Summary
नियमित रूप से प्रतिस्थानीय लघु palindromic दोहराता (CRISPR) और CRISPR-जुड़े प्रोटीन-9 nuclease (CRISPR/Cas9) प्रणाली आनुवंशिक रूप से इंजीनियर गोल्डन सीरियाई हंसटर के उत्पादन के लिए एक अत्यधिक कुशल विधि है की परमाणु (PN) इंजेक्शन । इस के साथ साथ, हम CRISPR/Cas9 प्रणाली के साथ जीन नॉकआउट हंसटर के उत्पादन के लिए विस्तृत PN इंजेक्शन प्रोटोकॉल का वर्णन ।
Abstract
परमाणु (PN) इंजेक्शन तकनीक पहले चूहों में एक सेल स्टेज भ्रूण के pronuclei में विदेशी आनुवंशिक सामग्री को लागू करने के लिए स्थापित किया गया था । शुरू की आनुवंशिक सामग्री भ्रूण जीनोम में एकीकृत कर सकते है और पालक माताओं को इंजेक्शन भ्रूण के हस्तांतरण के बाद विदेशी आनुवंशिक जानकारी के साथ ट्रांसजेनिक पशुओं उत्पंन करते हैं । चूहों में सफलता के बाद, PN इंजेक्शन कई अन्य जानवरों की प्रजातियों में सफलतापूर्वक लागू किया गया है. हाल ही में, PN इंजेक्शन सफलतापूर्वक जीन-संशोधित गतिविधियों, जैसे CRISPR/Cas9 प्रणाली, कई प्रयोगशाला और कृषि पशु प्रजातियों में साइट विशेष आनुवंशिक संशोधनों को प्राप्त करने के लिए के साथ रिएजेंट शुरू करने के लिए नियोजित किया गया है । PN इंजेक्शन द्वारा आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं का उत्पादन करने के लिए microinjection कौशल के विशेष सेट माहिर के अलावा, शोधकर्ताओं प्रजनन शरीर विज्ञान और लक्ष्य प्रजातियों के व्यवहार को समझना चाहिए, क्योंकि प्रत्येक प्रजातियों अद्वितीय प्रस्तुत करता है चुनौतियों. उदाहरण के लिए, गोल्डन सीरियाई हंसटर भ्रूण इन विट्रो में अद्वितीय हैंडलिंग आवश्यकताओं है कि PN इंजेक्शन तकनीक संभव हमारे समूह द्वारा हाल ही में सफलताओं तक इस प्रजाति में नहीं थे । हमारी प्रजातियों-संशोधित PN इंजेक्शन प्रोटोकॉल के साथ, हम कई जीन नॉकआउट (KO) और knockin (KI) हंसटर, जो मॉडल मानव रोगों के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है उत्पादन में सफल रहा है । यहां हम हंसटर के zygotes के लिए CRISPR/Cas9 परिसर पहुंचाने के लिए PN इंजेक्शन प्रक्रिया का वर्णन, भ्रूण हैंडलिंग शर्तों, भ्रूण हस्तांतरण प्रक्रियाओं, और आनुवंशिक रूप से संशोधित हंसटर उत्पादन के लिए आवश्यक पशुपालन ।
Introduction
गोल्डन सीरियन हंसटर (Mesocricetus auratus) जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया कुतर में से एक है । अमेरिका के कृषि विभाग के अनुसार, लगभग १००,००० हंसटर २०१५ में संयुक्त राज्य अमेरिका में इस्तेमाल किया गया, पशु कल्याण अधिनियम (http://www.aphis.usda.gov; तक पहुंचने में शामिल प्रजातियों के बीच कुल प्रयोगशाला पशु उपयोग के 13% का प्रतिनिधित्व मार्च 10, २०१७).
हंसटर मानव रोगों की एक संख्या के अध्ययन में अंय कुतर पर कई लाभ प्रदान करता है । उदाहरण के लिए, एन के histopathology-nitrosobis (2-oxopropyl) अमीन (बीओपी) हंसटर में अग्नाशय डक्टर adenocarcinomas प्रेरित मानव अग्नाशय के ट्यूमर के समान है, जबकि बीओपी उपचार मुख्य रूप से चूहों और फेफड़ों और जिगर में ट्यूमर में थायराइड ग्रंथि ट्यूमर लाती है चूहे1. क्योंकि हंसटर केवल छोटे एडिनोवायरस की प्रतिकृति का समर्थन पाया कुतर रहे हैं, वे भी एडीनोवायरस-आधारित oncolytic वैक्टर और विरोधी एडीनोवायरस दवाओं के परीक्षण के लिए पसंद के मॉडल है2,3,4। एक और उदाहरण जिसमें हंसटर मॉडल चूहों और चूहों पर एक लाभ प्रदान करता है hyperlipidemia के अध्ययन में है । मनुष्य और हंसटर लिपिड चयापचय रास्ते में महान समानताएं प्रदर्शन और दोनों प्रजातियों में जीन एंकोडिंग cholesteryl एस्टर स्थानांतरण प्रोटीन (CETP) है, जो लिपिड चयापचय में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है, जबकि CETP चूहों और चूहों में5में अनुपस्थित है ले । इसके अतिरिक्त, हंसटर रक्तस्रावी रोग Ebola वायरस के लिए जोखिम के बाद मानव अभिव्यक्ति के अधिक प्रतिनिधि का विकास6। हंसटर भी atherosclerosis7, मौखिक कार्सिनोमा8, और भड़काऊ myopathies9अध्ययन के लिए पसंद के मॉडल हैं । हाल ही में, यह भी दिखा दिया गया है कि हंसटर अत्यधिक Andes वायरस के संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील और हंटावायरस फुफ्फुसीय सिंड्रोम-रोग की तरह विकसित कर रहे हैं, Andes वायरस संक्रमण के केवल कुतर मॉडल प्रदान10।
के लिए unmet की जरूरत है उपंयास आनुवंशिक पशु मॉडल के लिए मानव रोगों का अध्ययन जहां कोई विश्वसनीय छोटे कुतर मॉडल उपलब्ध है पता करने के लिए, हम हाल ही में CRISPR/Cas9 प्रणाली को हंसटर के लिए लागू करने में सफल रहा है और आनुवंशिक रूप से कई लाइनों का उत्पादन किया है इंजीनियर हंसटर11। हंसटर zygotes अत्यधिक पर्यावरण milieus के प्रति संवेदनशील है ऐसी है कि PN इंजेक्शन अंय प्रजातियों में विकसित प्रोटोकॉल अनुपयुक्त हैं । इसलिए, हम हंसटर कि इन विट्रो मेंहंसटर भ्रूण हैंडलिंग के लिए विशेष आवश्यकताओं को समायोजित के लिए एक PN इंजेक्शन प्रोटोकॉल विकसित की है । यहां, हम विस्तृत PN इंजेक्शन CRISPR/Cas9 प्रणाली और साथ कदम, एकल गाइड आरएनए (प्राप्तकर्ता महिलाओं में इंजेक्शन भ्रूण के हस्तांतरण के लिए sgRNA) की तैयारी से का उपयोग कर प्रक्रिया का वर्णन ।
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Protocol
इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाओं यूटा राज्य विश्वविद्यालय (IACUC प्रोटोकॉल: २४८४) के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया । इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया हंसटर वयस्क है (6-10 उंर के सप्ताह) LVG तनाव गोल्डन सीरियाई हंसटर । सभी हंसटर के vivarium में स्थित है, के लिए है, यूटा राज्य विश्वविद्यालय के नवाचार केंद्र । कमरे का तापमान 23 डिग्री सेल्सियस पर सेट किया गया है, आर्द्रता ४०-५०% पर सेट है, और प्रकाश चक्र 14L सेट है: 10D (प्रकाश: डार्क) । जब भी संभव हो, भ्रूण हेरफेर और surugical प्रक्रियाओं बाँझ तकनीक के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
1. sgRNA and Cas9/sgRNA Ribonucleoproteins (RNP) वडा
- संश्लेषित sgRNAs निंनलिखित में इन विट्रो प्रतिलेखन प्रक्रियाओं संश्लेषण किट के मैनुअल में वर्णित (सामग्री तालिका, 1 अनुपूरक) ।
- ribonucleoproteins इकट्ठा करने के लिए, sgRNA के 1 µ जी के साथ Cas9 के 2 µ जी मिश्रण और 10-15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण गर्मी । PN इंजेक्शन के लिए, १०० एनजी/µ l Cas9 और ५० एनजी/µ l sgRNA 10 mM ते बफर (RNase मुक्त, सामग्री तालिका) के साथ एकाग्रता पर एक काम समाधान बनाओ ।
२. नसबंदी तयारी
नोट: नसबंदी पुरुष हंसटर पर उंर के 6-8 सप्ताह में किया जाता है । सर्जरी के पहले संभोग के 10-14 दिन आगे प्रदर्शन किया जाना चाहिए । उपजाऊ महिलाओं के साथ सहवास से असफल गर्भधारण से बांझपन की पुष्टि होती है. Vasectomized नर आम तौर पर एक साल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है इससे पहले कि वे कम यौन सक्रिय हो ।
- Anesthetize नर द्वारा intraperitoneal (आईएफसआई) ketamine/xylazine की एक खुराक के साथ ४० मिलीग्राम/kg (ketamine) और 10 मिलीग्राम/kg (xylazine) । एक पेडल पलटा (पैर की अंगुली चुटकी) की कमी से संज्ञाहरण की पुष्टि करें ।
- एक सूखी ऊतक कागज पर पृष्ठीय recumbency में बेहोश हंसटर रखना । ७०% शराब और povidone-आयोडीन के बीच शल्य सफ़ाई समाधान बारी द्वारा एंटीसेप्टिक उपचार के तीन दौर के साथ पेट कुल्ला ।
- शल्य चिकित्सा कैंची के साथ एक ऊर्ध्वाधर चीरा करने के लिए १.५ सेमी कपाल शुरू चमड़ी को 1 सेमी का विस्तार करने के लिए मध्य रेखा (चित्र 1a) से प्रत्येक पक्ष के लिए. काटकर त्वचा, चमड़े के नीचे ऊतक, और लीनिया अल्बा पेरिटोनियल अंतरिक्ष (आंकड़ा 1b) का उपयोग करने के लिए ।
- अंडकोश की थैली के caudal पहलू के लिए कोमल दबाव लागू करने के लिए परीक्षण और वसा ऊतक बाहर बल । वॉज deferens धीरे संदंश के साथ समझ और ध्यान से वॉज से रक्त वाहिका संदंश (चित्रा 1c) के एक दूसरे सेट के साथ अलग ।
- एक पाश बनाने के लिए संदंश के साथ वॉज deferens पकड़ो । लौ में एक और संदंश की नोक गर्मी जब तक यह लाल है, और फिर यह वॉज deferens के पाश को दूर करने के लिए उपयोग करें । वसा ऊतक डालें और पेट के लिए वापस tests. वॉज deferens को इसी प्रक्रिया के साथ विरोध पक्ष पर निकालें ।
- सीवन पेशियां पहले त्वचा suturing द्वारा पीछा किया । पशु ठीक होने तक 30 मिनट के लिए एक पिंजरे में एक गर्म पैड पर पशु प्लेस । पशु निरीक्षण जब तक यह सामांय गतिविधि फिर से शुरू ।
3. दाता/
- मॉनीटर और रिकॉर्ड मद चक्र ।
नोट: महिला हंसटर एक स्थिर 4 दिन मद चक्र है कि तुरंत प्रसव के बाद बनाए रखा है । मद के पहले दिन महिलाओं को अपारदर्शी, पीले और चिपचिपा योनि स्राव (चित्रा 2a) द्वारा पहचाना जा सकता है । मद के 4 दिन पर महिलाओं को पारदर्शी, चिपचिपा बलगम (चित्रा 2 बी) द्वारा पहचाना जा सकता है । - दाता हंसटर के superovulation के लिए, यौन परिपक्व महिलाओं superovulate (> 6 सप्ताह) गर्भवती घोड़ी सीरम गोनॉडोट्रॉफिन के आईपी इंजेक्शन द्वारा मद चक्र के पहले दिन (PMSG; ५० IU/एमएल के रूप में पंजाब में भंग) (तालिका 1) के बीच 9-12 AM ।
नोट: PMSG superovulation उत्प्रेरण के लिए नहीं बल्कि मद चक्र तुल्यकालन के लिए है । - ८०-८४ एच PMSG (दिन 4, 6-8 बजे) के इंजेक्शन के बाद, संभोग के लिए पुरुषों के साथ पिंजरों में महिलाओं की जगह है । के रूप में हंसटर संभोग शयन प्लग में परिणाम नहीं है, संभोग देख कर सफल संभोग सुनिश्चित करते हैं ।
- vasectomized पुरुषों के साथ मद के दिन 4 पर यौन परिपक्व महिलाओं संभोग द्वारा pseudopregnant महिलाओं को तैयार करें । दाता और प्राप्तकर्ता महिलाओं को तैयार करने के लिए समय अनुसूची तालिका 2में दिखाई गई हैं ।
नोट: यह सच है गर्भवती महिलाओं को भी प्राप्तकर्ताओं के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, यानी, एक कोट एक ही रंग उपजाऊ पुरुषों के साथ उलझा हुआ सुनहरा रंग से अलग रंग के साथ महिलाओं । पिल्ले भ्रूण हस्तांतरण से व्युत्पंन कोट रंग के आधार पर पहचाना जा सकता है । सच गर्भवती महिलाओं का उपयोग करने में एक संभावित लाभ यह है कि endogenously उत्पादित भ्रूण सफल गर्भधारण सुनिश्चित करने और मदद PN प्रत्यारोपण भ्रूण इंजेक्शन; प्राप्तकर्ताओं के रूप में सच गर्भवती महिलाओं का उपयोग करने में एक संभावित खामी यह है कि PN इंजेक्शन भ्रूण endogenously आरोपण के लिए भ्रूण का उत्पादन के साथ प्रतिस्पर्धा करने की आवश्यकता है ।
4. युग्मनज अलगाव
- संस्कृति माध्यम तैयार (HECM-9; नुस्खा अनुपूरक 2 में वर्णित है), के रूप में McKiernan और Bavister12में पहले वर्णित है ।
- एक दिन पहले PN इंजेक्शन के लिए तैयार युग्मनज हैंडलिंग व्यंजन (25 µ एल/ड्रॉप) और एक PN इंजेक्शन ड्रॉप (१०० µ एल) के ढक्कन में एक ३५ mm डिश के साथ HECM-9 । फिर खनिज तेल के साथ मध्यम बूंदें कवर । एक मशीन में निंनलिखित शर्तों के तहत रातोंरात संतुलन मध्यम: ३७.५ ° c, 10% सह2, 5% हे2, ८५% N2 और १००% आर्द्रता ।
- दिन PN इंजेक्शन के लिए निर्धारित पर, HECM-9 के साथ भ्रूण फ्लशिंग व्यंजन (1 डिश/दाता हंसटर) तैयार है और उपयोग तक मशीन में सभी बर्तन की दुकान ।
- Euthanize2के साथ superovulated हंसटर ।
- ओवीडक्ट अलगाव
- एक शल्य कपड़ा या टिशू पेपर पर पृष्ठीय recumbency में एक euthanized महिला हंसटर प्लेस और एक ७०% इथेनॉल स्प्रे के साथ पेट तैयार करते हैं ।
- दृढ़ता से midline में त्वचा और पेट की मांसपेशी परत पकड़ और एक चीरा बनाते हैं । उदर अंगों को बेनकाब करने के लिए काटकर ।
- एक ठीक संदंश के साथ गर्भाशय के सींग की समझ और पेट से ऊतक वापस लेना । mesometrium और वसा ऊतक से गर्भाशय को अलग करें । ओवीडक्ट और अंडाशय और ओवीडक्ट और गर्भाशय के जंक्शन के निकटवर्ती एक दूसरे कट के बीच एक कट बनाओ (गर्भाशय का एक छोटा सा हिस्सा शामिल हैं) । दोनों oviducts को एक ही फ्लश डिश में लगाएं ।
- फ्लश और zygotes इकट्ठा
- विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, एक #5 Dumont संदंश के साथ गर्भाशय सींग की ओर समझ और infundibular अंत से ओवीडक्ट के लुमेन में एक घर का बना सुई (चित्रा 3) डालें और ओवीडक्ट के साथ µ-9 मध्यम ३००-४०० HECM एल फ्लश ।
- zygotes को तुरंत इकट्ठा करें और उन्हें दो बार HECM-9 मीडियम से हैंडलिंग डिश में धो लें । विकास के इस स्तर पर zygotes के सभी मेघपुंज कोशिकाओं से निर्वस्त्र होना चाहिए.
- एक मशीन में zygotes प्लेस (३७.५ ° c, 10% सह2, 5% हे2, ८५% N2 और १००% आर्द्रता) तुरंत संग्रह के बाद प्रकाश के लिए जोखिम को कम करने के लिए ।
5. PN इंजेक्शन
- गल Cas9/sgRNA RNP बर्फ पर और पूरे PN इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर परिसर बनाए रखने ।
- Cas9/sgRNA RNP घोल के साथ इंजेक्शन सुई इंजेक्शन प्रयोगों से पहले तुरंत लोड । Cas9/sgRNA RNP समाधान युक्त ट्यूब में इंजेक्शन सुई के रियर अंत प्लेस और Cas9/sgRNA RNP केशिका कार्रवाई द्वारा सुई को भरने के लिए समाधान की अनुमति दें ।
- इंजेक्शन पकवान और सुई तैयार करते हैं । धारक सुई के मोड़ के भीतर ~ 3 मिमी करने के लिए खनिज तेल के साथ होल्डर पिपेट भरें । होल्डर को microinjector में सुई की नोक से क्षैतिज पकवान के नीचे की ओर रखें और सक्शन के माध्यम से सुई की नोक को भरें । एक 10-15 ° कोण धारक के विपरीत पर इंजेक्शन सुई सेट करें ।
- PN इंजेक्शन
- एक युग्मनज की पहचान और धारक सुई के साथ एक ठीक चूषण लागू होते हैं । आदर्श रूप में, पुरुष और महिला pronuclei एक ही फोकल रेंज के भीतर और धारक के समानांतर गठबंधन कर रहे हैं ।
- इंजेक्शन सुई के साथ zona और पुरुष pronuclei (3 बजे की स्थिति) घुसना ।
- जल्दी से इंजेक्शन सुई वापस लेने के लिए एक बार नाभिक को सुई का पालन करने से रोकने के लिए और नाभिक को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए फूल जाता है ।
6. Zygotes Pseudopregnant हंसटर के लिए स्थानांतरण
- Anesthetize एक pseudopregnant हंसटर (उसी तरह के रूप में नसबंदी अनुभाग के ऊपर में वर्णित) और यह एक शल्य कपड़ा या ventral recumbency में सूखी ऊतक कागज पर रखना ।
- आंख सूखापन को रोकने के लिए पशु की आंखों में नेत्र स्नेहक लागू करें और प्रकाश से आंखों की रक्षा के लिए एक कपड़े या कागज के साथ सिर को कवर । povidone-आयोडीन सफ़ाई और 3 बार ७०% इथेनॉल सफ़ाई के 3 बार लागू करने के बाद शरीर के प्रत्येक पक्ष पर एक के बारे में 4 सेमी x 4 सेमी त्वचा क्षेत्र शेविंग करके शरीर के पार्श्व पहलू तैयार करें । एक 2 सेमी ऊर्ध्वाधर चीरा 2 सेमी caudal पिछले रिब करने के लिए (जैसा कि आंकड़े 4a, 4b) जानवर के पीछे के प्रत्येक पक्ष पर में दिखाया गया है ।
- संदंश के साथ वसा पैड समझ और ओवीडक्ट और गर्भाशय दिखाई दे रहे हैं जब तक धीरे से खींच । एक hemostats के साथ वसा पैड दबाना और रीढ़ की हड्डी (चित्र 4c) पर पृष्ठीय वसा पैड को प्रतिबिंबित । प्रजनन पथ स्थिति ऐसी है कि गर्भाशय ट्यूब भ्रूण हस्तांतरण (चित्रा 4d) के लिए एक 30 गेज सुई के साथ प्रवेश किया जा सकता है ।
- एक नए पकवान में HECM-9 के साथ इंजेक्शन zygotes धो लें । 10-15 zygotes लोड करने के लिए एक नया ग्लास पिपेट (व्यास: ~ १५०-२०० µm) का प्रयोग करें । कई हवाई बुलबुले के बाद मोती की एक श्रृंखला के रूप में zygotes की व्यवस्था । ६.३ कदम से खुला प्रवेश ट्यूब में पिपेट डालें और धीरे ओवीडक्ट के लिए zygotes हस्तांतरण करने के लिए पिपेट में उड़ा । पहले हवा बुलबुला ओवीडक्ट पथ (चित्रा 4e) में जारी किया गया है जब तक उड़ाने जारी.
- वसा पैड रिलीज और पेट के लिए ऊतक वापस । एक ही प्रक्रिया द्वारा एक और ओवीडक्ट पथ के लिए इंजेक्शन भ्रूण के लगभग एक ही नंबर (10-15) स्थानांतरण ।
- पेशियां और 2 परतों में त्वचा सीवन । प्रशासन Buprenorphine-एचसीएल (०.५ मिलीग्राम/) के रूप में पोस्ट-सेशन analgesia । एक पिंजरे में हंसटर लौटें और वसूली के लिए एक गर्म पैड पर पिंजरे जगह है । पशु पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद किया गया है जब पशु कमरे में पिंजरे लौटें । बाद में छह घंटे बाद सेशनल एनाल्जेसिक कर दिया जाता है ।
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Representative Results
आनुवंशिक रूप से संशोधित हंसटर उत्पादन में वर्णित प्रोटोकॉल की दक्षता निंनलिखित दो महत्वपूर्ण चरणों के परिणामों पर निर्भर करता है: प्राप्तकर्ता महिलाओं की जीवित जंम दर और इरादा आनुवंशिक संशोधनों के साथ लाइव पिल्ले की संख्या । जीवित जन्म दर भ्रूण की गुणवत्ता और PN इंजेक्शन और भ्रूण हस्तांतरण प्रक्रियाओं के व्यक्तिगत प्रदर्शन के कौशल का एक सीधा परिणाम है । यह सुनिश्चित करने के लिए कि हेरफेर भ्रूण के विकास की क्षमता समझौता नहीं है, महान देखभाल के दौरान आवश्यक है इन विट्रो हंसटर भ्रूण की हैंडलिंग । हम नियमित रूप से pseudopregnant प्राप्तकर्ता महिलाओं के साथ ६०-८०% की एक जीवित जंम दर को प्राप्त करने । तालिका 3 RAG1 नॉकआउट प्रयोग से जीना जंम दर दिखाता है (pseudopregnant महिलाओं इस्तेमाल किया गया) और STAT2 नॉकआउट प्रयोग (सच गर्भवती काले महिलाओं का इस्तेमाल किया गया; इस मामले में लाइव जन्म दर की गणना की गई थी स्वर्ण पिल्ले का उत्पादन किया कूड़े का प्रतिशत) ।
आनुवंशिक रूप से संशोधित PN इंजेक्शन भ्रूण से उत्पादित पिल्ले का प्रतिशत indels शुरू करने में sgRNA की दक्षता दोनों पर निर्भर करता है और sgRNA में Cas9/ribonucleoproteins pronuclei का सफल इंजेक्शन । हमने पाया है कि sgRNA क्षमता जीन लक्ष्यों (अप्रकाशित टिप्पणियों) के बीच बदलता है । के रूप में तालिका 3में दिखाया गया है, STAT2 के लिए डिजाइन sgRNA ८८.९% की एक जीन लक्ष्यीकरण दक्षता के परिणामस्वरूप, जबकि RAG1 के लिए sgRNA केवल २८.६% कुशल था । चित्रा 5 एक पीसीआर प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता से genotyping परिणाम का एक उदाहरण प्रदान करता है (पीसीआर-RFLP) पिल्ले की RAG1 जीन लक्ष्यीकरण से परख । यह कुछ indels प्रतिबंध एंजाइम मान्यता अनुक्रम, कि पीसीआर-RFLP जीन लक्ष्यीकरण दक्षता को नजरअंदाज कर सकते हैं के बाहर हो सकता है कि नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है । पीसीआर उत्पादों को टा क्लोनिंग में उपक्लोनिंग वैक्टर पीसीआर आवेषण के सैंज अनुक्रमण द्वारा पीछा किया सटीक जीन लक्ष्यीकरण दक्षता को मापने के लिए और indels की प्रकृति को प्रकट करने के लिए आवश्यक हैं ।
चित्रा 1: पुरुष हंसटर नसबंदी ।
क) और ख) एक 2 सेमी ऊर्ध्वाधर चीरा चमड़ी को कपाल विस्तार की शुरुआत १.५ सेमी कपाल बनाओ; ग) संदंश के दो जोड़े के साथ संबद्ध वृषण नस और धमनी से वॉज संमान अलग; घ) वॉज deferens एक संदंश के साथ एक 1 सेमी पाश के रूप में समझ । संदंश के एक दूसरे सेट गर्मी और उत्पाद के पाश जबकि cauterizing छोर समवर्ती । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: मद चक्र ।
क) योनि छुट्टी 1 दिन पर मनाया अपारदर्शी, पीले, और चिपचिपा बी) 4 दिन पर योनि निर्वहन चौकस स्पष्ट और चिपचिपा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: भ्रूण अलगाव के लिए सुई की तैयारी ।
a) लाल रेखा के साथ एक 30 गेज सुई फ्रैक्चर और टिप पॉलिश जब तक यह सपाट और चिकनी है । ख) टिप से ~ 3 मिमी पर एक 30-40 ° कोण बनाओ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: युग्मनज स्थानांतरण ।
क) और ख) 2 सेमी लंबे ऊर्ध्वाधर चीरा शुरू करने के लिए पिछले रिब (लाल रेखा) के लिए 2 cm caudal; ग) एक Hemostats के साथ वसा पैड दबाना और ऊतक पृष्ठीय प्रतिबिंबित; घ) ओवीडक्ट पथ की स्थिति को समायोजित करने और एक 30 गेज सुई के साथ एक खुला घुसना; ङ) भ्रूण अंतरण ग् पिपेट के भीतर zygotes को मोतियों की जंजीर के रूप में व्यवस्थित करना और उं हें खुले में से ओवीडक्ट में अंतरण करना । बार = 1000 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 5। पीसीआर- RAG1 Indels के साथ फाउंडर एनिमल्स के एक-एक कूड़े की RFLP परख करते हैं । एम: 1 केबी प्लस सीढ़ी । WT: जंगली प्रकार । आईडी 1, 3 और 7 बिना खतना के RAG1 indels के अनुरूप बैंड दिखाओ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| शारीरिक वजन (g) | PMSG (IU) | PMSG (उल) |
| < 110 | 10 | २०० |
| 110-135 | 15 | ३०० |
| 135-160 | 20 | ४०० |
| 160-185 | 25 | ५०० |
| > 185 | 30 | ६०० |
| PMSG, गर्भवती घोड़ी का सीरम gonadatropin | ||
तालिका 1. PMSG शरीर के वजन के अनुरूप करता है
| हंसटर | Day 1 | Day 2 | Day 3 | Day 4 | Day 5 |
| दाता | PMSG (9-12 am) | सहवास (6-8 pm) | युग्मनज अलगाव (12-1 pm) | ||
| PN इंजेक्शन (1-3 pm) | |||||
| प्राप्तकर्ता | सहवास (6-8 pm) | भ्रूण स्थानांतरण (3-5 pm) |
तालिका 2. दाता की समय अनुसूची/
| जीन | नहीं. भ्रूण (पिल्ले) | नहीं. लिटर (प्राप्तकर्ता) | नहीं. पॉजिटिव पिल्लर (%) |
| STAT2 | २२९ (५४) | 14 (19) * | ४८ (८८.९) |
| RAG1 | ७७ (21) | 3 (3) | 6 (२८.६) |
| * उपजाऊ पुरुषों के साथ उलझा मादा का इस्तेमाल किया गया; संकेत दिया कूड़े की संख्या केवल उन उत्पादित गोल्डन पिल्ले है । | |||
तालिका 3. Cas9/sgRNA प्रणाली द्वारा स्वर्ण सीरियाई हंसटर में जीन लक्ष्यीकरण की दक्षता
| स्थिति हैंडलिंग/ | आवश्यकताओं | टिप्पणियां |
| परिवेश प्रकाश | सभी परिवेश प्रकाश बंद करें | हंसटर भ्रूण प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं, विशेष रूप से प्रकाश शांत करने के लिए |
| लाइट के दौरान इन विट्रो हैंडलिंग | PN इंजेक्शन के लिए 20 मिनट से कम | हेरफेर प्रकाश जोखिम कम करने के लिए प्रति दौर 15 भ्रूण |
| तापमान | परिवेश तापमान: 28 ± 0.5 ओसी | हंसटर भ्रूण तापमान उतार चढ़ाव के प्रति संवेदनशील है |
| हैंडलिंग तापमान: ३७.५ ओसी | ||
| मध्यम | HECM-9 | 3 दिन से अधिक संग्रह न करें |
| कल्चरल कंडीशन | ३७.५ ओसी, 10% कं2, 5% ओ2 और १००% आर्द्रता | संतुलित मशीन में रातोंरात |
| भ्रूण स्थानांतरण के बाद पशुपालन | से पहले 5 दिनों के भीतर पिंजरे मत बदलो/ | प्राप्तकर्ता अगर परेशान cannibalize पिल्ले होगा; पर्याप्त फीड उपलब्ध कराने/ |
तालिका 4. हंसटर भ्रूण हैंडलिंग और पशुपालन पर अद्वितीय आवश्यकताओं
अनुपूरक 1: GeneArt प्रेसिजन संश्लेषण किट द्वारा sgRNA संश्लेषित । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.
2 अनुपूरक: हंसटर भ्रूण संस्कृति मध्यम-9 (HECM-9) नुस्खा । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.
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Discussion
बेहतर मानव रोग के मॉडल के रूप में गोल्डन सीरियाई हंसटर की क्षमता का दोहन करने के लिए, हम एक CRISPR/Cas9 परिसर को हंसटर जीनोम लक्ष्य देने के लिए एक PN इंजेक्शन प्रोटोकॉल विकसित की है । PN इंजेक्शन प्रोटोकॉल भ्रूण संस्कृति मध्यम, तापमान, और प्रकाश की तरंग दैर्ध्य13सहित कई प्रमुख चर का अनुकूलन । वहां भी कर रहे है कई हंसटर विशिष्ट प्रक्रियाओं है कि सफलतापूर्वक हंसटर में जीन लक्ष्यीकरण आयोजित करने के लिए पालन करने की आवश्यकता हैंडलिंग पशु । उदाहरण के लिए, यौन परिपक्व महिला हंसटर स्थिर 4 दिन मद चक्र है कि exogenous हार्मोन के साथ सिंक्रनाइज़ नहीं किया जा सकता है (जैसे PMSG) । इस प्रकार सही प्रत्येक महिला के मद चक्र ट्रैकिंग दोनों superovulation और pseudopregnancy तैयारी के लिए महत्वपूर्ण है । 30-60 zygotes एक महिला से उत्पादन किया जा सकता है अगर वह सफलतापूर्वक superovulated है । सफल superovulation प्राप्त करने के लिए, यह आवश्यक है प्रजातियों पर विचार करने के लिए वसा के विशिष्ट जमाव । महिला हंसटर, विशेष रूप से उन 12 से अधिक उंर के सप्ताह, अत्यधिक पेट वसा है कि ऐसे सिरिंज सुई सही ढंग से पूरी तरह से वसा पैड घुसना जब हार्मोन इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए तैनात किया जाना चाहिए करते हैं । हमने पाया है कि प्रवेश आधा रास्ता पेरिटोनियल गुहा में हार्मोन डिलीवरी के लिए उपयुक्त दूरी प्राप्त करता है । हम PN इंजेक्शन, हंसटर हैंडलिंग और तालिका 4में पशुपालन के लिए अद्वितीय आवश्यकताओं संक्षेप ।
इंजेक्शन के प्रत्येक दौर के लिए इंजेक्शन पकवान को हस्तांतरित भ्रूण की संख्या PN इंजेक्शन के लिए, विस्तारित इंजेक्शन समय से बचने के लिए प्रयोग करने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए । अब समय भ्रूण पकवान में रहना, अधिक से अधिक मौका है कि वे प्रकाश के लिए जोखिम का अनुभव । हम इंजेक्शन के प्रत्येक दौर के लिए इंजेक्शन पकवान के लिए लगभग 15 भ्रूण स्थानांतरित करने की सलाह देते हैं । यह संख्या इंजेक्शन के दौर की संख्या और प्रकाश के लिए भ्रूण के संतोषजनक प्रदर्शन के बीच एक अच्छा संतुलन प्राप्त है । cytoplasmic और हंसटर भ्रूण की परमाणु झिल्ली के दोनों के रूप में काफी लचीला कर रहे हैं, पर्याप्त बल इंजेक्शन सुई के लिए लागू किया जाना चाहिए करने के लिए नाभिक की झिल्ली घुसना । इस समय के दौरान, pronuclei फोकल रेंज के भीतर रहना चाहिए ।
शोधकर्ताओं ने निंनलिखित शल्य चिकित्सा मुद्दों पर विचार जब भ्रूण स्थानांतरण प्रदर्शन करना चाहिए । सबसे पहले, यह महत्वपूर्ण है कि शरीर की दीवार के माध्यम से चीरा जानवर के शरीर के आकार के अनुरूप है । चीरा बहुत छोटा है, तो यह पेट के लिए प्रजनन पथ लौटने जब ओवीडक्ट से zygotes के बाहर निकालना में परिणाम हो सकता है । चीरा आकार के अलावा, ओवीडक्ट से zygotes के बाहर निकालना के लिए संभावित प्रजनन ऊतक उचित के बजाय संबद्ध वसा पैड से निपटने के द्वारा कम किया जा सकता है । चीरा आकार के संबंध में, यह भी बड़ा चीरा पशु के लिए और अधिक तनाव का कारण हो सकता है कि विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है (उदा संक्रमण dehiscence) जटिलताओं की एक उच्च संभावना है । दूसरा, रक्तस्राव को कम करने के लिए, शोधकर्ताओं incising प्रमुख रक्त वाहिकाओं से बचने के लिए देखभाल करना चाहिए जब पेट तक पहुँचने क्योंकि अतिरिक्त रक्त की कमी सर्जरी तनाव को बढ़ाने के लिए भ्रूण हस्तांतरण की सफलता को कम कर सकते हैं, और वसूली समय का विस्तार
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Disclosures
ZW Auratus जैव, LLC., जैव चिकित्सा अनुसंधान और कृषि अनुप्रयोगों के लिए आनुवंशिक रूप से इंजीनियर जानवरों को बनाने में विशेषज्ञता प्राप्त कंपनी में वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
अनुसंधान इस प्रकाशन में रिपोर्ट एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान (NIAID) पुरस्कार संख्या 1R41OD021979 (ZW) के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के द्वारा समर्थित किया गया था और एक शोध अनुदान द्वारा अगली पीढ़ी के ग्रीन 21 से कार्यक्रम, कोरिया गणराज्य, अनुदान सं । PJ01107704 (to ZW) और अनुदान सं. PJ01107703 (to इक). सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य या हरे रंग के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व 21 । पांडुलिपि के संपादन के लिए हम डॉ॰ निकोलास Robl का धन्यवाद करते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 μg/μL (~6.1 μM) |
| GeneArtTM Precision Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Albumin from human serum | Sigma | A1653 | For cultivation medium |
| Illuminator | Nikon | NI-150 | For embryo transfer |
| Incubator | New Brunswick | Galaxy 14S | For embryo cultivation |
| Microforge | Narishige | PB-7 | For making injection needles |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ti-S | For microinjection |
| Microscope | invitrogen | SMZ745T | For embryo transfer |
| Mineral oil | Sigma | M1840 | Keep in dark |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | For superovulation |
References
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