Summary
提出了一种人脑脊液内源性多肽的质谱分析方法。通过采用分子量切断过滤、色谱预分馏、质谱分析以及随后的多肽识别策略组合, 就可以将已知的脑脊液 peptidome 扩大近十倍以前的研究。
Abstract
本协议描述了一种用于识别人脑脊液中内源性多肽的方法。为此, 本文提出了一种基于分子量分子过滤和质谱分析的方法, 并结合离线高 pH 反相高效液相色谱预分馏步骤。
脑脊液分泌是去除中枢神经系统细胞分子的主要途径。因此, 中枢神经系统中的许多过程都反映在脑脊液中, 使它成为一种有价值的诊断液。CSF 有一个复杂的组成, 包含的蛋白质的浓度范围为 8-9 的数量级。除了蛋白质, 以前的研究还表明存在大量的内源性多肽。虽然不像蛋白质那样广泛研究, 但它们也可能作为生物标志物而具有潜在的兴趣。
内源性肽通过分子过滤与脑脊液蛋白含量分离。通过去除样品中的大多数蛋白质含量, 可以增加研究的样品体积, 从而也能提高内源性多肽的总量。在 LC-质谱分析之前, 通过在碱性 pH 值上采用反相 (RP) HPLC 预分馏步骤, 解决了过滤肽混合物的复杂性。分馏与一个简单的串联方案结合在一起, 其中60个分数被汇集到 12, 分析时间消耗量可以从而减少, 当仍然主要避免 co 洗脱。
通过使用三种不同的肽/蛋白质识别软件程序, 并结合结果进行了自动肽鉴定。不同的方案是互补的, 而不是可比的, 少于15% 的标识重叠之间的三。
Introduction
脑脊液中的生物标志物目前正转化为神经退行性疾病的研究。在阿尔茨海默氏病, 最常见的神经退行性疾病, 影响超过6000万人的全球1,2, 一个生物标记三重组成的肽淀粉样β, 微管稳定蛋白 tau, 和磷酸化 tau 形态, 能检测出高灵敏度和特异性的疾病, 并已纳入诊断研究标准3。在其他神经退行性疾病, 如帕金森氏病和多发性硬化症, 蛋白质组研究发现了许多生物标记候选, 其中一些目前正在评估临床研究4,5 ,6。
除了蛋白质, CSF 还含有丰富的内源性多肽7,8,9,1011.这些肽构成了许多脑源性蛋白质的裂解产物, 同时也代表了一种潜在的重要的疾病生物标志物来源。为了增加人类脑脊液中已识别的内源性多肽的库存, 并在临床研究中进行 csf endopeptidomic 分析, 开发了用于样品制备和 LC-MS 分析的方法 (在图 1中包含了一个简短的协议方案).该方法在最近的一项研究中的应用, 导致了来自几个非特定诊断个体的汇集脑脊液样本中的近16400内源性脑脊液肽的鉴定, 扩大已知 csf endopeptidome 十倍13。该方法可选择与等压标签法结合使用, 以量化。
样品制备
脑脊液中蛋白质质量的主要来源是血浆成分 (如白蛋白和免疫球蛋白) 通过血脑屏障14,15。它们的高丰度阻碍了对低丰度脑源样件的检测。内源性肽可以很容易地与高丰度的蛋白质分离, 从而允许大量的脑脊液肽提取物用于 LC-MS 分析, 从而能够检测到低丰度的肽。
在这里提出的协议中, 分子量的分子过滤是用来分离脑脊液肽的蛋白质部分;已在以前的几项研究中使用的方法8、9、10、11、12、16。过滤步骤之后是一个离线反相高效液相色谱预分馏步骤, 在高 pH 移动相位梯度。通过串联两个反相 HPLC 步骤, 以 pH 值为主要区别, 两个步骤的选择性差异主要是由于不同的肽电荷状态而导致的多肽潴留。在酸性条件下, 高 pH 肽预分馏在 LC-MS 的应用在增加肽识别17,18, 甚至是在复杂生物的优势样品比较正交分离模式19, 如强 cat 离子交换 (SCX) 和 RP20。为了缩短分析时间, 使用了串联方案, 将每12个th分数 (例如、分数1、13、25、37和 49) 汇集在一起, 由于反相高效色谱法的高分辨力, 仍然很大程度上避免了不同的肽的共洗LC-MS 步骤20,21中的分数。
肽鉴定
peptidomic 研究中的肽鉴定与蛋白质组学研究不同, 因为在数据库搜索中不能指定酶解理, 因此, 识别率通常低于11。最近的一项研究13表明, Sequest 和吉祥物获得的内源性多肽的识别率在使用自适应评分法修改相应软件程序的默认评分算法时得到了显著改善算法过滤, 表明内源肽的最佳评分算法与胰肽13不同。在这项研究中, 基于自动肽从头测序使用软件峰值 (BSI) 被发现是互补的两个片段离子指纹为基础的搜索引擎, 导致了显着更大的一套识别肽.
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Protocol
下面所述的协议是在以前的研究中使用的一个精炼版本, 其中大量的内源性多肽在人类 CSF15中被识别出来。对原始协议的更新包括对脑脊液化学预处理的细微改动, 以及用于离线高 pH 反相高效 HPLC 预分馏的梯度优化。
道德考虑
所有关于瑞典病人和控制材料的研究都得到了伦理委员会的批准: St. 约兰·佩尔松 (文献 2005-554-31/3)。来自阿姆斯特丹痴呆症患者的脑脊液样本和在国立神经病学和神经外科医院采集的样本被用于研究, 得到所有参与的病人的书面同意, 并得到区域伦理委员会的批准。这里所用的材料主要是从为诊断目的而抽取的样品中提取的左脑脊液, 在被纳入我们的研究之前就已被识别。没有可能将样本追溯到任何个别捐助者或捐助国集团。
1. 人体脑脊液的提取:
- 使用标准的协议22, 通过腰椎穿刺提取脑脊液 (必须由训练有素的医生执行)。
- 通过离心 2500 x g 去除细胞碎片和其他非水溶性物质20分钟。
- 目测检查脑脊液样本中是否有可能显示穿刺出血导致的血液污染的变色。血液中蛋白质浓度的升高和蛋白酶的存在会对分析结果产生很大影响。
2. 脑脊液预处理 (1.5 毫升样本量, 无量化):
- 室温 (RT) 解冻1.5 毫升脑脊液等分, 将内容转移到10毫升聚丙烯管, 并将80µL 1 米乙碳酸氢盐 (TEAB) 作为缓冲剂。
- 添加0.65 毫升8米胍盐酸盐 (GdnHCl) (活性浓度 GdnHCl: 2.4 米) 和涡旋轻轻在 RT 为10分钟。
注: chaotropic 剂, GdnHCl, 都影响溶剂粘度和与多肽链的相互作用, 这导致蛋白质的展开是积极有利的23。因此, GdnHCl 在随后的过滤过程中溶解蛋白质聚合体并增加内源性肽的回收。 - 添加60µL 200 毫米水三 (2-乙) 膦盐酸盐 (TCEP) (活性浓度 TCEP: 6 毫米) 和孵育55° c 1 小时, 以减少半胱氨酸 disulphides。
- 添加35µL 400 毫米碘 (iaa) (活性浓度 iaa: 4 毫米) 和孵化在 RT 在黑暗中为30分钟到烷基化胱氨酸。在随后的样品制备过程中, 添加烷基基团可确保半胱氨酸残留物在任何时候都不能自发形成新的二硫化物桥。
- 在分子过滤之前, 加入3.25 毫升的 de 电离水和涡旋来稀释样品, 导致样品总量为5.5 毫升。这一步的作用是稀释 GdnHCl 到低于1米, 因为较高的浓度已被观察到有时会导致从过滤器设备的聚合物物质浸出。
3. 脑脊液的预治疗 (10 x 150 µL 样本量, 等压标签-定量):
- 将150µL 的脑脊液等分从10人的 RT 中解冻, 然后将内容转移到单个1.5 毫升低束缚微离心管, 并将8µL 1 M TEAB 作为缓冲剂。
- 添加65µL 8 米 GdnHCl (活性浓度 GdnHCl: 2.4 米) 和涡旋轻轻在 RT 为10分钟。
- 添加6µL 200 毫米的水 TCEP (活性浓度 TCEP: 6 毫米) 和孵化在55° c 为 1 h, 以减少半胱氨酸 disulphides。
- 添加3.5 µL 400 毫米水性 iaa (活性浓度 iaa: 6 mm), 在 RT 和黑暗中孵育30分钟至烷基化胱氨酸。
- 准备等压标签套件 (e. g, 串联质量标签10plex 等压标签试剂)。允许等压标记试剂瓶在打开前达到 RT, 以避免不必要的试剂水化, 加入41µL 的 HPLC 级乙腈 (AcN), 用温和的搅拌溶解5分钟。
- 将30µL 等压标签试剂溶液转移到相应的样品中, 并在温和搅拌下孵育1小时。等压标签试剂包括一个琥珀酰亚胺-酯基团, 它与在多肽 N 总站和赖氨酸残留物中存在的主要氨基酸反应。
- 加8µL 5% 羟胺 (活性浓度羟胺: 0.16%), 在 RT 处轻轻摇动20分钟, 以熄灭标签反应。由于分开地被标记的样品将被结合, 保证标签反应被淬火。通过添加大量的胺类以羟胺的形式, 其余的等压标签试剂可以作出反应, 从而使惰性。
- 结合每一个10单独标签的样品在一个单一的15毫升聚丙烯管的内容。
- 将6.4 毫升的 de 电离水添加到组合样品和涡流中, 以减少 AcN 浓度从12% 到 3%, 到 GdnHCl 浓度 GdnHCl 到1米以下, 这是由于较高浓度, 有时会导致聚合物物质的浸出。从过滤器设备。
4. 分子量切断过滤
- 为了去除潜在的污染物, 条件分子过滤器通过装载10毫升水 1 M GdnHCl, 25 毫米 TEAB 并且离心为 15 min 在 2500 x g 和 RT, 放弃流经 (FT)。
- 在过滤器上加载整个样本量 (5 毫升无标签的 csf (步骤 2.5) 或10毫升压标记的 csf (步骤 3.9)), 并在 30 x g 和 RT 上离心2500分钟, 在集合容器中留出流量 (FT)。过滤的结果是多肽和小蛋白质分离从更大的蛋白质和残余细胞残骸。这一步可以被看作是 peptidomic 等同于使用蛋白水解蛋白质来产生肽在蛋白质组实验。
- 负载5毫升的25毫米 TEAB (水) 的过滤器和离心机为15分钟, 2500 x g 和 RT, 以增加恢复肽。
- 从前两个步骤 (总共10毫升的非标签或15毫升压标签的样本) 的组合罚球, 并进行样品酸化。
5. 固相萃取--盐析和样品清理
- 酸化在固相萃取 (SPE) 之前从步骤4.4 中筛选出的样品。酸化是为了改善溶质 (肽) 相互作用与固定相的固相的 SPE 墨盒。
- 对于无标签的样品 (容量10毫升): 添加550µL 1% 乙酸酸 (TFA)-样品总体积: 10.55 毫升与 0.05% TFA。
- 为等压标记的样品 (容量15毫升): 增加20毫升 0.1% TFA 到酸化和更低的 AcN 集中从3% 到 1%-样品的总容量:30 毫升与 0.066% TFA。
注: TFA 还添加了它作为离子配对试剂的功能, 它可以提高多肽的保留能力, 而不能够与 SPE 墨盒的包装材料保持足够强的疏水作用。 - 如果 ph > 3, 滴定样品与20% 磷酸, 直到样品 ph 值是 < 3。
- 通过添加1毫升的 84% AcN, 0.1% 甲酸 (FA), 并放弃 FT. 重复一次。在随后的步骤中, 需要对滤筒过滤器进行调理, 以去除不需要的物质, 否则洗与肽一起;进一步, 调节增加过滤器的渗透性。
- 平衡的 SPE 墨盒加1毫升的 0.1% TFA, 丢弃 FT. 重复一次。确保过滤器在最后一个平衡步骤后不会运行干燥-在过滤器的顶部保持一个小体积。为了使过滤器能够通过去除从调理步骤中留下的疏水物质 (乙腈) 来准备滤池以保持多肽的平衡。
- 加载整个样本量 (10.55 毫升为非标签样本或30毫升压标签的样品), 在几个部分, 如果必要的, 让 FT 运行成废物。确保墨盒在取样加载轮或最后一个取样卷加载后不会运行干燥, 请在过滤器顶部保留一小卷。
- 通过1毫升的 0.1% TFA 的过滤器, 以消除盐和试剂和丢弃的 FT. 重复一次。确保墨盒在每次洗涤步骤后不会运行干燥-在墨盒顶部保持少量液体。
- 放置1.5 毫升低束缚微离心管下的墨盒和洗的样品通过1毫升 84% AcN, 0.1% FA 超过墨盒。
- 在真空离心机中, 在干燥、贮存于-80 ° c 或立即进行高 pH 分馏时, 将溶剂从脱盐试样中蒸发。
6. 离线高 pH 反相 HPLC 样品分离
-
制备水基高 pH (HpH) 流动相:
HpH 缓冲器 A: 纯净水
HpH 缓冲器 B: 84% AcN
HpH 缓冲器 C:25 mM NH4哦
HpH 加载缓冲区: 2.5 mM NH4哦, 2% AcN
注意: HpH 加载缓冲区用作传输解决方案和示例缓冲区 - 16µL HpH 加载缓冲液中的样品再溶解20分钟
- 负载15µL 的样品的 HPLC 系统与内部分数收集器的 96-深井板配置根据 Batth et al.20 , 但有少量更改。分级在100µL/分钟的流量超过 pH 稳定的分离柱 (C18 3.5 µm, 2.1 毫米 x 250 毫米) 和收集一小部分每分钟在线性 60 min 梯度。
- 使用以下渐变时间点: t = 0 分钟, B = 1%, C = 10%;t = 4 分钟, B = 1%, C = 10%, 开始分数集合;t = 76 分钟, B = 70%, C = 10%;结束分数收集;t = 76.5 分钟, B = 85%, C = 10%;t = 80 分钟, B = 85%, C = 10%;t = 80.5 分钟, b = 1%, c = 10% 和 t = 90 min, b = 1%, c = 10%。
- 在12口井中重复地收集分数, 从而在一个圆的模式中, 使分数间隔12分钟, 产生12分, 每个分数包含6串联的子分数。
- 在 RT 和 3000 rpm 之前, 用真空离心法除去样品中的溶剂, 直到干燥为止, 并在-80 ° c 之前将样品储存在 LC-质谱分析之前。
7. LC-质谱
-
准备水的流动阶段:
缓冲器 A: 0.1% FA
缓冲器 B: 0.1% FA, 84% AcN
装货缓冲: 0.05% TFA, 2% AcN
注: 装载缓冲器用作装载泵的传输方案、采样缓冲器和移动相位。 - 通过增加6µL 加载缓冲器并在 RT 处晃动20分钟来重新溶解每个12馏分
- 负载5µL 样品的纳米流高效液相色谱, 操作在陷井专栏配置 (陷井专栏:75 µm x 2 cm, C18, 100 Å孔大小, 3 µm 微粒大小; 分离专栏: C18, 75 µm x 500 毫米, 100 Å孔大小, 2 µm 微粒大小, 以 150 nL/分钟的流速进行多肽分离, 使用以下梯度: t = 0 min, B = 2%;t = 10 分钟, B = 2%;t = 11 分钟, B = 7%;t = 100 分钟, B = 26%;t = 170 分钟, B = 45%;t = 175 分钟, B = 80%;t = 181 分钟, b = 2%, t = 210 分钟, b = 2%。
-
在高分辨率混合质谱仪上, 通过纳米电喷雾界面进行高效液相色谱联用。在m/z范围 350-1400 的分辨率设置下, 以 MS 模式记录全扫描频谱 (2.0e5 AGC 目标) 12万。
- 在数据相关的采集模式下操作质谱仪, 从前十最强峰值的m/z > 150, 并在1.0e4-1 的强度范围内选择 ms/毫秒谱. 0e5 用于片段离子分析。使用 1 m/z的四极隔离窗口隔离前体离子, 最大注射时间为100毫秒, RF 镜头在60%。
- 将动态排除应用于十五年代的排除时间和± ppm 的m/z公差。在高碰撞能量分解 (HCD) 单元中执行碎片, 并在 orbitrap 的分辨率设置为 5万 (5.0e4 AGC 目标值) 记录 ms/ms 收购。
8. 多肽识别
-
为肽鉴定提交结果. 原始文件从质谱分析到蛋白质组学搜索引擎应用以下设置:
注: 在我们以前的研究中15, 三搜索引擎;吉祥物 v2.4, Sequest HT, 和峰值 v7.5 是并行使用, 这里指定的设置是为所有三搜索引擎, 除非另有规定。大多数可调节的设置是普遍的多肽/蛋白质识别和应该有相应的设置在任何给定的搜索引擎。
频谱选择器:
最小前体质量: 350 Da
最大.前体质量: 5000 Da
扫描类型: 完全
信号/噪声阈值: 1。5
序列数据库搜索
数据库: UniProt_SwissProt [version2015_11]
分类学: 智人
酶: 无
最大.错过分裂: 0
仪器 (仅吉祥物): ESI 陷阱
最小肽长度 (仅 SequestHT): 6
最大.多肽长度 (仅 SequestHT): 144
前体质量公差:15 ppm
碎片质量公差: 0.05 Da
静态修改: Carbamidomethyl (C);[如果标签]TMT10plex (N 期)
动态修改: 氧化 (M);[如果标签]TMT10plex (K)
多肽谱匹配 (PSM) 验证器
过滤 (仅限吉祥物和 Sequest) 或诱饵融合 (仅限峰值)
目标罗斯福: 0.01
基于: q 值的验证
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Representative Results
本文介绍的方法已在三项研究中应用和评价前的样品前分馏 (表 1)。第一项研究使用离线 LC 在 MALDI 靶板上发现脑脊液分数, 并导致730已确定内源性肽11。在以下两项研究中, 使用了等压标签。主要在病例/对照研究中, 对 CSF endopeptidome 和蛋白质组中的潜在生物标志物进行鉴定和描述, 同时24, 并在第二项研究中使用等压标记用于监测治疗效果体内γ-分泌抑制剂对脑脊液中多肽表达的影响超过 36 h16。在病例/对照研究中发现了437种内源性多肽, 其中64项在个体与 AD 和健康对照的浓度上有明显的改变。第三, 治疗研究, 确定1798内源性肽, 11 的被监测的多肽可以显示对治疗的反应。
在第四研究中, 目的是增加确定的脑脊液肽的数量, 特别是发现低丰肽。因此, 采用 HpH-反相色谱法进行多肽预分馏, 并使用10倍大的脑脊液样本量, 从而鉴定出16395多肽。在这项研究中, 不进行等压标签。除了样品分离, 最近的研究采用了联合的肽鉴定方法, 而在前三研究中只进行了单一的数据库搜索, 这在一定程度上解释了大量的肽确定.从最近的研究中, 比较单个搜索引擎 (吉祥物、Sequest 或峰值) 得出的结果表明, 所使用的算法在一定程度上是互补的, 因为相对较小的数量, 少于 15% (2440), 肽是由所有三搜索引擎 (图 2) 标识。此外, de 从头排序搜索引擎峰值是识别内源多肽的最有效方法, 但如果只使用峰值 (图 2), 则不会确定超过5400多肽。在同一材料上的几个搜索引擎的应用有潜在的多个测试问题, 这是通过验证正确性测试13。获得的原始 ms/ms 数据, 以及从最近的试验中获得的蛋白质组搜索的所有结果, 已通过 ProteomeXchange 与标识符 PXD004863 在骄傲数据存储库中提供。
图 1: 一种协议方案, 可视化方法的主要步骤.腰椎穿刺法提取脑脊液离心法去除非可溶性物质, 2) 添加 GdnHCl, 以分离多肽-蛋白质聚合体, 增加内源肽的回收;半胱氨酸 disulphides 的还原和烷基化;等压标签为肽定量 (可选) 3) 分子量过滤分离的内源肽从蛋白质, 4) 固相萃取去除盐和其他极性污染物, 5) 反相色谱法预分馏, 碱性移动相梯度和串联的每 12th分数, 6) 反相色谱-ms/ms, 酸性流动相梯度, 每个串联分数连续运行, 7) 肽的识别执行通过提交 ms/ms 数据从所有12分析运行作为单样本的搜索引擎, 随后的肽 id 进行了比较, 并对所有独特的肽 id 进行了总结。请单击此处查看此图的较大版本.
| 学习总结 | TMT 标签 (y/n) | HpH-RP 分馏 (y-/n) | 每个 MS 分析的脑脊液容量 (µl) | 已识别的肽数 | 评论 | 参考 |
| 探索性脑脊液 peptidome 分析 | n | n | 500 | 730 | 离线 LC MALDI 目标准备, MALDI-MS;分子滤波器的评价 | 4 |
| 脑脊液肽的定量比较示例来自 8 AD + 8 Ctrl | y | n | 200 | 437 | 高效液相色谱-电喷雾 MS组合 peptidomic 和蛋白质组协议 | 25 |
| AD 伽玛分泌抑制剂治疗研究 | y | n | 300 | 1798 | 高效液相色谱-电喷雾 MS治疗后六时间点脑脊液提取 | 17 |
| 扩大脑脊液 peptidome | n | y | 750-1000 | 18.031 | 高效液相色谱-电喷雾 MS多肽识别软件的组合 | 15 |
表 1: 本组最近进行的一项研究, 应用分子量筛选和质谱分析方法对人脑脊液中内源性多肽进行鉴定。
图 2: 一个维恩图, 比较了三搜索引擎吉祥物、Sequest HT 和峰值所获得的肽识别结果.共发现16395种内源性多肽。de 从头-测序搜索引擎峰值确定了10967内源性多肽;基于片段离子指纹识别的搜索引擎吉祥物和 Sequest HT 分别确定了8118和7304内源性肽。所有三搜索引擎之间的认同共识共计2440内源性多肽, 或14.8%。在吉祥物和 Sequest 之间有一个相对较大的识别重叠, 对应于70% 的组合肽标识。峰有一个比较小的识别重叠与吉祥物和 Sequest HT;分别为20.5% 和18.9%。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
采用高效液相色谱法预分馏步骤, 采用分子量超滤法回收内源性多肽11降低了相对样本复杂度, 从而使5倍大要研究的样本量。这反过来增加了每个分数中所含的肽子集的浓度, 从而提高了检测低丰肽的几率。
通过对三种蛋白质组软件并行使用的内源肽进行识别, 可以扩大已知的脑脊液 endopeptidome 超过10倍。共16395内源性多肽在一个合并脑脊液标本的初步试验中被发现。在这些鉴定中, 有大量的内源性多肽来源于先前在神经退行性疾病的背景中所指出的蛋白质。在上述研究中发现的几种肽目前正在实验室中被评价为生物标志物。这一过程涉及几个步骤, 包括通过对含有重同位素的合成类似物进行脑脊液扣球来验证多肽的身份, 建立有针对性的质谱测定法, 评估储存期间的肽的稳定性和冻融循环, 分析不同临床人群。
为了避免引入污染物 (步骤2.5 和 3.5), 由于样品在分子过滤过程中的高浓度 GdnHCl 的结果, 对原议定书作了修改。对预分馏梯度 (步 6.3.1) 进行了更新, 容量延长, 线性梯度的使用。
本文所描述的协议中分析物损失的主要原因可以归结为两个反相色谱步骤, 以及分子过滤和 SPE 样品清理步骤。
在过滤过程中, 由于与分子过滤器的相互作用而导致的多肽损失, 或它所保留的蛋白质, 是难以避免的, 可能是样本间变异的来源。
在反相色谱步骤中可能会出现进一步的选择性损失。由于多肽疏水性是 ph 依赖性的, 在高和低 ph 值上分别执行两个连续的反相色谱步骤, 可能导致在 ph 值≥9上太亲水性的多肽的损失被保留在专栏和相似地第二子集太亲水性在 pH 3 将保留。
与以前使用的方法相比, 预分馏的就业导致了内源性多肽的鉴定增加了10倍。它可以成功地检测出大量以前未识别的多肽, 因此是研究和探索脑脊液 peptidome, 以及其他可能的复杂生物样品的一个宝贵工具。
结合多路等压标签该协议的目的是进一步应用, 以确定生物标记候选的各种神经退行性疾病的脑脊液, 血液和脑组织。
样品制备步骤中的不同恢复有助于分析脑脊液蛋白和多肽的解析变化. 在样品制备的早期阶段对多肽执行等压标签的影响降低了这种变化很大。与以前报告的样品制备协议相比, 高 pH 反相肽预分馏的实现增加了被鉴定的多肽的数量, 因子5。采用不同的搜索算法, 结合不同的多肽识别软件程序, 显著改善了 ms/ms 内源性肽的识别。
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Disclosures
在作者之间没有任何竞争的利益, 财务或其他, 报告。
Acknowledgments
非常感谢 Tanveer Batth 和同事在建立预分馏法方面的建议。
这项工作得到了瑞典研究理事会、Wallström 和 Sjöblom 基金会、枪支和 Bertil Stohne 基金会 Stiftelse、马格努斯 Bergwall 基金会、Åhlén 基金会、Alzheimerfonden、Demensförbundet、Stiftelsen för 的资助。格姆拉斯坦 Tjänarinnor, 克努特和爱丽丝的基础, Frimurarestiftelsen, 和 Västra Götalandsregionen。
这个项目的主要资助对象是 Kaj Blennow, 亨利 Zetterberg 和约翰 Gobom。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
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