Summary
Absorção de dopamina synaptosomal e ferramentas experimentais de cromatografia líquida de alto desempenho análise representam para investigar a homeostase de dopamina em camundongos avaliando-se a função do transportador de dopamina e níveis de dopamina no tecido striatal, respectivamente. Aqui nós apresentamos protocolos para medir o teor de tecido de dopamina e avaliar a funcionalidade do transportador de dopamina.
Abstract
Dopamina (DA) é um neurotransmissor moduladora, controlando a atividade motora, processos de recompensa e função cognitiva. Comprometimento da neurotransmissão dopaminérgico (DAergic) é fortemente associado com várias doenças associadas a sistema nervoso central, tais como a doença de Parkinson, transtorno déficit-hiperatividade e dependência de drogas1,2 ,3,4. Delinear os mecanismos de doença que envolvem o desequilíbrio DA é criticamente dependente de modelos animais para imitar os aspectos das doenças, e assim protocolos que avaliam a partes específicas do DA homeostase são importantes para fornecer novos insights e possível terapêutico alvos para estas doenças.
Aqui, apresentamos dois protocolos experimentais úteis que quando combinados fornecem uma leitura funcional do sistema de DAergic em camundongos. Parâmetros bioquímicos e funcionais na homeostase DA são obtidos através da avaliação dos níveis DA e de funcionalidade de transporte (DAT) dopamina5. Ao investigar o sistema DA, a capacidade de medir confiantemente níveis endógenos do cérebro de um adulto é essencial. Portanto, apresentamos como realizar a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) no tecido cerebral de ratos para determinar os níveis de DA. Podemos realizar o experimento no tecido do striatum dorsal (dStr) e núcleo accumbens (NAc), mas o método também é apropriado para outras áreas do cérebro DA-inervada.
DAT é essencial para a recaptação para o terminal pré-sináptica, assim, controlar a atividade temporal e espacial de DA. lançado Saber os níveis e a funcionalidade do DAT no striatum é de grande importância na avaliação DA homeostase. Aqui, nós fornecemos um protocolo que permite deduzir simultaneamente informações sobre níveis de superfície e função usando um ensaio de absorção de synaptosomal6 DA.
Atuais métodos combinados com protocolos padrão immunoblotting fornecem o pesquisador com ferramentas relevantes para caracterizar o sistema de DAergic.
Introduction
Dopamina (DA) é um neurotransmissor moduladora essencial para comportamento motor, recompensa e função cognitiva1,7,8,9. Desequilíbrios na homeostase DA estão implicados nas várias doenças neuropsiquiátricas como transtorno de déficit de atenção e hiperatividade, vício em drogas, depressão e doença de Parkinson1. DA é liberada a partir o neurônio pré-sináptica para a fenda sináptica, onde liga a e ativa receptores na membrana pré e pós-sináptica, transmitindo, assim, mais o sinal. O nível na sinapse após lançamento é espacial e temporalmente controlado por DAT3,10. O transportador sequestra do espaço extracelular e, portanto, sustenta fisiológica DA níveis3,11. Remoção de genética de DAT em camundongos faz com que um fenótipo hiperdopaminérgicas caracterizado por níveis elevados DA sinápticos, depleção de intracelular DA piscinas e mudanças profundas na pós-sináptica DAergic10,12de sinalização.
Aqui, apresentam-se dois protocolos separados, um método de medida DA tecido conteúdo e outro para avaliar a funcionalidade do DAT. combinado com o ensaio de superfície biotinylation descrito por Gabriel et al13 esses dois métodos fornecem informações sobre DA conteúdo e funcionais níveis de DAT para uma avaliação completa DA homeostase. Com estes métodos DA homeostase de vários ratos transgénicos ou modelos de doença pode ser caracterizado e descrito. Estas ferramentas foram implementadas e optimizadas e são de uso padrão em nossos laboratórios. Ensaios atuais têm servido para investigar as consequências sobre a homeostase de alterar o C-terminal da DAT14 ou expressam a recombinase Cre sob a Tirosina Hidroxilase (TH) promotor 5.
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Protocol
as orientações da Inspetoria dinamarquês de Experimentação Animal (número de permissão: 2017-15-0201-01160) foi seguido e experiências realizadas em uma instalação totalmente AAALAC credenciado sob a supervisão de um local ao bem-estar dos animal Comitê.
1. synaptosomal absorção de dopamina (método 1)
Nota: Este protocolo é para avaliação paralela de dois cérebros, mas pode ser utilizado com sucesso para realizar experiências de captação DA synaptosomal com quatro cérebros em paralelo.
- Preparações
- microcentrífuga de 1,5 mL de rótulo 48 tubos por tabela 1 (24 em cada cérebro). Use cores diferentes para os tubos pertencentes a cada cérebro para evitar a confusão entre amostras
- rótulo 51 cintilação tubos #1-51. Fosfato de
- lugar tampão salino (PBS) no gelo. Isso será usado para manter o cérebro refrigerado.
- Ativar o centrifugador para deixar arrefecer pre-4 ° C.
- Pre-pesar dois tubos de centrífuga de micro para obter o peso exato do tecido durante a preparação de synaptosomal (seção 2.6). Buffer de
- preparar homogeneização pela mistura de 4 mM HEPES e 0,32 M de sacarose. Ajustar o pH para 7,4 e manter no gelo
Nota: Tampão de homogeneização pode ser mantido em alíquotas a-20 ° C e descongelado no dia do experimento.
Buffer de absorção - preparar combinando-se o seguinte: 25mm HEPES, 120 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM de MgSO 4, 1mm o ácido ascórbico (0,194 g/L), 5 mM D-glicose (0,991 g/L). Ajustar o pH para 7,4 com NaOH (leva a uma concentração de sódio de cerca de 130 mM) e manter no gelo
Nota: Para 2 cérebros, prepare-se 1500 mL de tampão de captação. Preparar o buffer de captação como um 10 x solução sem ácido ascórbico e glicose mantido a 4 ° C. Make 1 x solução de trabalho recentemente no dia, completando com ácido ascórbico e glicose. Ajustar o pH com NaOH para 7.4.
Buffer de captação de preparar - + ligante combinando-se o seguinte: 25mm HEPES, 120 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaC l2, 1,2 mM de MgSO 4, 1mm o ácido ascórbico (0,194 g/L), 5 mM D-glicose (0,991 g/L), 1 pargyline μM, 100 desipramina nM, 10 nM Inibidor da Catecol-O-metil-transferase (COMT). Ajustar o pH 7,4 com NaOH e manter no gelo
Nota: Usar 50 mL de tampão de captação e adicionar ligante. Pargyline é adicionado para ajudar a prevenir a degradação pela oxidação através da monoamina oxidase (MAO). Inibidor da COMT (RO-41-0960) é adicionada para prevenir a degradação DA (catecolaminas em geral) pela COMT. Desipramina é adicionada ao inibir a absorção através dos transportadores de noradrenalina e serotonina e assim, tornar os resultados de absorção específica para DAT.
Buffer de captação de preparar - + ligante + cocaína combinando-se o seguinte: 25mm HEPES, 120 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM de MgSO 4, 1mm o ácido ascórbico (0,194 g/L), 5 mM D-glicose (0,991 g/L), 1 pargyline μM, 100 desipramina nM , 10 nM COMT inibidor, cocaína de 500 μM. Ajustar o pH para 7,4 com NaOH e manter no gelo
Nota: Use 7 mL de tampão de captação + ligante e adicionar a cocaína. Cocaína é adicionada para obter uma medição de fundo de captação DA não-específica para subtrair os dados, deixando apenas a absorção de DAT específicos (desde que SERT e NET são inibidas por desipramina conforme descrito acima). Alternativamente, um altamente potente e específico inibidor da DAT GBR-12935, pode ser usado em vez disso.
Importante: Manter tudo em gelo com .
- Synaptosomal preparação
- sacrificar um rato de cada vez por deslocamento cervical e decapitação.
- Cortar a pele com uma tesoura para revelar o crânio e corte qualquer excesso de tecido posterior do crânio esquerda de decapitação. Cortar o crânio com uma pequena tesoura reta ao longo da microporagem sagittalis terminando como anteriormente possível.
- Coloque as pontas da duas tesoura em cada olho do rato e corte no crânio para remover o restante do crânio e do cérebro intacto. Rapidamente Retire o cérebro e colocá-lo em PBS gelado. Isto irá mantê-lo frio, enquanto o segundo cérebro é dissecado.
- Usando uma matriz de cérebro, dissecar uma fatia de 3 mm coronal do striatum (ântero-posterior: +1,5 mm mm-1,50) seguida por uma dissecção mais fina com um perfurador. Veja a Figura 1 para área de soco.
- Manter o tecido no gelo em todos os momentos a avançar.
- Transferir o tecido para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para a pesagem.
Nota: Este peso será usado na etapa 1.2.14. - Repeat passo 1.2.1-1.2.6 para o segundo cérebro.
- Uma vez que o peso foi obtido para os cérebros, transferir o tecido para um vidro de homogeneização contendo 1 mL de tampão de homogeneização gelada.
- Homogeneizar o tecido usando um pilão motor conduzido a 800 rpm, 10 traços mesmo.
Nota: Um curso é igual a um acima e para baixo a ação, o primeiro traço deve ser cerca de 5 s, o seguinte 3-4 s. homogeneização em meio isotônico é importante para evitar o estouro do sinaptossomas 6. Usando a força apropriada e meio isotônico permitirá que os terminais pré-sináptica reseal delimitador citoplasma, vesículas sinápticas, mitocôndrias e citoesqueleto 15. - Transferir o homogeneizado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e coletar o restante homogenate de vidro a homogeneização enxaguando com 0,5 mL de tampão de homogeneização adicionais.
- Manter a amostra em gelo, enquanto o tecido do outro cérebro é homogeneizado. Executar os dois cérebros em paralelo em etapas 1.2.12-1.2.13.
- Núcleos de pelotas e detritos de células por centrifugação (1.000 x g, 10 min, 4° C).
- Transferir o sobrenadante (S1) (contendo as membranas celulares e citoplasma) para novos tubos de 1,5 mL microcentrifuga e centrifugar a 16.000 x g por 20 min a 4 ° C.
- Desprezar o sobrenadante (que contém o citoplasma) e ressuspender o precipitado (P2) (contendo sinaptossomas brutas) em tampão de homogeneização 40 μL / tecido mg (baseado no peso obtido na etapa 1.2.6). Resuspenda suavemente a fração synaptosomal bruta, com uma pipeta p1000 como muita força vai quebrar as sinaptossomas.
Nota: É importante acabar pelo menos 280 μL. Se não, será necessário diluir com mais de 40 μL por mg. 1.2.1-1.2.13 etapas devem ser executadas mais rápido possível, e tudo tem de ser mantido no gelo. Tão logo as sinaptossomas brutas tem sido resuspended no buffer de homogeneização são relativamente estáveis, enquanto são mantidos em gelo 6 , 15 , 16.
2. Experiência de absorção
- Adicionar 440 μL tampão de captação + ligante + cocaína para os designado 12 tubos de microcentrifuga de 1,5 mL e 440 buffer de captação μL + ligante para os 36 restantes tubos de microcentrifuga de 1,5 mL (ver tabela 1 para o layout).
Nota: Remova-os do gelo 15 min antes do início do experimento para trazê-los à temperatura ambiente, mas manter-se no gelo até então conservar inibidores. - Curva de saturação de preparar (dopamina (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H dopamina) (91,1 Ci/mmol) em diferentes concentrações finais (0,031, 0.0625, 0,125, 0,25, 0,5 e 1,0 μM)).
- Rotular seis tubos de 2ml microcentrifuga como 10, 5, 2,5, 1,25, 0.62 e 0,31.
- Buffer de captação μL adicionar 750 + ligante para os 5 tubos microcentrifuga com número mais baixo.
- Buffer de absorção 1,455.4 Adicionar μL + ligante, 14,6 dopamina μL (1 mM), 30 μl dopamina 3-H (11 μM) ao tubo rotulado 10.
- Transferência 750 μL do tubo rotulado 10 para o tubo de 5. Misture bem e transferir 750 μL deste tubo ao tubo de 2,5. Repita esta diluição com os restantes tubos.
- Pré-enxágue os filtros de microfibra de vidro com 4 mL de tampão de captação depois colocando-os em um balde de filtro bem 12. Microcentrífuga de 1,5 mL de
- Adicionar 10 μL de suspensão de membrana synaptosomal para as primeiras 24 tubos (ver tabela 1 para o layout) com tampão μL 440. Vórtice cuidadosamente e spin para baixo em breve para garantir que a sinaptossomas estão submersos no buffer. Deixar em 37 o C por 10 min.
Nota: É importante ser mais exato no times durante o experimento de absorção para uma comparação justa entre cérebros. Use um cronômetro para precisão. - Adicionar 50 μL de dopamina concentração 10 e 5 μm (seção 2.2) para o primeiro duas colunas e deixar em 37 o C por 5 min com agitação. Depois de exatamente 5 min, pare a reação adicionando 1 mL de tampão de captação gelada. Faça o mesmo com concentração 2,5 e 1,25 μM (seção 2.2) e, em seguida, com concentração 0.62 e 0,31 μM.
- Adicionar as amostras para os filtros de microfibra previamente enxaguado e lave com 4 x 5 mL de tampão de captação gelada. Quando as primeiras 12 amostras foram adicionadas aos filtros, mudar os filtros para tubos de cintilação. Repita isto com as próximo 12 amostras.
- Repeat passo 2.4-2.6 para o cérebro próximo.
- Contagem max 3 preparar tubos colocando um filtro de microfibra na parte inferior dos tubos de cintilação 49-51 e adicionando 25 µ l da concentração de dopamina máxima no topo (10 μM).
- Deixar todos os 51 tubos de cintilação em uma coifa de 1 h.
- Líquido de cintilação adicionar 3 mL de cada tubo de cintilação e agitação vigorosa num agitador por 1 h.
- Contagem [3 H]-em um beta-contador de 1 min.
- Abrir o programa e escolha: Label: H-3, placa/filtro: frasco de 4 mL, 4 por 6, tipo de ensaio: Normal e contando o tempo: 1 min.
Nota: Esta etapa pode ser realizada no dia seguinte se mais conveniente. Deixe amostras cobertas com papel alumínio durante a noite.
- Abrir o programa e escolha: Label: H-3, placa/filtro: frasco de 4 mL, 4 por 6, tipo de ensaio: Normal e contando o tempo: 1 min.
- Determinação da proteína
- usar um kit de ensaio da proteína de BCA padrão para determinar as concentrações de proteína das sinaptossomas de ajustamentos de contagens por minuto (cpm) μg/fmol/min e para comparação adequada de absorção entre as amostras.
3. Análise de dados
- usar os dados de captação experiência tornar-se uma saturação curva para cada grupo e calcular a taxa de reação (V max) e a constante de Michaelis Menten (K M).
Nota: O valor de K M reflete a concentração de substrato necessária para chegar a metade de V máx. Nesse sentido, V máx diretamente reflete a função do DAT (capacidade de absorção máxima), que depende do número de DAT na superfície e sobre como sua atividade pode ser modulada por modificações do posttranslational e/ou interação de proteínas, bem como na alterações em gradientes de íons. O valor de K M é uma medida indireta da afinidade de substrato para o transportador que, importante também pode ser modulada por modificações do posttranslational e/ou interação de proteínas. Para avaliar plenamente as alterações funcionais, portanto, é importante determinar diretamente os níveis de expressão de superfície por exemplo um ensaio de superfície biotinylation. Uma descrição da recaptação de dopamina e uma elaboração sobre o significado dos valores máximo de K, M e V foram revistas pelo Schmitz et al. 17.
4. Cromatografia líquida de alta eficiência (método 2)
- dissecação cerebral
- rótulo e pesar tubos microcentrifuga; um por região por rato.
- Sacrificar um rato de cada vez por decapitação e desconjunção do colo do útero. Remova rapidamente o cérebro conforme descrito na seção 1.2. Executar outras dissecação imediatamente.
- Usando uma matriz de cérebro, dissecar uma fatia de 3 mm coronal do striatum seguido mais fino bilateral dissecação do NAc e dStr com um perfurador. Veja a Figura 3 para área de soco.
- Transferir o tecido para tubos de 1,5 mL microcentrifuga e coloque rapidamente em gelo seco. Pesar o tecido e coloque-o no gelo seco imediatamente.
Nota: O peso do tecido é importante para o cálculo da concentração mais tarde.
Repita os passos de - 4.1.1-4.1.4 com o mouse próximo.
Nota: Coloque o tecido em 80 o C até posterior processamento ou imediatamente proceder ao processamento do tecido.
5. Preparação do tecido
- centrífuga de deixe-a esfriar previamente a 4 ° C
- preparar a solução de homogeneização (0.1 N perclórico ácido (HClO 4)) e fique na Ice.
- Usando solução de homogeneização, preparar um padrão de fresco 0.1 dopamina pmol/μL de uma solução stock de 1 mM (uma diluição 10.000 x).
Nota: A solução é preparada dissolvendo dopamina no buffer de homogeneização para uma concentração das ações de 1 mM, que pode ser mantida a 20 ° C por cerca de um mês. Se outras áreas do cérebro são de interesse, concentração da norma terá que ser modificado, desde que outras áreas do cérebro, incluindo o córtex prefrontral, hipocampo, substância negra e área tegmental ventral possuem até 100 vezes menos DA comparado ao striatum. - Adicionar solução de homogeneização 500 μL de cada amostra (ou seja, tecido NAc e dStr; seção 4.1) e homogeneizar as amostras usando um ultra-homogenizador na velocidade máxima por cerca de 30 s. manter a amostra em água gelada durante a homogeneização. Entre cada amostra, limpar o Homogenizador ultra com água (toda a velocidade para 30 s).
- Centrifugar as amostras por 30 min a 4 ° C, 14.000 g. x Amostra de
- de transferência de aproximadamente 200 μL para um vidro 0.22 μm filtro (1 cm de diâmetro), utilizando uma seringa de plástico de 1 mL.
Nota: O uso de filtros de vidro não é importante, desde que os filtros escolhidos são 0,22 μm para remover as substâncias de alto peso molecular. - Analisar amostras por detecção eletroquímica (CE)-HPLC metodologia 18 conforme descrito na seção 6.
6. Análise de cromatografia líquida alta performance
- Prepare a seguinte solução para a fase móvel: acetato de sódio 55 milímetros, octanesulfonic ácido 1 mM, Na 2 EDTA 0,1 mM, acetonitrilo 8%, ácido acético 0,1 M, pH = 3.2.
Nota: Ajuste o pH com o ácido acético 0,1 M. É importante ser mais preciso com o pH. A solução deve ser degassed pelo desgaseificador on-line (parte integrante do sistema de HPLC). Fazer 2 L da fase móvel e alterá-lo uma vez por mês (mudá-lo quando o ruído fica perceptível). Devido a flutuações leva cerca de 24 h para ajustar depois de mudar a fase móvel. - Instalação do detector:
- Set volts saída para 700 mV e temperatura para 32 ° C no forno detector; isto é muito importante. Fazer um programa de escala usando o manual on-line. Consulte o manual para mais detalhes). Adicionar o programa tempo conforme tabela 2.
Nota: Neste estudo, o programa é ajustado para mudar automaticamente a corrente em tempos de retenção ajustado, para manter a HPLC a corrente ideal e para manter os picos do cromatograma, sendo ampliado quanto possível, mas ainda no modo de exibição. Isto foi otimizado para striatal lysates de cérebro de ratos.
- Set volts saída para 700 mV e temperatura para 32 ° C no forno detector; isto é muito importante. Fazer um programa de escala usando o manual on-line. Consulte o manual para mais detalhes). Adicionar o programa tempo conforme tabela 2.
- Quando o programa foi adicionado ao detector, faz uma curva de calibração de 3 pontos, injetando o padrão três vezes (5, 10 e 15 μL).
Nota: Padrão (10 μL (10 μL x 0.1 pmol/μL = 1 pmol DA)) deve ser injetado a cada décima amostra e amostras calibradas para o padrão mais próximo. Fine tune o sistema o dia antes ajustando o padrão de 3 pontos, e verificando se o cromatograma sai dentro do intervalo esperado. Se for observado ruído substancial, mude a fase móvel. Se um pico superior a 990 mV então re-injetar a amostra em um volume menor, ou fazer um novo programa de gama e uma nova curva padrão. Limite de detecção é medido como 3 vezes o valor de ruído em mV para o menor valor de pico injectado a cada norma (ND, DOPAC, DA, 5-HIAA, HVA, 3-MT e 5-HT).- Sistema de set-up, abrindo a solução de LC e ativando começa de 1; esta análise no modo online. Digite a ID de usuário e senha e clique em okey. Espere a solução de LC para conectar instrumentos. Ir para tabela de lotes e preencha as informações de dados (por exemplo, tipo de amostra: desconhecido para amostras e std para padrão, tipo de análise:-QT, volume de inj: 10, ISTD amt: golpe de nível 1). Salve o arquivo (vá para arquivo - > salve o arquivo de lote como - > salvar).
- Que o sistema injete a primeira amostra pressionando ' lote iniciar '. Isso resultará na injeção de amostra de 10 μL pelo mostruário com um módulo de solvente entrega.
Nota: Utilize uma taxa de fluxo da bomba de 0,15 mL/min e uma coluna C18 com fase de reversão. Aqui, foi usado um detector amperométrico para a deteção de eletroquímica. O eletrodo de carbono vítreo deve ser definido para 0,8 V com um eletrodo de referência Ag/AgCl. Fim do ensaio dopamina, use 3 cromatografia µ ODS (3) C18 (DA 2 mm x 100 mm, partícula tamanho 3 µm) para conseguir a separação cromatográfica. - Extrair as áreas de pico registado e calculado.
- Ir para aquisição de dados a seguir o cromatograma quando tem terminado as amostras. Acesse a Lc análise post - > escolheu o nome do arquivo (o cromatograma abrirá) - > clique em ver. Na barra de integração manual, adicione todos os picos para ser integrado - > ir ao relatório de dados e imprima a leitura.
Nota: Aqui o software de solução LC foi usado para controle de sistema e análise de dados.
- Ir para aquisição de dados a seguir o cromatograma quando tem terminado as amostras. Acesse a Lc análise post - > escolheu o nome do arquivo (o cromatograma abrirá) - > clique em ver. Na barra de integração manual, adicione todos os picos para ser integrado - > ir ao relatório de dados e imprima a leitura.
- De áreas de pico, calcular a concentração de dopamina em uma amostra, como segue, usando a concentração conhecida do padrão:
- usar a área do pico do padrão (igual a 1 pmol) para adquirir o fator r.
- usar fator para obter a concentração das amostras.
Concentração da amostra (em pmol por 10 μL) = área do pico de fator A × da amostra - Use esta fórmula para obter a concentração da amostra em ng.
Amostra concentração pmol / 10 µ l x 500 µ l x MW de dopamina = concentração da amostra em ng
amostra concentração (ng) = concentração da amostra (em pmol por 10 μL) x 500 μL x MW de dopamina - usar a concentração da amostra no ng para obter t Ele concentração no tecido pg/g da amostra (amostra concentração em pg / g de tecido = tecido pg/g).
- usar a área do pico do padrão (igual a 1 pmol) para adquirir o fator r.
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Representative Results
Protocolo de captação DA corrente (Figura 1) inclui todas as etapas necessárias para avaliar a funcionalidade do DAT em sinaptossomas de ratos. Nossos dados representativos do método DA absorção (Figura 2) mostra uma curva de saturação com dados não corrigidas (Figura 2B) e ajustados dados (Figura 2A). A curva de saturação mostra captação de ratos tipo selvagem. Geralmente um faria DA captação para comparação com um rato mutante, que levaria a uma curva de saturação para cada genótipo5. Nesse caso, as diferenças entre o tipo selvagem e ratos mutantes em 2A e 2B podem ser explicadas por vários fatores. Mais aprofundado o experimentador está seguindo cada passo do protocolo, a menos diferença haverá entre retratando cru (2B) e dados de proteína ajustado (2A). The Most razões óbvias diferenças são i) impreciso pesando do tecido na etapa 1.2.6, ii) perda de tecido enquanto transfere para e do vidro de homogeneização no passo 1.2.8-1.2.10 e iii) Imprecisão enquanto transfere sobrenadante na etapa 1.2.13 e remoção de sobrenadante na etapa 1.2.14. Recomendamos realizar uma experiência preliminar em ratos de tipo selvagem para melhor precisão.
A dopamina método HPLC-CE (Figura 3) inclui todas as etapas necessárias para a quantidade de bundas DA dStr e NAc de ratos. Nossos dados representativos (Figura 4 e tabela 3) retratam o resultado de um experimento realizado em ratos de tipo selvagem.
Figura 1: fluxo de trabalho esquemático representando os diferentes passos na captação DA synaptosomal experimentar protocolo. O mouse é sacrificado por deslocamento cervical, seguido por dissecação cerebral e colocação em uma matriz de cérebro. Uma fatia de coronal espessura de 3 mm é dissecada do cérebro, e bem dissecação é realizada por um soco bilateral de uma pequena área imediatamente abaixo do corpo caloso. Striatum dorsal é homogeneizado em 1 mL de tampão de homogeneização por ruptura mecânica, seguida por 10 min centrifugação a baixa velocidade. Sobrenadante é transferido para um tubo limpo e centrifugado a alta velocidade por 20 min. A pelota, contendo as sinaptossomas, é ressuspensão e pronto para a experiência de captação. Absorção é realizada adicionando triplica dos diferentes [3H]-DA concentração, variando de uma concentração final de 0,031 a 1 μM. Além disso, as diferentes concentrações de tritiada DA são adicionadas a uma amostra de controle contendo 500 cocaína μM. Por último, as amostras são contadas em um beta-contador e análise de dados é executada, revelando a curva de saturação de DAT. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: representante resulta de uma experiência de absorção DA synaptosomal de quatro ratos de tipo selvagem C57Bl/6 de uma estirpe de rato cre-Drd1a. (A) dados representativos retratando a curva de saturação da captação DA através do DAT de preparações synaptosomal de ratos tipo selvagem (n = 4). Pontos pretos são os valores dos quatro ratos mostrados separadamente, que a curva verde mostra como dados normalmente iria ser retratados, combinando dados de 4-6 ratos por grupo. Este gráfico combina dados de quatro ratos. (B) o gráfico de saturação dos dados brutos, sem ajuste para a concentração de proteína real das amostras. Essencialmente, é a versão unadjusted dos dados em dados da. (C) controle. Este gráfico mostra as contagens de amostras contendo cocaína, que são usadas para subtrair o fundo a partir dos dados de captação. Este controle é essencial para determinar a confiabilidade dos dados de absorção, mas raramente é mostrado em artigos. Se este dados por algum motivo não mostra linearidade, isso indica um problema crítico com a afinação, que precisa ser identificado e resolvido para deduzir qualquer coisa a partir dos dados. R ao quadrado: n1 = 0.9852, n2 = 0.9584, n3 = 0.9606, n4 = 0.9913. (D) histograma mostrando a capacidade de absorção do DAT (VMAX). VMAX = proteína de μg/fmol/min ± 3,2 43.13). Dados são mostrados como média ± SEM. (E) histograma mostrando o KM para DAT ser 0.1 μM ± 0,03, bem correspondente ao método de voltametria de disco rotativo retratando valores KM de DAT para ser 0.6 μM19. Um valor de KM 0.1 μm corresponde, igualmente, bem como os valores de KM de 0,22 μM que tenham sido obtidos pelos modelos de estimulação de estimulada DA estouro no striatum20,21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: fluxo de trabalho esquemático representando os diferentes passos no protocolo de cromatografia líquida de alta eficiência. O mouse é sacrificado por deslocamento cervical, seguido por dissecação cerebral e colocação na matriz do cérebro. Uma fatia de coronal espessura de 3 mm é dissecada do cérebro, e bem dissecação é realizada por perfuração bilateralmente duas áreas menores, dividindo o corpo estriado no dStr e o NAc. Tecido é homogeneizado, seguido de centrifugação rápida. Um padrão com concentrações DA conhecida, bem como sobrenadantes das amostras são executados na HPLC, produzindo cromatogramas. As áreas dos picos diferentes são usadas para calcular a concentração nas amostras retratado em um histograma. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: resultados representativos de um experimento de cromatografia líquida de alta eficiência. (A), HPLC cromatograma para amostra de 10 μL de dStr injetado para um C18 coluna (2 x 100 mm), usada para pequenas moléculas. Tempos de retenção; 3,7 min para noradrenalina (NA), 6,7 min para ácido dihydroxyphenylacetic (DOPAC), 8,3 min para promotor, 10,7 min para o ácido 5-hydroxyindoleacetic (HIAA), 15,3 min para ácido homovanílico (HVA), 18,8 min para 3-methoxytyamine (3-MT) e 20,8 min para 5-hydroxtryptamine (5-HT). Apenas os valores para os picos DA calculam-se neste estudo. (B) histograma mostrando a concentração DA NAc e dStr baseado no chromatrogram. Análise HPLC de áreas striatal incluindo dStr e NAc de C57BL/6 ratos (n = 7). Dados são mostrados como média± SEM. 
indica uma alteração na resistência e foi adicionado para o cromatograma manualmente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 + coc | coc 5 + | 2.5 + coc | 1.25 + coc | 0,62 + coc | 0,31 + coc |
Tabela 1: Microcentrifuga layout de tubo para preparação de synaptosomal.
| Tempo | Gama | Filtro | Válvula | Auto zero | Deslocamento | Célula E |
| 0 | 1nA | 0.5 Hz | carga | Não | 30% | 0.7 V |
| 0.2 | 1nA | 0.5 Hz | carga | conjunto | 30% | 0.7 V |
| 5 | 500pA | 0.5 Hz | carga | Não | 30% | 0.7 V |
| 5.2 | 500pA | 0.5 Hz | carga | conjunto | 30% | 0.7 V |
| 9.4 | 200pA | 0.5 Hz | carga | Não | 30% | 0.7 V |
| 9.6 | 200pA | 0.5 Hz | carga | conjunto | 30% | 0.7 V |
| 12 | 100pA | 0.5 Hz | carga | Não | 30% | 0.7 V |
| 12.2 | 100pA | 0.5 Hz | carga | conjunto | 30% | 0.7 V |
| 16.2 | 50pA | 0.5 Hz | carga | Não | 30% | 0.7 V |
| 16.4 | 50pA | 0.5 Hz | carga | conjunto | 30% | 0.7 V |
| 25 min de tempo do fim | ||||||
Tabela 2: Programa de tempo HPLC utilizado neste estudo.
| # Pico | Tempo de RET. | Área | Altura | % De área | % Da altura |
| 1 | 3.745 | 230451 | 18500 | 0.299 | 0.626 |
| 2 | 6.691 | 5573485 | 382143 | 7.228 | 12.922 |
| 3 | 8.336 | 13209342 | 510378 | 17.131 | 17.258 |
| 4 | 10.760 | 16443198 | 831182 | 21.325 | 28.106 |
| 5 | 15.344 | 7129795 | 282473 | 9.247 | 9.552 |
| 6 | 18.830 | 11279424 | 346248 | 14.628 | 11.708 |
| 7 | 20.846 | 23241754 | 586419 | 30.142 | 19.829 |
| Total | 77107450 | 2957344 | 100.000 | 100.000 |
Tabela 3: análise de pico, mostrando a área e a altura dos picos diferentes usados para calcular as concentrações mostradas na Figura 4B .
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Discussion
Este manuscrito descreve protocolos experimentais úteis para delinear DA homeostase em qualquer modelo do rato da escolha. Nós fornecemos protocolos detalhados para medição de níveis no tecido cerebral de ratos usando HPLC e synaptosomal DA absorção para avaliar funcional DA transporte através de DAT. Os procedimentos, protocolos e limites para o experimento HPLC e ensaio de absorção DA synaptosomal serão elaborados abaixo.
O protocolo de captação synaptosomal pode fornecer uma visão útil para a funcionalidade de DAT. combinado com uma superfície biotinylation experimento13, conhecimento sobre a quantidade total, nível da superfície e funcionalidade de DAT pode ser obtido. Dado o papel importante de DAT e sua influência na transmissão DA e sua participação em várias doenças, tem sido dos principais objetivos estabelecer ensaios que podem modelar a função DAT. Uma das vantagens da experiência synaptosomal DA absorção é que pode ser post realizada no vivo manipulações tais como sobre manipulação de chemogenetic, como bem como diferentes na vivo tratamentos medicamentosos ou comportamentais, treinamento para além investigações em ratos geneticamente modificados. Tratamento da toxicodependência pode ser realizado após a preparação de synaptosomal, em vez de na vivo se preferirem, tornando possível testar o efeito de drogas em DAT diretamente22.
Alternativas ao realizar synaptosomal DA absorção, é realizar experiências de captação ou em culturas de células DAT transfectada ou em culturas neuronal naturalmente expressando o transportador. Ensaios de cultura de células podem ser preferenciais para investigações iniciais em diferentes modificações de DAT23, considerando culturas primárias neuronais com o transportador endógena podem fornecer uma imagem mais fisiologicamente confiável do transportador função em vivo. Apesar de culturas neuronal são feitas diretamente a partir de animais, há vantagens de usar sinaptossomas em vez disso. Culturas neuronal são normalmente feitas de neurônios pré-natal ou imaturos, que possam influenciar a função e a expressão de DAT, enquanto synaptosomal preparações representam preparações fisiológicas que podem ser obtidas de animais adultos e até o velho sem dificuldades de6,14.
Existem várias vantagens de usar o experimento de absorção synaptosomal para investigar a função do DAT, mas limitações importantes têm que ser considerados. As sinaptossomas limitaram a viabilidade6. Mantê-los no gelo é essencial para obter resultados confiáveis, com baixas variações. Se manteve no gelo e fornecidos os nutrientes necessários, purificadas sinaptossomas são viáveis por horas e pegar e liberar neurotransmissores eficientemente15. É possível congelar sinaptossomas, mas o método de congelamento é de grande importância15. Pequenas variações no procedimento experimental podem levar a extensas variações no resultado. Portanto, os protocolos experimentais devem ser otimizados em condições de tipo selvagem (por exemplo, ratos de tipo selvagem) até obtêm-se resultados reprodutíveis e então as comparações podem ser feitas seguindo várias manipulações genéticas ou farmacológicas. Ensaio de absorção DA synaptosomal é uma ferramenta experimental fácil, confiável e válida para aquisição de dados podem ser reproduzidos com uma variação muito baixa em um parâmetro chave na DA homeostase, funcionalidade DAT (Figura 2A). As limitações são fortemente compensadas pelas vantagens de ser capaz de realizar o experimento sobre terminações nervosas preservada de ratos adultos6.
Os métodos atualmente utilizados para analisar os níveis no tecido são suportados por métodos histoquímicos, desenvolvidos na década de 1950. A importância do desenvolvimento de métodos como HPLC para medir os níveis DA, tem sido evidente desde descobrindo a substancial diminuição dos gânglios basais dos pacientes de Parkinson, fundando, assim, o princípio do tratamento de pacientes que sofrem de mal de Parkinson com l-dopa,24. Desde sua descoberta, foram desenvolvidas técnicas mais avançadas de análise de tecido de níveis DA, mas como com qualquer outras técnicas existem armadilhas. Uma das principais armadilhas dessas técnicas é a natureza instável de monoaminas (dopamina, noradrenalina e serotonina). Como preparar corretamente a preparação do tecido para evitar perda de monoaminas tem sido discutido em detalhes por Atack et al 25 e não serão discutidos mais neste artigo, exceto ao salientar a importância da colocação do tecido no gelo seco diretamente após a dissecação e não adicionar a solução de homogeneização até imediatamente antes da análise HPLC. De nossa experiência, tecido pode ser mantido em-80 oC por até um mês sem qualquer degradação da DA se nenhuma solução foi adicionada. Atack et al discutir a preparação do tecido para métodos variando o método de espectrometria de fluoro para métodos avançados de HPLC, permitindo um limite de detecção reduzidos a 3 ng/mL tecido25. O método que descrevemos neste trabalho baseia-se nos mesmos princípios. Atuais tecnologias avançadas permitem mais refinadas análises e detecção de níveis em concentrações fmol. Usando uma técnica HPLC fluorescente, análise de monoamina ainda mais robusto pode ser obtido26. Devido a robustez do método, HPLC é amplamente utilizada para obter informações sobre as alterações nos níveis de monoaminas e precursores e metabolitos em várias regiões do cérebro, tais como Procurador no corpo estriado, para validar modelos de doença de Parkinson em ratos, macacos e 28,de27,miniporcos29. Aqui, podemos realizar o experimento em tecido de dStr e NAc, mas o método também é apropriado para outras áreas do cérebro DA-inervada, tais como o córtex prefrontral, hipocampo, substância negra e área tegmental ventral 30. Nestas áreas, uma amostra-padrão mais diluída será necessária para a correcta determinação dos níveis DA. Nossa análise do conteúdo DA mostram níveis mais elevados em striatal subcompartments comparados com investigações anteriores, mas isso pode ser explicado experimentalmente. Primeiro, nós ter dissecado duas partes do corpo estriado (NAc e dStr) em vez de investigar o todo corpo estriado, que pode compensar a diferença em comparação com anteriores relatórios12,31. Medições de striatal terá níveis DA mais baixos em comparação com medições em dStr pura, desde que os níveis no NAc são substancialmente mais baixas em comparação com dStr. Também temos estudos anteriores confirmando nossa de níveis DA5.
Cada ensaio tem suas limitações. Os ensaios são desenvolvidos em uma tentativa de modelar e fornecer informações sobre aspectos específicos de um processo celular, e eles podem deixar possíveis detalhes importantes ou fornecer um retrato muito generalizado do processo do mundo real. Uma limitação importante a considerar ao escolher HPLC, é que apenas fornece um instantâneo dos níveis de neurotransmissor. No entanto, os níveis do neurotransmissor são propensos a flutuar ao longo de um dia, semana ou mês32,33, que enfatiza a necessidade de obter amostras em uma janela de tempo estreita, em vez de comparar amostras colhidas em horas, dias ou meses separados como no entanto foram tiradas na mesma hora. No entanto, dados HPLC podem fornecer informações úteis sobre o conteúdo DA e revelam níveis alterados aberrantes, tais como aqueles demonstram pelo DAT-KO e rato transgénico DAT-KD linhas, onde a exclusão genética ou knock-down do DAT significativamente influencia DA homeostase por perturbadora DA recaptação. Estes dados furthermore demonstrar que piscinas de striatal DA consistem principalmente DA sequestrado ao invés de-novo sintetizado dessa reposição de piscinas de striatal intracelular DA é criticamente dependente do processo de recaptação12,34. Uma armadilha importante a considerar é que a dissecção de tecidos pode limitar uma descrição mais específica e precisa do conteúdo em uma área do cérebro DA qualquer momento. A variação DA concentração em áreas diferentes do cérebro varia muito. Portanto, a precisão de dissecação é de grande importância, que pode ser melhorada por dissecando áreas menores para garantir que apenas o tecido da área de interesse está incluído.
Uma medida mais funcional das piscinas DA endógenas pode ser analisada usando microdialysis. Isto foi desenvolvido e pioneiro por Ungerstedt et al. usando o microdialysis vertical sonda35. A técnica do microdialysis torna possível medir as concentrações de monoamina no cérebro dos animais movimentando-se livremente e em estruturas cerebrais diferentes. Outra vantagem da técnica microdialysis sobre a recolha de amostras de tecido através de HPLC é a opção para medir e acompanhar as mudanças de monoamina sobre uma grande janela de tempo. Esta é uma vantagem considerável em relação a amostragem de tecido cerebral, onde apenas um ponto do tempo é possível por animal como o protocolo HPLC. Enquanto, microdialysis pode fornecer insights sobre a liberação DA, amostragem de tecido seguida por HPLC em vez disso irá revelar alterações nas piscinas endógenas e a vesicular DA. Para obter informações em tempo real sobre a cinética de liberação em várias áreas do cérebro, métodos como voltametria cíclica rápida varredura36,37 ou chronoamperometry de alta velocidade38 pode ser implementada.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo UCPH 2016 programa de excelência (U.G., A.R., K.J.), a Fundação Lundbeck (M.R.) a Fundação Lundbeck centro de biomembranas em nanomedicina (U.G.), o nacional Instituto de saúde subsídios P01 DA 12408 (U.G.), o dinamarquês Conselho para a investigação independente - ciências médicas (U.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
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