Summary
α-cytochrome P450s द्वारा यलो नाइट्रोज़एमाइनों का hydroxylation स्वीकार चयापचय मार्ग है जो डीएनए-हानिकारक मध्यवर्ती का उत्पादन करता है, जो उत्परिवर्तनों का कारण है । हालांकि, नया डेटा इंगित करता है आगे nitrosamides के लिए ऑक्सीकरण हो सकता है । हम में से उत्पादित nitrosamides का पता लगाने के लिए एक सामान्य विधि का वर्णन इन विट्रो cytochrome P450-catalyzed चयापचय के नाइट्रोज़एमाइनों.
Abstract
N-नाइट्रोज़एमाइनों पर्यावरण यलो के एक अच्छी तरह से स्थापित समूह है, जो गतिविधि प्रदर्शित करने के लिए cytochrome P450 ऑक्सीकरण की आवश्यकता होती है । चयापचय सक्रियण के स्वीकार किए जाते तंत्र α-hydroxynitrosamines कि अनायास डीएनए alkylating एजेंटों के लिए विघटित के गठन शामिल है । डीएनए क्षति के संचय और परिणामस्वरूप उत्परिवर्तनों अंततः कैंसर के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । नए सबूत इंगित करता है कि α-hydroxynitrosamines आगे cytochrome P450s द्वारा nitrosamides processively के लिए ऑक्सीकरण किया जा सकता है । क्योंकि nitrosamides आम तौर पर α-hydroxynitrosamines की तुलना में अधिक स्थिर होते हैं और डीएनए को alkylate भी कर सकते हैं, nitrosamides कैंसरजनन में भूमिका निभा सकता है । इस रिपोर्ट में, हम से nitrosamide उत्पादन के मूल्यांकन के लिए एक सामांय प्रोटोकॉल का वर्णन इन विट्रो cytochrome P450-catalyzed नाइट्रोज़एमाइनों के चयापचय । इस प्रोटोकॉल प्रासंगिक nitrosamides के संश्लेषण के लिए एक सामान्य दृष्टिकोण का उपयोग करता है और एक इन विट्रो cytochrome P450 चयापचय परख तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग-nanospray ionization-उच्च संकल्प मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री का पता लगाने के लिए. इस विधि का पता चला n ′-nitrosonorcotinine उदाहरण के अध्ययन में n ′-nitrosonornicotine की एक छोटी सी metabolite के रूप में । विधि उच्च संवेदनशीलता और चुनिंदा सटीक जन का पता लगाने के लिए कारण है । nitrosamine-cytochrome P450 प्रणालियों की एक विस्तृत विविधता के लिए इस विधि के आवेदन इस परिवर्तन की सामान्यता का निर्धारण में मदद मिलेगी. क्योंकि cytochrome P450s बहुरूपी है और गतिविधि में बदलती हैं, nitrosamide गठन की एक बेहतर समझ व्यक्तिगत कैंसर जोखिम मूल्यांकन में सहायता कर सकता है ।
Introduction
N-नाइट्रोज़एमाइनों आहार, तंबाकू उत्पादों, और सामान्य वातावरण में पाए जाने वाले यलो के एक बड़े वर्ग हैं; इन्हें मानव शरीर1में endogenously भी बनाया जा सकता है । ३०० से अधिक N-nitroso यौगिकों का परीक्षण किया गया है और & #62; ९०% का मूल्यांकन पशु मॉडल2,3में यलो के रूप में किया गया । उनके कार्सीनोजेनिसिटी प्रदर्शित करने के लिए, इन यौगिकों पहले cytochrome P450s1,2,3द्वारा सक्रिय किया जाना चाहिए । अनुसंधान से पता चलता है कि cytochrome P450s आसानी से α-hydroxynitrosamines के लिए नाइट्रोज़एमाइनों ऑक्सीकरण (चित्रा 1), जो उच्च के साथ प्रतिक्रियाशील यौगिकों रहे है ~ 5 एस के पहले अनायास को alkyldiazohydroxides के लिए लिख । इसके बाद एच2ओ और एन2के नुकसान के बाद डीएनए alkylate कर सकते हैं । परिणामस्वरूप डीएनए adducts, अगर मरंमत, उत्परिवर्तन का कारण है कि, अगर महत्वपूर्ण onco में-या ट्यूमर दमन जीन, कैंसर के विकास के लिए सीसा1कर सकते हैं । इस कारण से, बहुत प्रयास चयापचय रास्ते की एक पूरी समझ प्राप्त करने के लिए व्यय किया गया है, डीएनए adducts, और अनुप्रवाह यलो नाइट्रोज़एमाइनों के cytochrome P450 ऑक्सीकरण के चयापचयों. यह ज्ञान व्यक्तिगत कैंसर जोखिम आकलन4में संभावित आवेदन किया है ।
चित्रा 1: नाइट्रोज़एमाइनों के सामांय और प्रस्तावित चयापचय ।
नाइट्रोज़एमाइनों (1) α-hydroxynitrosamines (2) जो अनायास alkyldiazohydroxides (3) को विघटित करने के लिए P450s द्वारा ऑक्सीकरण हो जाता है । डीएनए adducts बनाने के लिए ये यौगिक डीएनए को बांध सकते हैं । यह कल्पना की है कि 2 आगे P450s द्वारा nitrosamides 4के लिए ऑक्सीकरण कर रहे हैं । ये सीधे डीएनए को उपंयास डीएनए adducts रूप से बांध कर सकते है या करने के लिए hydrolyzed किया जा करने के लिए 3 ज्ञात डीएनए adducts फार्म । r1 और r2 किसी भी alkyl समूह का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
हालांकि α-hydroxynitrosamine परिकल्पना ठोस रूप से व्यापक डेटा द्वारा समर्थित है, वहां कुछ विसंगतियां हैं; एक प्रमुख एक α की छोटी आधा जीवन है-hydroxynitrosamines5,6। यह ज्ञात है कि इन यौगिकों endoplasmic जालिका झिल्ली और बाद में alkylate परमाणु डीएनए में उत्पादित कर रहे हैं । कुछ सेकंड के अपने जीवनकाल को देखते हुए, यह puzzling कैसे इन मध्यवर्ती cytosol हालांकि आवश्यक यात्रा जीवित है । एक परिकल्पना है कि α-hydroxynitrosamines के एक हिस्से में processively ऑक्सीकरण nitrosamides के लिए7,8है, जो काफी है तुलना9में स्थिर हैं । यह संभवतः cytochrome P450 सक्रिय साइट में α-hydroxynitrosamines की अवधारण के माध्यम से हो सकता है । ऑक्सीकरण के इस प्रकार के लिए मिसाल निकोटीन के साथ देखा गया है10, अल्कोहल11, और सरल alkylnitrosamines12,13। साथ ही, nitrosamides डायरेक्ट-एक्टिंग यलो2,3हैं । उनके जेट9के आधार पर, इन यौगिकों डीएनए adducts नए, बेरोज़गार डीएनए adducts (चित्रा 1) के साथ α-hydroxynitrosamines के परिणामस्वरूप उन लोगों के लिए समान उत्पादन माना जाता है । इस प्रकार, इस परिकल्पना न केवल cytosol के माध्यम से परिवहन बताते हैं, लेकिन यह भी डीएनए क्षति उत्पादों के गठन ।
इस पत्र में, आकलन करने के लिए एक जनरल प्रोटोकॉल में इन विट्रो cytochrome P450-मध्यस्थता रूपांतरण नाइट्रोज़एमाइनों करने के लिए nitrosamides का वर्णन किया गया है. n '-nitrosonornicotine (NNN) के लिए एन ′-nitrosonorcotinine (NNC) cytochrome P450 2A6 द्वारा पहले रिपोर्ट की गई रूपांतरण एक उदाहरण14के रूप में प्रदर्शित किया जाता है । सब्सट्रेट-एंजाइम सिस्टम की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इस प्रोटोकॉल के आवेदन समग्र nitrosamine चयापचय में nitrosamides के महत्व को निर्धारित करने में मदद मिलेगी ।
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Protocol
- संश्लेषित NNN के रूप में पहले से वर्णित < सुप class = "xref" > 15 . प्राप्त norcotinine, P450 2A6 Baculosomes, NADPH पुनर्जनन प्रणाली, 0.5 x & #160; रिएक्शन बफर, और अन्य सभी रसायनों या सॉल्वैंट्स में वाणिज्यिक स्रोतों से एजेंट ग्रेड. एक ५०० मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रोमीटर पर
- रिकॉर्ड एनएमआर स्पेक्ट्रा । प्रति मिलियन (पीपीएम) भागों के रूप में रासायनिक बदलाव की रिपोर्ट । के लिए आंतरिक संदर्भ के रूप में अवशिष्ट विलायक चोटियों का प्रयोग करें 1 H-एनएमआर (७.२६ पीपीएम CDCl 3 ) और 13 सी-एनएमआर (७७.२ पीपीएम CDCl 3 ) ।
नोट: पीक विभाजन में निंन संक्षिप्त उपयोग किए गए: s = स्वेटर, d = नक़ल, dd = नक़ल of दोहरी, dt = नक़ल of जुड़वां, डीक्यू = नक़ल of चौकड़ी, ddd = नक़ल of नक़ल, and m = दोहरी. multiplet - एक LTQ Orbitrap Velos पर चयनित यौगिकों के लिए उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HRMS) प्रदर्शन और m/z . के रूप में रिपोर्ट डेटा
- polygram पूर्व लेपित सिलिका जेल टीएलसी प्लेट्स (४० मिमी x ८० मिमी, ०.२ मिमी मोटी) के साथ २५४ एनएम फ्लोरोसेंट संकेतक के लिए पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) का उपयोग करें । यूवी दीपक विकिरण द्वारा टीएलसी प्लेट्स कल्पना.
- प्रदर्शन flash क्रोमैटोग्राफी a ६० & #197;, 70-150 मेष सिलिका जेल एक १.५ सेमी x 15 सेमी ग्लास कॉलम का उपयोग कर ।
- सूखी, रातोंरात एक ओवन में (16 ज, ~ १४० & #176; ग), एक 25 मिलीलीटर, गोल नीचे कुप्पी युक्त एक चुंबकीय हलचल पट्टी । सुबह में, n 2 की एक धारा के तहत कुप्पी ठंडा जबकि एक तेल bubbler का उपयोग कर एन 2 प्रति सेकंड एक बुलबुला के तहत प्रवाह दर रखने के लिए ।
नोट: ठंडा होने के बाद, N 2 के तहत कुप्पी रखने के लिए कोई सावधानियां आवश्यक हैं ।
एक धुएं डाकू में - , norcotinine जोड़ें (३१.८ मिलीग्राम, ०.१९६ mmol), एसिटिक एनहाइड्राइड (5 मिलीलीटर), और एसिटिक एसिड (1 मिलीलीटर) को ठंडा कुप्पी । इस मिश्रण को लगातार हिलाते हुए, 0 & #176 को ठंडा करते हुए एक जल-बर्फ के स्नान के साथ; सी.
सावधानी: एसिटिक एनहाइड्राइड और एसिटिक अम्ल संक्षारक होते हैं. - एक भाग में नैनो 2 (३३.३ मिलीग्राम, ०.४८३ mmol) जोड़ें और लगातार २.५ एच मॉनिटर प्रतिक्रिया प्रगति के लिए मिश्रण हलचल टीएलसी द्वारा (१००% EtOAc, आर f = ०.१९, चरण १.४ देखें) ।
नोट: इस समय, मिश्रण तेजी से कभी bubbling के साथ पीले रंग का हो जाएगा । - बर्फ में मिश्रण डालने से प्रतिक्रिया बुझाने-शीत एच 2 O (18 एमएल) । तुरंत एक १०० मिलीलीटर विभाजक कीप में CH 2 सीएल 2 के 18 मिलीलीटर के साथ जलीय समाधान निकालें । 2 सीएल 2 (9 मिलीलीटर प्रत्येक) के साथ कम से कम 2 अतिरिक्त बार जलीय परत निकालें ।
- सूखे पर परित कार्बनिक ~ १०० MgSO 4 के 2 मिनट के लिए मिलीग्राम और फिल्टर और रोटरी वाष्पीकरण द्वारा समाधान ध्यान केंद्रित करने के लिए एक कच्चे तेल, पीले रंग की उपज । जल स्नान को गरम करें 30 & #176; ग वाष्पीकरण के दौरान अवशिष्ट एसिटिक अम्ल को दूर करने के लिए.
नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है अगर यौगिक CH 2 सीएल 2 में भंग कर दिया है और 2-8 & #176 पर अंधेरे में संग्रहीत समाधान; C. - द्वारा कच्चे यौगिक शुद्ध स्तंभ क्रोमैटोग्राफी (देखें चरण १.५) सिलिका जेल के रूप में स्थिर चरण और १००% EtOAc के रूप में eluent < सुप वर्ग = "xref" > १६ .
सावधानी: NNC और संबंधित nitrosamides को देखभाल के साथ हैंडल किया जाना चाहिए क्योंकि इन्हें ह्यूमन यलो माना जाता है । - शुद्ध यौगिक भंग CDCl 3 और उपयोग एनएमआर (देखें चरण १.२) संरचना की पुष्टि करें और इस समाधान के molarity का निर्धारण करने के लिए < सुप वर्ग = "xref" > १७ . इस समाधान को अंधेरे में स्टोर 2-8 & #176; C जब तक जरूरत हो.
नोट: इस समाधान में में सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा इन विट्रो परख (३.५ कदम) । एनएमआर स्पेक्ट्रा और रासायनिक बदलाव समर्थन जानकारी में उपलब्ध हैं । - एक शुद्ध NNC समाधान के साथ, सही जनक द्रव्यमान की पुष्टि करें और कदम १.३ और ४.३ में वर्णित मापदंडों के तहत एक उच्च संकल्प द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर (HRMS) पर प्रत्यक्ष अर्क द्वारा उत्पाद आयन जनता का निर्धारण ।
नोट: उत्पाद जन इन विट्रो चयापचय परख (४.३ कदम) में में इस परिसर का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
- निकालें P450 2A6 Baculosomes, ज्वलंत-NADPH-पुनर्जनन प्रणाली, और 10 मिमी NADP + स्टॉक समाधान एक से-८० & #176; सी फ्रीजर और उन्हें बर्फ पर गल जाने दें. एक बार गल, 0.5 x प्रतिक्रिया बफर के साथ एक एकल 1 मिलीलीटर ट्यूब में क्रमशः, Baculosomes और NADPH-पुनर्जनन प्रणाली 1:10 और 1:50, पतला । इसी प्रकार, 3 & #956; l का NADP + स्टॉक हल करने के लिए ९७ & #956; l के 0.5 x प्रतिक्रिया बफ़र.
नोट: NADP + हल्का संवेदनशील है । एल्यूमीनियम पंनी में अपने कंटेनर लपेटकर इस समाधान को सुरक्षित रखें । एंजाइम समाधान फ्रीज-गल चक्र के प्रति संवेदनशील हैं; कोई 2 से अधिक चक्रों के लिए इस सीमा । भविष्य के प्रयोगों के लिए आवश्यक के रूप में aliquots तैयार करें । - प्रत्येक मशीन के लिए, जोड़ ५० & #956; एंजाइम समाधान (5 pmol P450 युक्त) के एल 1 ४० युक्त ट्यूब करने के लिए 4 & #956; l के ४ & #956; M NNN समाधान के साथ बना दिया । पूर्व ३७ पर 2 मिनट के लिए इस नए मिश्रण गर्मी & #176; ग एक जल स्नान का उपयोग कर और फिर जोड़ने के 10 & #956; L के पतला NADP + हल. 1-30 मिनट पर ३७ & #176; C.
के लिए पूर्ण प्रणाली की मशीन नोट: मशीन समय (जैसे 5, 10, 15 मिनट, आदि) के लिए 5 मिनट अंतराल का उपयोग कर एक पर्याप्त nitrosamide गठन समय पाठ्यक्रम प्रदान करेगा । - के बाद वांछित मशीन समय, पहले जोड़कर बुझा 10 & #956; l के ३.० n ZnSO 4 और उसके बाद 10 & #956; l के ३.० n बा (OH) 2. भंवर इस समाधान और एक सफेद वेग फार्म का होगा । 4 मिनट के लिए ८००० x g पर नमूना केंद्रापसारक को गोली करने के लिए हाला.
नोट: प्रक्रिया का गठन nitrosamides जलीय समाधान में स्थिरता सीमित है के रूप में इस कदम पर नहीं रुका होगा । लंबे ठहरावों गलत नकारात्मक में परिणाम हो सकता है । - तुरंत पिपेट को supernatant और श्लेष 2 & #956; L ारा तरल क्रोमैटोग्राफी positive nanoelectrospray-ionization उच्च संकल्प मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-NSI + -HRMS/MS, steps ४.१-४.३). सकारात्मक नियंत्रण की मशीन के लिए
- , एक 1 मिलीलीटर ट्यूब में N 2 की धारा के तहत संश्लेषित NNC समाधान के १०० fmol युक्त एक aliquot लुप्त हो जाना । इस शीशी के लिए, ३.२ कदम से पूर्ण एंजाइम प्रणाली जोड़ने और आगे बढ़ना के रूप में कदम ३.३-३.४. के लिए वर्णित
- नकारात्मक नियंत्रण मशीन के लिए, प्रयोग के रूप में वर्णित (चरण ३.२-३.४) को छोड़कर ५० & #956; एल एंजाइम समाधान 0.5 x प्रतिक्रिया बफर के साथ ।
- नियंत्रण रेखा घटक के लिए, एक UPLC सिस्टम के लिए चरण ४.२ में निंन बहु-चरण ग्रैडिएंट लागू करें एक वाणिज्यिक, हाथ से पैक्ड < सुप वर्ग का उपयोग कर = "xref" > 18 C18 (5 & #956; m), १०० मिमी x ७५ & #956; m, 15 & #956; मी छिद्र केशिकार स्तम्भ.
- का प्रयोग 5 मिमी NH 4 OAc के रूप में विलायक ए और MeCN के रूप में विलायक बी, पर 5% B पर चला कर स्तंभ पर नमूना लोड 1 & #956; L/ 0-5 मिनट से, और उसके बाद प्रवाह दर को धीमा करने के लिए ०.३ & #956; L/मिनट बाद में । इसके बाद, 5 से 20% b से 4 मिनट पर ग्रैडिएंट चलाएं, जिसके बाद 10 मिनट से अधिक ५५% b को रैंप पर, और फिर 5% b. को पुन: equilibration
- प्रदर्शन-NSI + -HRMS/MS पर एक LTQ Orbitrap. दोनों पूर्ण स्कैन और एमएस 2 विखंडन द्वारा NNC के लिए निगरानी । ६०,००० के एक संकल्प पर पूर्ण स्कैन प्रदर्शन और 5 पीपीएम के एक बड़े पैमाने पर सहिष्णुता पर सटीक जनक मास (१९२.०७६७०) निकालने । का प्रयोग करें MS 2 विखंडन जनक आयनों को अलग करने के लिए (२.० एएमयू) और टुकड़ा टक्कर से प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) 25 eV की एक टक्कर ऊर्जा के साथ, १५,००० के संकल्प, और 30 के समय स्कैन MS. NNC के उत्पाद आयनों के लिए सटीक जनता को निकालें ( m/z १९२ m/z १३४.०४७३९ और १६२.०७८७४) 5 पीपीएम की एक जन सहिष्णुता पर.
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Representative Results
व्हाइट एट अलके काम के आधार पर । 19, norcotinine को NNC करने के लिए nitrosated था और उच्च उपज में (८०-९२%) इन विट्रो प्रयोग के लिए एक मानक का उत्पादन । एक सफल प्रतिक्रिया के लिए संरचनात्मक सबूत 1एच एनएमआर, 13सी-एनएमआर, मधुर, और HSQC (जानकारी का समर्थन) सहित स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण से प्राप्त किया गया था HRMS जो जनक द्रव्यमान की पुष्टि की [एम + एच]+ के भीतर 5 पीपीएम सैद्धांतिक मान (चित्र 2) । NNC के एमएस2 विखंडन सबसे प्रचुर मात्रा में उत्पाद आयन आम जनता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । निर्धारित सटीक जनक द्रव्यमान और उत्पाद आयन द्रव्यमान का उपयोग LC-NSI+-HRMS/MS विधि इन विट्रो परख में किया जाता है । अगर 2-8 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में संग्रहीत, NNC समाधान कम से कम 3 महीने के लिए स्थिर है । के रूप में यह एक बहुत ही सामांय प्रतिक्रिया है, यह किसी भी 2 डिग्री के बीच में आवेदन किया है ।
चित्रा 2: HRMS और NNC के HRMS2 स्पेक्ट्रम ।
एक) 5 पीपीएम की एक जन सहिष्णुता के साथ NNC के सही माता पिता जन: गणना: [एम + एच]+ = १९२.०७६७५, पाया: १९२.०७६७० । बी)2 एम/जेड १९२ के विखंडन २.० एएमयू के एक अलगाव चौड़ाई के साथ । दो सबसे प्रचुर मात्रा में उत्पाद आयनों १३४.०४७३९ और १६२.०७८७५ हैं । रसायन. Res. Toxicol., २०१६, 29, पीपी 2194-2205 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कॉपीराइट २०१६ अमेरिकन केमिकल सोसायटी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
संश्लेषित NNC के लिए मानक के रूप में उपयोग किया गया था इन विट्रो P450 चयापचय परख । Cytochrome P450 2A6 प्रयोग किया जाता था क्योंकि यह NNN ऑक्सीकरण का एक प्रभावी उत्प्रेरक20जाना जाता है । इसी तरह, NNN एकाग्रता 2 माइक्रोन के लिए निर्धारित किया गया था के रूप में यह α के लिए कश्मीरएम -hydroxylation21अनुमानित । क्रोमेटोग्राफिक शर्तों के तहत वर्णित है, सिंथेटिक NNC elutes पर ~ १७.५ मिनट के साथ अच्छी तरह से हल चोटियों दोनों जनक आयन और उत्पाद आयन चैनल में । सकारात्मक नियंत्रण के अनुसार, NNC के गठन में 1, 5, और 10 मिनट की गर्मी में उल्लेख किया गया था ।
चित्रा 3: नियंत्रण रेखा-NSI-HRMS chromatograms NNN-cytochrome P450 2A6 की गर्मी से उत्पंन ।
सभी वर्गों के लिए, शीर्ष वर्णलेख सही NNC के लिए पूर्ण स्कैन से निकाला जनक मास है । मध्य और नीचे chromatograms दो सटीक उत्पाद आयन जन NNC के लिए एमएस2 विखंडन से निकाले जाते हैं । वर्गों के रूप में इस प्रकार हैं: NNC मानक (क), NNC-cytochrome P450 2A6 सभी प्रासंगिक एंजाइमों और 1 मिनट (बी), 5 मिनट (सी), और 10 मिनट की मशीन के साथ cofactors युक्त की गर्मी (घ) । RT = अवधारण समय; MA = मास क्षेत्र । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
NNC स्तर 5 मिनट में अधिक से अधिक थे और बाद में समय अंक में कमी आई । सापेक्ष quantitation एक मानक अनुमानित अधिकतम NNC स्तर के रूप में सिंथेटिक NNC का उपयोग कर 10 एनएम हो । नकारात्मक नियंत्रण में P450 प्रणाली की कमी, कोई NNC गठन का पता चला (डेटा नहीं दिखाया गया), इस प्रकार एंजाइमी रूपांतरण का संकेत आवश्यक था । एक साथ, इस प्रोटोकॉल P450 2A6 द्वारा NNC के लिए NNN के रूपांतरण के लिए प्रत्यक्ष सबूत से पता चलता है, हालांकि गठन की हद तक α के hydroxylation-NNN की तुलना में मामूली है ।
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Discussion
Elucidating नाइट्रोज़एमाइनों के चयापचय उनके कार्सीनोजेनिसिटी को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण घटक है । के बाद से शामिल cytochrome P450s और अंय चयापचय एंजाइमों बहुरूपी हैं, इस ज्ञान के आगे आवेदन संभावित उच्च जोखिम वाले व्यक्तियों1,4पहचान सकता है । नया डेटा इंगित करता है कि आगे α के ऑक्सीकरण-hydroxynitrosamines, नाइट्रोज़एमाइनों के माना प्रमुख चयापचयों डीएनए बंधन में शामिल nitrosamides के लिए संभव है; हालांकि, यह मजबूती से सब्सट्रेट्स की एक विस्तृत श्रृंखला में परीक्षण नहीं किया गया है । हम नाइट्रोज़एमाइनों के जुलूस ऑक्सीकरण की हद तक nitrosamides इन विट्रो मेंनिर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है । इस विधि के व्यापक आवेदन में मदद मिलेगी चयापचय के इस मार्ग के समग्र महत्व का निर्धारण ।
विधि nitrosamide हित के लिए एक मानक तैयार करने से शुरू होता है । उदाहरण के अध्ययन में यह NNC, तंबाकू की एक परिकल्पना metabolite यलो NNN, तंबाकू उत्पादों में पाया जाने वाला एक यलो14,22है । के रूप में वर्णित है, norcotinine के nitrosation कोई समझदार पक्ष उत्पादों के साथ आसानी से आगे बढ़ना । कच्चे उत्पाद केवल शुरुआत के बीच और एसिटिक एसिड, जो आसानी से कॉलम क्रोमैटोग्राफी द्वारा हटाया गया द्वारा प्रदूषित था । यह एनएमआर और HRMS द्वारा संरचना की पुष्टि के बाद किया गया था । इस विधि का एक लाभ यह है कि यह वस्तुतः किसी भी छुटकारे के लिए उपयुक्त है, जो एकाधिक nitrosamine/nitrosamide प्रणालियों की जांच करने की अनुमति देता है । साथ ही, quantitation के लिए एनएमआर का उपयोग मानक समाधान17के लिए molarity का सीधा माप देता है । इस तरह के रिवर्स चरण HPLC के रूप में विनाशकारी तकनीक द्वारा माप की आवश्यकता के बजाय निष्क्रिय शर्तों के तहत यौगिक के भंडारण की अनुमति देता है । फिर विभिन्ना कमजोरियां प्रयोग डिजाइन के अनुरूप बनाई जा सकती हैं.
एक सकारात्मक नियंत्रण और एक अच्छी तरह से विशेषता सामूहिक विखंडन पैटर्न के साथ, अति संवेदनशील और चयनात्मक नियंत्रण रेखा-NSI+-HRMS/MS विधि एक अपेक्षाकृत जटिल मैट्रिक्स में nitrosamides का पता लगाने की अनुमति देता है । के रूप में दिखाया गया है, विधि 1-10 एनएम या 2-20 fmol के एक NNC एकाग्रता का अनुमान १०००-nitrosamine, एंजाइम, और अंय cofactors शुरू की अधिक गुना के बावजूद कॉलम । संवेदनशीलता और विधि की selectivity उच्च संकल्प जन निगरानी, जो मानक नियंत्रण रेखा-एमएस सिस्टम की कमी के उपयोग के कारण कर रहे हैं । एक 5 पीपीएम जन सहिष्णुता के साथ माता पिता आयन चयन सुनिश्चित करता है कि केवल वांछित आणविक सूत्र के साथ यौगिकों अलग कर रहे हैं । इसी तरह, उनके प्रतिधारण समय के साथ दो सबसे प्रचुर मात्रा में उत्पाद आयनों की सटीक सामूहिक पहचान अतिरिक्त analyte पुष्टि देता है । इस वजह से, मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधि की आवश्यकता है कि कई मापदंडों अलगाव चौड़ाई, टकराव ऊर्जा, और स्कैन समय सहित अनुकूलित कर रहे हैं । नियंत्रण रेखा ढाल भी सह के रूप में संवेदनशीलता में सुधार संशोधित किया जा सकता है अंय पदार्थों के साथ रेफरेंस लक्ष्य nitrosamide के साथ आयन जाल भरने की सीमा होगी ।
उदाहरण के अध्ययन में14, NNC गठन गौण था । बड़े पैमाने पर क्षेत्र के आधार पर, NNC था ~ ४०००-α के hydrolyzed उत्पादों की तुलना में कम प्रचुर मात्रा में-hydroxyNNN21। हालांकि यह इंगित करता है NNC NNN की एक बहुत छोटी metabolite है, अंय प्रणालियों अलग हो सकता है । चौधरी एट अल. dimethylnitrosamine और diethylnitrosamine के काफी, जुलूस ऑक्सीकरण पाया; हालांकि, nitrosamide इंटरमीडिएट उनकी शर्तों12के तहत undetectable था । यह संभव है कि यहां वर्णित तकनीक द्वारा अपने सिस्टम renitrosamide गठन खुलासा हो सकता है । उनके गठन के स्तर की परवाह किए बिना, α-hydroxynitrosamines की तुलना में nitrosamides की उच्च स्थिरता का संकेत हो सकता है कि इन यौगिकों जैविक महत्व के रूप में वे और अधिक आसानी से सेल परिवहन चाहिए ।
हालांकि इस विधि सबसे nitrosamine-एंजाइम सिस्टम के लिए लागू हो जाएगा, वहां कुछ सीमाएं हैं । सबसे महत्वपूर्ण एक यह है कि विधि मात्रात्मक नहीं है । उदाहरण प्रयोग में, गठन एक सकारात्मक नियंत्रण नमूना के जन spectrometric शिखर क्षेत्र से अनुमान लगाया गया था । एक अधिक सटीक माप के लिए, एक आइसोटोप-कमजोर पड़ने विधि एक isotopically बला nitrosamide का उपयोग विकसित किया जा सकता है । एक अंय दृष्टिकोण ऐसे N-acetyllysine या n-असेटयलस्यस्थेने के रूप में यौगिकों के साथ एक फँसाने की रणनीति को लागू किया जाएगा, लेकिन यह हमारे हाथ14में तारीख करने के लिए असफल था ।
एक अंय सीमा nitrosamides की प्रवृत्ति को आसानी से9hydrolyze है; इस प्रकार नमूनों को व्यक्तिगत रूप से संसाधित किया जाना चाहिए. यह कार्यप्रवाह धीमा कर देता है और नमूनों को विश्लेषण के लिए सहयोगियों को भेजे जाने से रोकता है । अंत में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हालांकि cytochrome P450 2A6 और कई अंय व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, कुछ प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धि की आवश्यकता को प्राप्त करते हैं । उदाहरण के लिए, यह परख cytochrome P450 2A1314के लिए लागू किया गया था, लेकिन यह केवल एक कठोर अलगाव प्रक्रिया23के बाद उपलब्ध है ।
संक्षेप में, हम nitrosamides का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है cytochrome P450-catalyzed मेंनाइट्रोज़एमाइनों के ऑक्सीकरण से जिसके परिणामस्वरूप । प्रोटोकॉल एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक nitrosamide मानक के लिए एक सामान्य संश्लेषण और इन विट्रो cytochrome P450 चयापचय परख का उपयोग कर नियंत्रण रेखा-NSI+-HRMS/MS के लिए पता लगाने के लिए शामिल हैं । उदाहरण के अध्ययन में, NNC सभी मशीन 1-10 मिनट से लेकर समय पर पता चला था, लेकिन केवल NNN के एक छोटे metabolite के रूप में । अन्य नाइट्रोज़एमाइनों के लिए इस प्रोटोकॉल के आवेदन अपनी सामान्यता का आकलन और nitrosamine कैंसरजनन में nitrosamides की संभावित भूमिका होगी.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस अध्ययन में अनुदान सं. का समर्थन किया गया । सीए-८१३०१ राष्ट्रीय कैंसर संस्थान से । हम संपादकीय सहायता के लिए बॉब कार्लसन धंयवाद, डॉ पीटर Villalta और Xun मिंग जन स्पेक्ट्रोमेट्री सहायता के लिए विश्लेषणात्मक जैव रसायन में मेसन कैंसर केंद्र के संसाधन साझा, और डॉ एडम टी Zarth और डॉ अंना मिशेल उनके मूल्यवान विचार विमर्श के लिए और इनपुट । विश्लेषणात्मक जैव रसायन साझा संसाधन आंशिक रूप से राष्ट्रीय कैंसर संस्थान कैंसर केंद्र सहायता अनुदान सीए द्वारा समर्थित है-७७५९८
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Norcotinine | AKoS GmbH (Steinen, Germany) | CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 242845 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 431311 | |
| Barium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 433373 | |
| D-Chloroform | Sigma-Aldrich | 151823 | |
| HPLC Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | 34856 | |
| Sodium Nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ViVid CYP2A6 Blue Screening Kit | Life Technologies | PV6140 | |
| Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | 221376 | |
| 0.5 mL tubes | Fisher | AB0533 | |
| 100 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z510424 | |
| 125 mL Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | CLS4980125 | |
| 125 mL Separatory Funnel | Sigma-Aldrich | Z261017 | |
| 25 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 500 MHz NMR Spectrometer | Bruker | ||
| Allegra X-22R Centrifuge | Beckman-Coulter | ||
| LC vials | ChromTech | CTC–0957–BOND | |
| LTQ Orbitrap Velos | Thermo Scientific | ||
| Magnetic Stir bar | Sigma-Aldrich | Z127035 | |
| NMR tube | Sigma-Aldrich | Z274682 | |
| P1000, P200, and P10 pipettes | Eppendorf | ||
| Rotary evaporator | Sigma-Aldrich | Z691410 | |
| RSLCnano UPLC system | Thermo Scientific | ||
| Shaking Water Bath | Fisher | FSSWB15 | |
| Stir plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420 | |
| PicoFrit Column | New Objective | PF3607515N5 | |
| Luna C18, 5 um | Phenomenex | 535913-1 |
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