Este protocolo descreve um processo analítico eficiente e conveniente de extração de amostra e determinação simultânea de múltiplas drogas, doxorrubicina (DOX), mitomicina C (MMC) e um metabólito tóxico cardio DOX, doxorubicinol (DOXol), no biológico amostras de um modelo de tumor de mama pré-clínico tratadocom com formulações de nanopartículas de combinação sinérgica de drogas.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Extração de amostra e quantificação cromatográfica simultânea de doxorrubicina e mitomicina C após entrega de combinação de drogas em nanopartículas para ratos de Tumor-rolamento
Neste artigo
Resumo
Resumo
Quimioterapia de combinação é frequentemente usada na clínica para tratamento de câncer; no entanto, os efeitos adversos associados ao tecido normal podem limitar seu benefício terapêutico. Combinação de drogas baseados em nanopartículas foi mostrada para atenuar os problemas encontrados pela terapia de combinação livre de drogas. Nossos estudos anteriores têm demonstrado que a combinação de duas drogas anticâncer, doxorrubicina (DOX) e mitomicina C (MMC), produziu um efeito sinérgico contra ambos murino e células de câncer de mama humano em vitro. Nanopartículas de híbrido de polímero carregado co-lipídico DOX e MMC (DMPLN) através de várias bombas de transportador de efluxo que conferem multirresistência e demonstrada eficácia reforçada em modelos de tumor de mama. Em comparação com formas de solução convencional, tal eficácia superior de DMPLN foi atribuída à farmacocinética sincronizada de DOX e MMC e biodisponibilidade de aumento intracelular de drogas dentro de células de tumor habilitado pelo nanocarreador PLN.
Para avaliar a farmacocinética e bio-distribuição de co administrado DOX e MMC em solução livre e formas de nanopartículas, um método de análise de múltiplas drogas simples e eficiente usando reverso-fase de alto desempenho foi de cromatografia líquida (HPLC) desenvolvido. Em contraste com os métodos anteriormente relatados que analisaram DOX ou MMC individualmente no plasma, esse novo método HPLC é capaz de dosar simultaneamente DOX, MMC e um metabolito principal de DOX cardio-tóxico, doxorubicinol (DOXol), em diferentes matrizes biológicas ( por exemplo, sangue total, tumor de mama e coração). Uma dupla sonda fluorescente e ultravioleta de absorvente 4-methylumbelliferone (4-MU) foi usado como um padrão interno (I.S.) para a deteção de uma etapa de análise de drogas múltiplas com comprimentos de onda diferentes da deteção. Este método foi aplicado com sucesso para determinar as concentrações de DOX e MMC entregado por abordagens tanto nanopartículas e solução no sangue e vários tecidos em modelo murino de tumor de mama um ortotópico. O método analítico apresentado é uma ferramenta útil para a análise pré-clínico de entrega baseados em nanopartículas de combinações de drogas.
Introdução
A quimioterapia é uma modalidade de tratamento primário para muitos tipos de câncer ainda é frequentemente associado com efeitos adversos graves e eficácia limitada devido a resistência às drogas e outros fatores1,2,3. Regimes de combinação de drogas para melhorar o resultado da quimioterapia, foram aplicados na clínica com base em considerações como toxicidades não-sobreposição, diferentes mecanismos de ação de drogas e drogas não-cruz resistência4,5 , 6. em ensaios clínicos, uma me....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Animal conta Comissão de University Health Network no Ontario Cancer Institute e conduzidos de acordo com o Conselho canadense sobre as orientações de cuidado Animal.
1. preparação da amostra biológica
- coletar o sangue total, os principais órgãos e tumor de mama nos pontos de tempo predeterminados após administração intravenosa (IV) de contendo fármaco formulações (por exemplo, DMPLN, DOX lipossomal)
- injetar um peito tumor-rolamento do mouse IV com uma formulação contendo fármaco preparada.
- Anestesiar o mouse nos pontos tempo desi....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Duas drogas anticâncer, DOX e MMC, bem como o metabólito DOX, DOXol, foram detectado simultaneamente sem qualquer interferência biológica sob a condição HPLC aplicada mesma gradiente usando 4-MU como o I.S. para os detectores de UV e fluorescência. DOX, MMC, DOXol e 4-MU foram bem separados uns dos outros com tempos de retenção de 5,7 min para MMC, 10,4 min para DOXol, 10,9 min para 4-MU e 11,1 min para DOX (Figura 2). Cada fármaco no sangue e vários tecidos .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Em comparação com outros métodos cromatográficos que permitem a detecção de uma espécie única droga de cada vez, o presente protocolo HPLC é capaz de dosar simultaneamente três compostos de drogas (DOX, MMC e DOXol) na mesma matriz biológica sem a necessidade de mudar a fase móvel. Esse método de preparação e análise tem sido aplicado com sucesso para determinar a farmacocinética e bio-distribuição de dois sistemas de entrega de drogas baseados em nanopartículas (i.e., lipossomal DOX e DMPLN)22.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes e conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores reconhecem com gratidão a concessão de equipamentos da ciência Natural e pesquisa de engenharia (NSERC) Conselho de Canadá para HPLC, a subvenção de funcionamento do Instituto canadense de pesquisa de saúde (CIHR) e pesquisa de câncer de mama canadense (CBCR) Aliança para X.Y. Wu e a bolsa da Universidade de Toronto para R.X. Zhang e T. Zhang.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Doxorrubicina | Polymed Theraeutics | 111023 | medicamento anticâncer |
| Mitomicina C | Polymed Theraeutics | 060814 | medicamento anticâncer |
| Doxorrubicinol (DOXol) | Toronto Research Chemicals | D558020 | Metabólito do |
| sal de sódio DOX 4-metilumbeliferona | Sigma-Aldrich | M1508 | Padrão interno |
| Myristic Acid | Sigma-Aldrich | 544-63-8 | Materiais para nanopartículas híbridas polilipídicas |
| Espectro de estearato de polioxietileno (100) | M1402 | Materiais para nanopartículas híbridas polilipídicas | |
| Polioxietileno (40) Estearato | Sigma-Aldrich | P3440 | Materiais para nanopartículas híbridas polilipídicas |
| Pluronic F68 (PF68) | BASF Corp. | 9003-11-6 | Materiais para nanopartículas híbridas polilipídicas |
| Ultrassom (UP100H) | Hielscher, Tecnologia de Ultrassom | NA | Preparação de nanopartículas |
| Banho-maria (ISOTEMP 3016HS) | Fisher Scientific | NA | Preparação de nanopartículas |
| Doxorrubicina lipossomal (Caelyx) | Janssen | Comprado na farmácia Princess Margaret Hospital | Formulação de nanopartículas clinicamente aprovada |
| Metanol graduado por HPLC | Caledon Chemicals | 6701-7-40 | Composição de fase móvel HPLC |
| Classificação HPLC H2O | Caledon Chemicals | 8801-7-40 | HPLC composição de fase móvel |
| Acetonitrila graduada por HPLC | Caledon Chemicals | 1401-7-40 | Composição da fase móvel da HPLC |
| Ácido trifluoroacético | Sigma-Aldrich | 302031 | Composição da fase móvel da HPLC |
| 0,45 μ m Papel de filtro de membrana de nylon | Whatman | WHA7404004 | HPLC preparação de fase móvel |
| 1cc Seringas de plástico | Becton, Dickinson and Company | 2606-309659 | Injeção de tratamento |
| 5cc Seringas de plástico | Becton, Dickinson and Company | 2608-309646 | Coleções de tecidos |
| 30G 1/2 agulhas | Becton, Dickinson and Company | 305106 | injeção de tratamento |
| Agulhas 25G 5/8 | Becton, Dickinson and Company | 305122 | Coleções de tecidos |
| Estéril 0,9% Salino | Universidade de Toronto Marca da Casa | 1011 | Perfusão de tecidos |
| 13 ml Tubo cônico de fundo arredondado | SARSTEDT | 62.515.006 | Proliproleno, homogeneização de tecidos |
| Meio Essencial Mínimo Alfa (MEM) | Gibco | 12571063 | Cell medium |
| 1 x Tampão de fosfato Salino | Gibco | 10010023 | Homogeneização de tecidos |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100 ML | Homogeneização de tecidos |
| Ácido fórmico | Caledon Chemicals | 1/5/3840 | Ajuste o pH para solvente de extração |
| Tubos de plástico pulverizados com heparina sódica | Becton, Dickinson and Company | 367878 | Coleta de Sangue |
| Balança de Pesagem Analítica | Sartório | CPA225D | medidores de |
| pH NA | Fisher Scientific | 13-637-671 | accumet BASIC |
| Vortex Mixter | Fisher Scientific | 02-215-365 | Amostras de vórtice na velocidade desejada |
| 1.5 ml Tubo de microcentrífuga | Fisherbrand | 2043-05408129 | Homogeneizador Prolyprolene |
| Modelo 1000 | Fisher Scientific | 08-451-672 | Centrifugador de homogeneização de tecidos |
| 5702R | Eppendorf | 5702R | Preparação de extração |
| Sistema de evaporador aquecido | Glas-Col | NA | Reconstituição de amostras |
| Frascos de rosca de parafuso HPLC | DIKMA | 5320 | Injeção de amostra de HPLC |
| Tampas de rosca HPLC com septos de silicone branco PTFE | DIKMA | 5325 | Injeção de amostra de HPLC |
| Inserção de polipropileno HPLC | Agilent Technologies | 5182-0549 | Volume máximo 250 μ l, injeção de amostra de HPLC |
| Xbridge C18 Column | Waters Corporation | 186003117 | Análise de drogas |
| Bomba gradiente | Waters Corporation | W600 | Amostrador automático de análise de drogas |
| Waters Corporation | W2707 | ||
| Detector de matriz de fotodiodos de análise de drogas | Waters Corporation | W2998 | Análise de medicamentos |
| Multi λ detector de fluorescência | Waters Corporation | W2475 | Análise de drogas |
| EMPOWER 2 | Waters Corporation | NA | Software de análise de dados |
| Scientist | Micromath | NA | Análise farmacocinética |
| Camundongos Balb/c fêmeas | Jackson Laboratory | 001026 | In vivo |
| EMT6/WT Células de câncer de mama | fornecidas pelo Dr. Ian Tannock; Instituto do Câncer de Ontário | NA | In vivo |
Referências
- Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, D. B., Johnston, P. G. Cancer Drug Resistance: An Evolving Paradigm. Nat. Rev. Cancer. 13 (10), 714-726 (2013).
- Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Booth-Genthe, C., Gottesman, M. M. Targeting Multidrug Resistance in Cancer. Nat Rev Drug Discov. ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
