Здесь мы представляем протокол для описания простой, быстрой и эффективной прионных амплификации метод, метод реального времени дрожат индуцированной преобразования (RT-QuIC).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Реальном времени дрожат индуцированной Assay преобразования для обнаружения CWD прионов в фекалии
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
RT-QuIC техника относится чувствительных в пробирке клеток бесплатно прионы амплификации основана главным образом на в сеяный сворачиванию и агрегации рекомбинантных прионных белков (PrP) субстрата с помощью прионных семена как шаблон для преобразования. RT-QuIC является роман техника высокой пропускной способности, которая аналогична реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР). Обнаружение амилоида фибриллярных роста на основе красителя Тиофлавин Т, которая флуоресцирует на специфическое взаимодействие с богатой белками ᵦ-лист. Таким образом амилоидных формирования могут быть обнаружены в режиме реального времени. Мы попытались разработать надежный неинвазивные скрининг-тест для выявления хронической тратить прионов болезни (CWD) в фекальных экстракт. Здесь мы специально адаптированных RT-QuIC техника раскрыть что PrPSc посева деятельность в фекалиях CWD инфицирован оленей. Первоначально посева деятельность фекальных экстрактов, которые мы подготовили был относительно низким в RT-QuIC, возможно из-за потенциальных ингибиторов пробирного в фекалии. Чтобы улучшить деятельность посева Кала экстрактов и удалить потенциальных ингибиторов пробирного, мы гомогенизированные фекальных проб в буфер, содержащий моющих средств и ингибиторов протеазы. Мы также представили образцы различных методологий сконцентрироватьSc PrP на основе белков осадков с использованием натрия фосфорвольфрамовой кислоты и центробежной силы. Наконец экстракты фекалии были протестированы оптимизированный RT-QuIC которая включала замену субстрата в протоколе улучшить чувствительность обнаружения. Таким образом мы создали протокол для чувствительных обнаружения CWD прионных посева деятельность в фекалиях доклинических и клинических оленей по RT-QuIC, который может быть практическим инструментом для неинвазивной диагностики CWD.
Введение
Прионы заболеваний или трансмиссивные формы губкообразной энцефалопатии (TSE) являются нейродегенеративных расстройств, включая болезни Крейтцфельда - Якоба (CJD) в организме человека, губчатой энцефалопатией (BSE) крупного рогатого скота, почесуха овец и коз и хронической тратить болезнь (CWD) в оленей 1,2. ТГЭ характеризуются отличительной губкообразная внешний вид и потери нейронов в головном мозге. Согласно гипотезе «только белок» прионы главным образом состоят из ОТРSc («Sc» для почесуха) 3, смятых изоформы хост кодировке сотовой прионных белков, ОТРC. PrP
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. RT-QuIC используя фекалии
- , Подготовка cervid Кала извлекает
- сделать фекальных огневки, добавив 1 g фекального материала до 10 мл Кала экстракт буфера (фосфат натрия 20 мм, pH 7.1, 130 мм NaCl, 0,05% 20 анимации, 1 мм PMSF и 1 x дополняют ингибиторы протеазы, ЭДТА бесплатно) дать окончательный концентрации 10% (w/v). Гомогенизация буфер могут быть подготовлены до использования и температуре -20 ° с.
- Homogenize фекальные пеллеты (1 g) и буфер (10 мл) в трубы (например, gentleMACS M трубки) с помощью диссоциатором с заданной программы от производителя для белков за 1 мин при комнатной температуре. Повторите этот шаг два-....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
CWD фекальных экстрактов, подготовленный на 10% (w/v) смогли семян RT-QuIC реакции, но чувствительность обнаружения была низкой 27. С помощью определенного буфера для фекалий гомогенизации был критический шаг, чтобы избежать высокой фоновой флуоресценции в RT-QuIC реакциях сочетанной с использованием мыши rPrP субстрата, а не олень rPrP, что позволило получить более конкретные результаты 27. Добавление NaPTA осадков уменьшена спонтанное прео.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
RT-QuIC ранее работал для выявления CWD прионов мочи и фекальных экстракты устно зараженных белохвостый олень и оленя мула 38. Система, показанной в этой рукописи является адаптированы методом RT-QuIC assay. Дополнительные меры были включены в «классических» RT-QuIC assay для улучшения обнаружения и чувствительность анализа для CWD прионов в фекалии зараженных животных.
Низкая чувствительность обнаружения в Кале экстракты привело нас к улучшению RT-QuIC протокола. Чтобы.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Мы благодарны д-р Байрон Caughey (низ скалистые горы лаборатории) для профессиональной подготовки и плазмид бактериальной выражение ОТР cervid. SG поддерживается программой Канада исследований кафедры. Мы признаем, финансирование для этого исследования SG от Альберта прионных научно-исследовательский институт генома Канады и Альберта сельского и лесного хозяйства через геномом Альберта и университета Калгари в поддержку этой деятельности. Мы признаем исследовательский грант от Фонда Ганн Маргарет животных исследований.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <прочные>Материалы | |||
| Акродиски фильтры | PALL | 4652 | |
| amicon Ultra-15 Центробежный фильтрующий блок | Millipore | UCF901024 | |
| BD 10 мл seringe | VWR | CA75846-842 | |
| Хлорамфеникол | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Corning крышка бутылки вакуумные фильтры | Sigma-Aldrich | 431118 | |
| этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| gentleMACS M Tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | |
| Гуанидина гидрохлорид | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| Имидазол | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Изопропанол | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Сульфат канамицина | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Бульон Лурия-Бертани (LB) | ThermoFisher Scientific | 12780029 | |
| Хлорид магния | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| N2 добавка (100X) | ThermoFisher Scientific | 15502048 | |
| N-лауроилсаркозин натриевая соль (саркозил) | Sigma-Aldrich | ML9150 | |
| Nanosep центробежные устройства с омега мембраной 100K | PALL | OD100C34 | |
| Nunc уплотнительные ленты | ThermoFisher Scientific | 232702 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-000 | |
| фенилметилсульфонилфторид (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Таблетка ингибитора протеазы | Roche | ||
| Хлорид натрия | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Дезоксихолат натрия | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Додецилсульфат натрия (SDS) | Calbiochem | 7910-OP | |
| фосфат натрия | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Фосфат натрия двухосновной безводный | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Моноосновной моногидрат фосфата | натрия Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Фосфовольфрамат натрия (NaPTA) | Sigma-Aldrich | 496626 | |
| Тиофлавин | T Sigma-Aldrich | T3516 | |
| Трис-гидрокси-метил-амино-метан (Tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Triton-100 | Calbiochem | 9410-OP | |
| Твин 20 | Sigma-Aldrich | P7949 | |
| Название< | strong>Company | Номер в каталоге< | strong>Комментарии |
| Коммерческие буферы и растворы | |||
| BugBuster Master Mix | Nogagen | 71456-4 | |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 1018401 | |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) pH 7,4 (1X) | Life Technoligies | P5493 | |
| Ультрачистая дистиллированная вода | Invitrogen | 10977015 | |
| Название | >Company | Номер в каталоге | Комментарии |
| Стандарты и коммерческие наборы | |||
| Express Autoinduction System 1 | Novagen | 71300-4 | |
| Набор для анализа белка Pierce BCA | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Название | Company | Номер в каталоге | Комментарии |
| Настройка оборудования | |||
| AKTA системы очистки белка FPLC | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Beckman Avanti J-25 Центрифуга | Beckman Coulter | ||
| Beckman ротор JA-25.50 | Beckman Coulter | ||
| Ротор Beckman JA-10 | Beckman Coulter | ||
| Считыватель микропланшетов FLUOstar Omega | BMG Labtech | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Name< | strong>Company< | strong>Номер в каталоге | Комментарии |
| Sofware | |||
| Анализ данных MARS Программное | |||
| GraphPad Prism6 | GraphPad |
Ссылки
- Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion diseases. PLoS Pathog. 2 (3), (2006).
- Wadsworth, J. D., Collinge, J. Update on human prion disease. Biochim Biophys Acta. 1772 (6), 598-609 (2007).
- Prusiner, S. B.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
