen, Spina bifida und Missbildungen des Herzens können aus Defekten der Gewebefusion resultieren 1 . Maus-Sekundär-Gaumen-Fusion wurde intensiv untersucht, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu identifizieren, die die Gewebefusion in der Entwicklung 2 , 3 , 4 kontrollieren. In der Maus beginnt die sekundäre Gaumenentwicklung um etwa E11.5 mit dem Auswachsen eines sekundären palatinalen Regals aus jedem de....
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Protokoll
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Protokollen der University of California in San Francisco Institutional Animal Care und Use Committee durchgeführt.
1. Vorbereitung von Live Imaging Media
- Herstellung von flüssigen Kulturmedien
- Fügen Sie 20% fötales Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 U / mL Penicillin, 100 μg / ml Streptomycin, 200 μg / ml L-Ascorbinsäure, 15 mM HEPES zu Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 hinzu Medien.
HINWEIS: Live-Imaging-Medien wurden direkt vor der Bildgebung frisch gemacht. Dieses Medium enthält Phenol-Rot, das zu Phototoxizität über la....
- Fügen Sie 20% fötales Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 U / mL Penicillin, 100 μg / ml Streptomycin, 200 μg / ml L-Ascorbinsäure, 15 mM HEPES zu Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 hinzu Medien.
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Ergebnisse
Live-Bildgebung der Gaumen-Explantat-Kultur zeigte mehrere zelluläre Prozesse, die die Gaumenfusion vermitteln 6 . Die Anfangskontakte zwischen zwei Epithelzellen werden durch Membranvorsprünge hergestellt ( Abbildung 2 B-2E ). Wenn sich zwei Epithelschichten treffen, bilden sie eine mehrzellige, geschichtete MES, gefolgt von einer Interkalation, um eine integrierte Einzelzellschicht MES durch epitheliale Konvergenz h.......
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Diskussion
Die Live-Bildgebung der Gewebemorphogenese mit der 3D-Organ-Explantat-Kultur kann detaillierte Informationen über zelluläre Prozesse liefern, die bei der herkömmlichen Färbeanalyse von festen Gewebeschnitten nicht gezeigt werden können. Unter Verwendung der in vitro explantischen Kultur des embryonalen Sekundärgaumens der Maus beobachteten wir einige interessante zelluläre Verhaltensweisen, die uns dazu führten, einen neuartigen Mechanismus der Gaumenfusion vorzuschlagen, der epitheliale Konvergenz und Zellextr.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Wir danken Herrn Douglas Benson für erste Gespräche über die Sekundärgaumenabbildung. Wir bestätigen auch David Castaneda-Castellanos (Leica) und Chris Rieken (Zeiss) für ihre Hilfe, um die bildgebenden Bedingungen in der konfokalen Mikroskopie anzupassen. Wir schätzen Lynsey Hamilton (Bitplane) für hilfreiche Vorschläge für die quantitative Bildanalyse mit Imaris Software. Diese Arbeit wurde von NIH / NIDCR R01 DE025887 finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagenzien | |||
| DMEM/F12 | Life-Technologie | 11330-032 | |
| Fötales Rinderserum | Life-Technologie | 16000-044 | |
| L-Glutamin Life-Technologie | 25030-081 | ||
| L-Ascorbinsäure | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Niedrigschmelzende Agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35 mm Glasbodenschale | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Vaseline (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mäuse | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allel = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allel = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allel = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Mikroskop | |||
| White Light SP5 Konfokalmikroskop | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer Konfokalmikroskop mit rotierender Scheibe | Zeiss-Mikroskopie |
Referenzen
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birt....
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Nachdrucke und Genehmigungen
