一种利用三维高频超声成像对小鼠早期妊娠进行表征的新方法

摘要

小鼠被广泛用于妊娠生物学的研究。然而，此类研究需要终止妊娠，从而无法进行纵向观察，并且需要使用大量动物。因此，我们描述了一种无创的高频超声成像技术，用于在妊娠小鼠中早期检测和监测着床后的事件。

摘要

高频超声成像（HFUS）是一种常见的无创方法，用于实时监测人类胎儿在子宫内的发育过程。in utero。小鼠通常被用作in vivo模型来研究胚胎着床及妊娠进展。然而，此类小鼠研究通常需要终止妊娠，才能进行后续的表型分析。为解决这一问题，我们采用高频超声成像数据的三维（3-D）重建技术，以实现对小鼠胚胎着床部位的早期检测及其个体发育进程的表征in utero。通过结合高频超声成像与三维重建及建模技术，我们能够准确量化胚胎着床部位的数量，并利用换能器对C57BL6J/129S妊娠小鼠从交配后5.5天（d.p.c.）至9.5 d.p.c.的发育进程进行连续监测。测量指标包括：着床部位的数量、位置和体积，以及着床部位之间的间距；胚胎存活情况通过心脏活动监测进行评估。在着床后的早期阶段（5.5至8.5 d.p.c.），以网格和实心覆盖形式对妊娠子宫进行三维重建，可直观呈现每个子宫角内正在发育的妊娠结构。随着基因工程小鼠被持续用于表征由子宫功能障碍引起的雌性生殖表型，该方法为在活体条件下检测、量化和表征早期着床事件提供了新途径in vivo。这种三维高频超声成像的新应用展示了在非侵入性条件下成功检测、可视化并表征小鼠早期妊娠中胚胎着床部位的能力。该技术相较于依赖终止妊娠以进行大体组织学和组织病理学分析的现有方法，具有显著改进。本文通过视频与文字形式，详细描述如何成功开展小鼠早期妊娠超声检查，以获得可靠且可重复的数据，并重建出子宫形态的网格状与实心三维图像。

引言

复发性早期妊娠丢失是受孕后最常见的并发症之一，影响约1%的备孕夫妇^1,2。早期妊娠丢失的潜在机制多种多样：包括胚胎自身异常、母体合并症以及子宫内膜容受性缺陷等^1,3,4。由于小鼠具有良好的遗传可操作性，已被广泛用于早期胚胎着床及妊娠过程的研究。此外，小鼠妊娠周期短，并可进行大规模实验，使其在解答人类生殖医学中的关键临床问题方面发挥着日益重要的作用⁵。然而，目前绝大多数小鼠实验设计仍需在妊娠的不同时间点连续处死大量雌鼠，以定量和分析妊娠期间着床部位的位置、数量、大小及分布模式^6,7,8，因而无法在同一动物个体上开展纵向研究。

在临床中，超声是一种可靠且不可或缺的工具，可用于以无创方式监测人类胎儿的存活状况和发育情况^9,10

方案

这些研究均按照美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）发布的《实验动物护理与使用指南》进行，并经贝勒医学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，批准协议编号为 AN-4203。

1. 超声检查前对妊娠小鼠的准备

1. 定时交配
   1. 将雌鼠与已知具有生育能力的雄鼠在1700之后过夜合笼。无论是否发现阴道栓，均应在次日0700前将雌鼠与雄鼠分离，以确保妊娠日期的准确判定。
      注：交配后的次日早晨记为受孕后0.5天（d.p.c.）。
2. 超声检查前准备
   1. 将怀孕小鼠放入密封的麻醉诱导容器中。
   2. 使用异氟烷（2%）吸入麻醉剂和氧气（1 L/min）进行镇静，直至动物失去翻正反射（根据小鼠体型，约需1-2分钟），且除呼吸外无其他自发性活动。
   3. 将镇静后的小鼠仰卧置于鼻罩中，持续给予异氟烷（2%）吸入麻醉剂和氧气（1 L/min）。在动物眼睛上涂抹眼用软膏。
   4. 用棉签将脱毛膏均匀涂抹于整个腹部，范围从胸骨至阴道，并延伸至体侧。
   5. 脱毛膏停留时间不超过3分钟，随后用纸巾清除脱毛膏及毛发。务必确保所有毛发均被清除，因残留毛发会降低图像质量。
   ....

结果

如所示 图1高频超声可在妊娠5.5天（d.p.c.）时即检测到着床部位的发育。在6.5 d.p.c.时，利用回声较强的蜕膜化子宫内膜作为着床部位的标志，可对着床部位的数量及其分布间距进行定量分析。随着妊娠进展至7.5 d.p.c.，低回声的孕囊和胎芽亦可清晰识别。

如图2所示，可对小鼠子宫三维重建的完整后处理结果进行可视化观察。在6.5 d.p.c.时，可通过网格和实体叠加两种形式的三维高频超声图像组合提供直观的视觉呈现。另一个示例为7.5 d.p.c.时的图像，展示了另一例子宫的最终复合图像，包含网格与实体叠加模式。

讨论

这种三维高频超声（3-D HFUS）成像的新应用展示了在小鼠早期妊娠期间以非侵入性方式成功检测、可视化和表征胚胎着床部位的能力。该技术相较于现有方法具有显著优势，现有方法依赖于终止妊娠以进行大体组织学和组织病理学分析。然而需要指出的是，当需要在更高倍数和更细的细胞水平上进行表征，或需要进行基因和蛋白质分析时，组织学方法仍被认为是更优选择。随着越来越多的新小鼠模型表现出着床缺陷和早期妊娠丢失^19,20,21,22，这种先进超声技术能够从妊娠5.5天（d.p.c.）起检测早期妊娠，明显优于早期仅能在妊娠中期进行检测的超声方法^12,13。此外，该方法可在心脏开始跳动的8.5至9.5 d.p.c.期间即检测到心脏运动²³

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
VisualSonics Vevo 2100 超声成像平台/设备	VisualSonics, inc.	VS-11945
Vevo 成像工作站	VisualSonics, inc.	SA-11982
Aquasonic 100 超声传导凝胶	Parker	#SKU PLI 01-08
异氟烷（IsoThesia）100 mL 瓶装	Henry Shein	#29404
PuraLuben 动物眼科软膏	Dechra	#12920060