Summary
Het doel van dit protocol is te specifiek tag en selectief isoleren viraal DNA van geïnfecteerde cellen voor de karakterisatie van het virale genoom geassocieerde eiwitten.
Abstract
Het doel van dit protocol is te isoleren van herpes simplex virustype 1 (HSV-1) DNA van geïnfecteerde cellen voor de identificatie van geassocieerde virale en cellulaire eiwitten door massaspectrometrie. Hoewel eiwitten die met virale genoom samenwerken belangrijke rol spelen bij de bepaling van het resultaat van een infectie, was een uitgebreide analyse van het virale genoom geassocieerde eiwitten niet eerder mogelijk. Hier tonen we een methode waarmee de directe zuivering van HSV-1 genomen van geïnfecteerde cellen. Repliceren viraal DNA heet selectief met gemodificeerde nucleotiden die een alkyn functionele groep bevatten. Gelabelde DNA is vervolgens specifiek en onherroepelijk gelabeld via de covalente bevestiging van biotine azide via een koper (I)-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie of klik op reactie. Biotine-gelabeld DNA wordt gezuiverd op daar beklede kralen en geassocieerde eiwitten zijn geëlueerd en geïdentificeerd door massaspectrometrie. Deze methode maakt het mogelijk selectief richten en isolatie van HSV-1 replicatie vorken of hele genoom van complexe biologische omgevingen. Aanpassing van deze aanpak zal bovendien zorgen voor het onderzoek van verschillende aspecten van herpesviral infectie, evenals het onderzoek van het genoom van andere DNA-virussen.
Introduction
Virussen hebben een beperkte capaciteit om essentiële functies vervullen en dus afhankelijk van gastheer factoren om kritieke aspecten van infectie met inbegrip van virale genexpressie, replicatie, reparatie, recombinatie en vervoer. De activiteiten van deze host factoren zijn vaak aangevuld met viraal gecodeerde eiwitten. Daarnaast moeten virussen opsporen en interferentie voorkomen door cellulaire reacties op virale infectie. Daarom, virus-gastheer interacties dicteren de uitkomst van de infectie. Van het allergrootste belang is het begrijpen hoe virussen veranderen de cellulaire omgeving aan te passen van de cellulaire machines om virale processen. Van bijzonder belang is het identificeren welke factoren en processen op virale genoom gedurende de besmettelijke cyclus handelen.
Herpes simplex virustype 1 (HSV-1) is dat een double strandde DNA-virus dat een aanzienlijk deel van de menselijke bevolking infecteert. Binnen het eerste uur van infectie treedt het virale genoom de kern, waar een geordende opeenvolging van virale genexpressie ensues in coördinatie met virale replicatie van het DNA (vDNA)1. In de kern, genomes gelden Epigenetische regulatie, reparatie en recombinatie ondergaan en worden verpakt in capsids, zodanig dat de eerste nakomelingen virionen worden geproduceerd binnen minder dan zes uur. De uitgebreide evaluatie van het virale genoom geassocieerde eiwitten in de loop van de infectie zal leggen de basis voor het onderzoek naar de moleculaire details van processen die handelen op virale genoom, en geven inzicht in welke virale en cellulaire factoren zijn betrokken in verschillende stadia van de infectie.
Vorige methoden voor het onderzoek van gastheer factoren die betrokken zijn bij virale infectie zijn affiniteit zuivering van virale eiwitten voor de analyse van de bijbehorende cellulaire eiwitten2,,3,,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. deze testen zijn instrumentale voor de identificatie van cellulaire factoren die betrokken zijn in host antivirale reacties, evenals virale chromatin wijziging, genexpressie, en DNA herstellen. Het is echter moeilijk om na te gaan of interacties afhankelijk zijn van de associatie met vDNA, en proteomics alleen bieden inzicht in interacties die als een functie van een specifieke virale factor plaatsvinden. Chromatine immunoprecipitation (ChIP) is gebruikt om te bepalen waar specifieke virale en cellulaire proteïnen binden aan virale genoom10,11,12,13,14 , 15 en Fluorescente kruising in situ (vissen) gecombineerd met immunocytochemie heeft de visualisatie van cellulaire factoren die colocalize met vDNA16,17,18, 19 , 20. deze gehaltebepalingen toestaan voor ruimtelijke en temporele analyse. Beperkingen bevatten echter de behoefte aan zeer specifieke antilichamen, beperkte gevoeligheid, en de noodzaak voor vorige inzicht in virus-gastheer interacties. Daarom ontwikkelden we een methode gebaseerd op de iPOND (isolatie van proteïnen op ontluikende DNA)21 en aniPOND (versnelde native iPOND)22 te selectief label en te zuiveren van vDNA van geïnfecteerde cellen voor de onbevooroordeelde identificatie van virale genoom geassocieerde eiwitten door massaspectrometrie. iPOND behulpzaam voor het onderzoek van cellulaire replicatie vork dynamiek geweest.
Voor de selectieve zuivering van het virale genoom van geïnfecteerde cellen, met ethynyl bewerkt nucleosiden, 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU) of 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (Figuur 1), gevolgd door covalente repliceren vDNA heet vervoeging aan biotine azide via Klik op chemie om één stap zuivering van het virale genoom en geassocieerde eiwitten op daar beklede kralen (figuur 2B). Bovenal worden infecties uitgevoerd in stationaire cellen, die niet met cellulaire DNA-replicatie bezighouden zich om specifieke etikettering van vDNA. Bovendien, HSV-1 infectie veroorzaakt celcyclus arrestatie en remt cellulaire DNA replicatie23,24. Virus kan worden prelabeled voordat de infectie voor de analyse van eiwitten die zijn gekoppeld aan binnenkomende virale genoom (figuur 1A) of label tijdens de replicatie van DNA voor de analyse van eiwitten die zijn gekoppeld aan nieuw samengestelde vDNA (figuur 1B) 25. Bovendien pulse chase analyse kan worden gebruikt om te onderzoeken van de aard van de eiwitten verbonden met de virale replicatie vorken (Figuur 1 c)26. Daarnaast kan ethynyl gemodificeerde vDNA covalent zijn geconjugeerd met een fluorophore voor ruimtelijke onderzoek van eiwit dynamiek (figuur 2A en Figuur 3). Imaging zorgt voor de directe visualisatie van vDNA is een gratis benadering voor de validatie van vDNA-eiwit interacties en kan worden aangepast aan het virale genoom gedurende infectie bijhouden. Wij verwachten dat deze aanpak verder kunnen worden gewijzigd om te studeren van enig aspect van herpesviral besmetting, met inbegrip van latentie en reactivering, en te bestuderen of andere DNA-virussen. Bovendien, labelen met 5-ethynyl uridine (EU) voor de analyse van het virale genoom RNA kan leiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celcultuur, virale infectie en EdC Labeling ( Figuur 1)
het volgende protocol omvat werken met virussen. Gelieve te verwijzen naar uw instelling ' s bioveiligheid protocollen over veilig omgaan met virussen en andere biologische agentia. Dit protocol is goedgekeurd door de institutionele Review Board van de Universiteit van Pittsburgh.
- Trypsinize een confluente 150 cm 2 weefselkweek kolf met MRC-5 cellen en de cellen overbrengen in een 600 cm 2 weefselkweek plaat met 100 mL DMEM plus 10% FBS. Incubeer bij 37 ° C in de aanwezigheid van 5% CO 2 voor 3-4 dagen te bereiken confluency en stationaire fase. Een confluente 600 cm 2 schotel bevat ~ 7 x 10 7 cellen. Bereiden 1 plaat voor elke voorwaarde en 1 plaat voor elke overeenkomstige negatieve controle.
Opmerking: Cellen moeten het bereiken van de stationaire fase om te remmen cellulaire DNA-replicatie om ervoor te zorgen dat alleen vDNA is gelabeld en gezuiverd in opeenvolgende stappen.
Opmerking: Elk monster vereist een gratis ongelabelde negatieve controle opgesteld op basis van de dezelfde voorwaarden van de infectie en het tijdstip zonder de toevoeging van EdC.
Opmerking: De A verkleinde versie van dit experiment moet worden uitgevoerd in tandem om te testen voor de etikettering van cellulaire DNA door beeldvorming met behulp van vergelijkbare celgroei, infectie, EdC voorwaarden, labelen en tijd punten (zie stap 2). - Verdund 7 x 10 8 PFU HSV-1 in 7 mL koude Tris-Buffered Saline (TBS). Groeimedium verwijderen en opslaan bij 37 ° C. Infecteren, de 7-mL verdunde virus op MRC-5 cellen toevoegen en rock gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Volgende adsorptie, verwijderen van entmateriaal, spoelen met 50 mL kamertemperatuur TBS en vervangen de originele groeimedium. Incubeer bij 37 ° C in de aanwezigheid van 5% CO 2. Deze stap moet worden uitgevoerd voor elke experimentele conditie en negatieve controle.
Opmerking: Verhoogde EdC labeling kan worden bereikt met HSV-1 mutanten met gebreken voor de uitdrukking van de virale dUTPase (UL50-gen) en/of uracil glycosylase (UL2-gen). HSV-1 dUTPase heeft lage substraat specificiteit en kan verminderen de activering van verschillende nucleoside analogen 25 , 27. - Label virale genoom met EdC. Volg de aanwijzingen om inkomende genoom (1.3.1.), repliceren genoom (1.3.2.), of virale replicatie vorken (1.3.3.) van een label.
Opmerking: De enige stap 1.3.1, 1.3.2 en 1.3.3 moet worden uitgevoerd afhankelijk van of binnenkomende genoom, gerepliceerde genoom of replicatie vorken moeten worden geanalyseerd in opeenvolgende stappen, respectievelijk.
Opmerking: EdU of f-ara EdU kan worden vervangen voor EdC. De toxiciteit van nucleoside-analogen moet worden gecontroleerd en worden geminimaliseerd.- Gebruik prelabeled bestanden uit infectie in stap 1.2 te voeren en gaat u verder met stap 2 of 3 binnen 4 uur na infectie (hpi) om te onderzoeken niet-gerepliceerde vDNA ( figuur 1A).
Opmerking: Bereiden prelabeled virus bestanden met behulp van de eerder beschreven protocol 25. Virusvoorraden moeten worden doorgegeven door middel van een G-25 kolom te verwijderen van alle resterende EdC. - Label replicerende vDNA door toevoeging van 5-25 µM EdC aan het kweekmedium cel van geïnfecteerde cellen voor 2-4 h ( figuur 1B). Voordat u toevoegt, Verdun EdC in 1 mL groeimedium.
- Op het etiket van virale replicatie vorken, na het begin van de replicatie van de vDNA (≥ 4 hpi), pulse label repliceren vDNA met 5-25 µM EdC voor 5-20 min. Om te jagen, 3 x spoelen met chase medium met 25-100 µM 2´deoxycytidine (deoxyC), en vervolgens in aanwezigheid van chase medium voor een extra 20-40 min ( Figuur 1 c) incuberen.
Opmerking: Pulse en chase medium tot 37 ° C en 5% CO 2 vóór gebruik moet worden geëquilibreerd.
Opmerking: Voor puls chase experimenten, het is belangrijk om te overwegen de hoeveelheid tijd die nodig is voor nucleosiden in te voeren van de cel en worden phosphorylated voordat ze kunnen worden opgenomen in het repliceren van DNA. Dit moet worden bepaald empirisch.
Opmerking: Om te bepalen van de resolutie van pulse chase experimenten, bereken het percentage van de virale replicatie onder de experimentele omstandigheden gebruikt. Dit kan worden bepaald door de kwantitatieve PCR van het virale genoom tijdens een enkele stap groei tijd cursus 26.
Opmerking: Voor het virale genoom imaging gaat u verder met stap 2 en voor de zuivering van het virale genoom gaat u verder met stap 3.
- Gebruik prelabeled bestanden uit infectie in stap 1.2 te voeren en gaat u verder met stap 2 of 3 binnen 4 uur na infectie (hpi) om te onderzoeken niet-gerepliceerde vDNA ( figuur 1A).
2. Beeldvorming van EdC label DNA ( figuur 2A)
Opmerking: het is handig om uit te voeren imaging in tandem met de virale genoom zuivering methode om te verifiëren dat cellulaire DNA is niet het label in experimenten. Beeldvorming kan ook worden gebruikt om te visualiseren van de aard van gelabelde vDNA en om proteomics gegevens te valideren. Voorbeelden van cellulaire en virale DNA kleuring patronen zijn afgebeeld in Figuur 3.
- Verrichten van infecties en EdC labeling zoals aangegeven in stap 1 behalve gebruik geschaald voorwaarden op coverslips in een 12-well weefselkweek schotel met 1 mL groeimedium.
- Fix cellen met 1 mL 3,7% paraformaldehyde in 1 x PBS gedurende 15 minuten op RT. Na fixatie, cellen spoelen 2 x met 1 mL 3% BSA in PBS.
Let op: Paraformaldehyde kan ernstige of blijvende schade veroorzaken. Volg veiligheid voorzorgsmaatregelen.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken en coverslips kan worden achtergelaten bij 4 ° C in de tweede wasbeurt maximaal 3 dagen. - Permeabilize cellen met 1 mL permeabilization buffer [Zie Tabel of Materials] gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur tijdens het rocken.
- Spoel met 1 mL 3% BSA en vervolgens blok met 1 mL 3% BSA in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur tijdens het rocken.
- , Voeg 1 mL van de klik reactie cocktail [Zie Tabel of Materials] aan coverslips aan covalent conjugaat Alexa Fluor 488 azide aan EdC label DNA. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten terwijl het schommelen. Gecombineerd en spoel tweemaal met 1 mL PBS.
- Vlek cellulaire DNA met 1 mL van een verdunning van de 1:2,000 van Hoechst in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur tijdens het rocken. Gecombineerd en spoel tweemaal met 1 mL PBS.
- Vlek met primaire en secundaire antilichamen volgens norm indirecte immunofluorescentietest protocollen 25.
Opmerking: Gelabelde vDNA colocalizes met ICP8, ICP4 of UL42 en label cellulaire DNA colocalizes met Hoechst vlek. - Mount coverslips in dia's en afbeeldingen van cellen met behulp van een fluorescentie Microscoop.
Opmerking: Dia's kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voor verscheidene weken.
3. Zuivering van vDNA en geassocieerde eiwitten
Opmerking: verschillende aspecten van dit protocol zijn aangepast vanaf Leung et al. 22
Opmerking: alle buffers en reagentia moeten worden gekoeld op ijs vóór gebruik en alle stappen moeten worden uitgevoerd op ijs behoudens andersluidende.
- Oogst kernen.
Opmerking: Voor isolatie van kernen, formaldehyde kan worden gebruikt voor dwarslijn eiwitten aan DNA. Strengere voorwaarden voor wassen kunnen vervolgens worden gebruikt tijdens het zuiveringsproces ongehinderd de DNA op daar beklede kralen. Voor crosslinking en wastafel voorwaarden zie Sirbu et al. 21.- groeimedium vervangen door 20 mL kernen extractie Buffer (NEB) en incubeer gedurende 20 min bij 4 ° C met occasionele rockende. Kernen zal zichtbaar zijn in de Microscoop.
- Kernen van de plaat met behulp van een cel schraper Schraap en transfer naar een conische tube van 50 mL. Centrifugeer gedurende 10 min bij 2.500 x g bij 4 ° C tot pellet kernen, verwijder het supernatant.
Opmerking: Trypan blauw kleuring kan worden gebruikt om te controleren of het isolement van de kernen van cellen. - Voorzichtig verjagen de nucleaire pellet in 10 mL PBS, overdracht naar een conische buis 15 mL, and -pellet door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 2.500 x g bij 4 ° C. volledig verwijderen PBS.
Opmerking: Kernen kunnen worden bevroren en het protocol op dit punt kan worden onderbroken. Om dit te doen, zachtjes resuspendeer de pellet van nucleaire in 500 µL bevriezing buffer en de buis in een ijsbad ethanol/droog uit te broeden. Opslaan van de kernen van de bevroren bij-80 ° C. Vóór gebruik, kernen op kamertemperatuur ontdooien en snel overbrengen van ijs en voeg 10 mL PBS, rock voorzichtig te mengen, pellet door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 2.500 x g bij 4 ° C, PBS volledig te verwijderen. Bevriezing van de kernen kan leiden tot verminderde opbrengst.
- Covalent geconjugeerde Biotine-azide aan EdC label vDNA.
- Resuspendeer de nucleaire pellet in 10 mL Klik reactie Meng [Zie Tabel of Materials] door zachtjes op en neer pipetteren 5 keer met een pipet 10 mL.
Opmerking: Het is belangrijk dat de reagentia opgenomen in de klik reactie mix worden toegevoegd in de aangegeven volgorde. - Draaien gedurende 1 uur bij 4 ° C. Terwijl het draaien van bereiden en chill Buffers B1, B2 en B3 [Zie Tabel of Materials].
- Pellet kernen door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 2.500 x g bij 4 ° C. volledig verwijderen Klik op reactie mix en wassen van de pellet door zachtjes resuspending in 10 mL PBS en centrifugeren voor 10 min bij 2.500 x g bij 4 ° C.
- Voorzichtig resuspendeer de nucleaire pellet in 1 mL PBS en overdracht aan een 1,5 mL microfuge buis met behulp van een grote boring pipette uiteinde. Pellet kernen door centrifugeren voor 10 min op 2.500 x g bij 4 ° C. volledig verwijderen PBS en flash bevriezing in vloeibare stikstof.
Opmerking: Het protocol op dit punt kan worden onderbroken en bevroren kernen kunnen worden achtergelaten bij-80 ° C. Freeze dooi helpt met latere lysis, dus het is aangeraden dat de kernen worden flash bevroren zelfs wanneer u stap 3.3 op dezelfde dag.
- Resuspendeer de nucleaire pellet in 10 mL Klik reactie Meng [Zie Tabel of Materials] door zachtjes op en neer pipetteren 5 keer met een pipet 10 mL.
- Lyse kernen en fragment van DNA.
- Kernen op ijs ontdooien en resuspendeer in 500 µL Buffer B1 door pipetteren omhoog en omlaag. Incubeer op ijs voor 45 min.
- Sonicate monsters 6 keer voor 30 s, elke bij 40% amplitude met behulp van een 3 mm microtip sonde. Leg monsters op ijs voor 30 s tussen pulsen. Na ultrasoonapparaat, moeten de monsters verschijnen duidelijk, niet bewolkt.
Opmerking: Ultrasoonapparaat voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd voor individuele sonicators. Voor gedetailleerde instructies over hoe te optimaliseren ultrasoonapparaat voorwaarden verwijzen naar Leung et al. 22. - pellet cel puin door centrifugatie bij 14.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. De grootte van de pellet moet aanzienlijk afnemen. De bovendrijvende vloeistof filteren door 100 µM cel zeef en behouden van de stroom door.
- Voeg toe 500 µL Buffer B2 naar de gefilterde supernatant. 900 µL van dit voorbeeld zal worden gebruikt in stap 3.4.2.
- Nemen een aliquoot gedeelte van elke voorwaarde voor DNA isolatie (50 µL of 1/20e volume) en voeg 50 µL 2 x SDS-bicarb oplossing [Zie Tabel of Materials]. Gaat u verder met het DNA isolatie protocol (stap 3.6).
- Nemen een aliquoot gedeelte van elke voorwaarde voor input eiwit (50 µL of 1/20e volume) en voeg 50 µL 2 x Laemmli monster buffer, bevriezen in vloeibare stikstof en opslaan bij -80 ° C. gebruik in stap 3.5.6.
- Bind biotinyleerd DNA aan daar gecoat kralen.
- Bereiden daar T1 magnetische kralen door 300 µL van kraal drijfmest te brengen naar een 1,5 mL microfuge buis. Één buis van kralen per monster te bereiden. Wash kralen 3 x met 1 mL Buffer B2 door vortexing aan resuspendeer, een magneet om te scheiden van de parels toe te passen en het was buffer aspirating.
Opmerking: Geoptimaliseerd bindende voorwaarden resultaat in gemaximaliseerd rendement en bindende minimale achtergrond. Het was experimenteel bepaald dat streptavidine T1 magnetische kralen een aanzienlijk grotere bindingscapaciteit dan agarose kralen, evenals andere daar kralen, en hebben minder achtergrond bindend dan streptavidine C1 kralen ( figuur 4A ). - Toevoegen 900 µL van monster uit stap 3.3.4. aan de gewassen kralen en draaien 's nachts bij 4 ° C.
Opmerking: Niet vortex kralen doen zodra het monster is toegevoegd aan hen.
Opmerking: Als significante hoeveelheden DNA of eiwit in de labelloze negatieve controle worden geïsoleerd, deze stap kan worden teruggebracht van overnachting tot 4 h te verminderen achtergrond bindende.
- Bereiden daar T1 magnetische kralen door 300 µL van kraal drijfmest te brengen naar een 1,5 mL microfuge buis. Één buis van kralen per monster te bereiden. Wash kralen 3 x met 1 mL Buffer B2 door vortexing aan resuspendeer, een magneet om te scheiden van de parels toe te passen en het was buffer aspirating.
- Wassen van kralen en elueer vDNA en bijbehorende eiwitten.
Opmerking: Het is aanbevolen om het filter tips gebruiken voor de resterende stappen.- Plaats monsters in een magnetische microfuge buis rack, verwijderen supernatant, zachtjes resuspendeer in 1 mL Buffer B2, draaien bij 4 ° C gedurende 5 minuten
- Herhaal stap 3.5.1 driemaal.
- Leg de monsters in een magnetische microfuge buis rack, bovendrijvende vloeistof verwijderen, voorzichtig resuspendeer in 1 mL Buffer B3, en bij 4 ° C gedurende 5 min. draaien
- Transfer 100 µL kraal mengsel (1/10 th volume) aan een nieuwe buis voor afhankelijke DNA isolatie. Deze buis van toepassing op de magneet, bovendrijvende vloeistof verwijderen, resuspendeer kralen in 100 µL 1 x SDS-bicarb oplossing en gaat u verder met het DNA isolatie protocol (stap 3.6).
- Toepassing van de buis met de resterende 900 µL kraal mengsel uit stap 3.5.3. aan de magneet, verwijder supernatant en resuspendeer kralen in 50 µL 2 x Laemmli monster buffer Elueer eiwitten en DNA-eiwitcomplexen.
- Kook monsters bij 95 ° C gedurende 15 min, vortex, snel draaien in de microfuge, en toepassen van de magneet. Eluaat overbrengen in een nieuwe buis, flash bevriezen en winkel op -80 ° C.
Opmerking: Gebruik GLB sloten om ervoor te zorgen dat de buizen niet doen pop openen terwijl kokend.
Opmerking: Het protocol kan op dit moment worden gepauzeerd en monsters kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C voor verscheidene weken. - EiwitSteekproeven analyseren door Coomassie Blue kleuring, westelijke bevlekken of Spectrometrie van de massa door standaardprocedures 25. Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 4 en Figuur 5.
Opmerking: Om te bepalen als eiwit opbrengst voldoende voor massaspectrometrie is, 7,5 µL van elk monster wordt gebruikt voor analyse door Coomassie Blue kleuring en 7,5 µL voor het westelijke bevlekken van een representatieve virale genoom geassocieerde eiwit (ICP4, ICP8 of UL42). Dezelfde hoeveelheid lysates uit stap 3.3.6. besturingselement voor invoer eiwitniveaus worden naast uitgevoerd. Het resterende monster (35 µL) wordt vervolgens geanalyseerd door massa spectrometrie zoals eerder beschreven 25.
- DNA isolatie
- broeden de monsters uit stappen 3.3.5. en 3.5.4. bij 65 ° C gedurende 4-16 h. verwijderen proeven van magnetische kralen, zonodig.
- Pak monsters met 150 µL fenol: chloroform: Isoamylalcohol (PCI) en de waterfase overbrengen in een nieuwe buis.
- Extract van de resterende PCI met 100 µL Tris-EDTA (TE) en de waterfase toevoegen aan een nieuwe buis.
- Extract monsters met 200 µL chloroform: Isoamylalcohol (24:1).
- Zuiveren de waterige fase met behulp van de PCR zuivering Kit volgens de fabrikant ' s-protocol.
Opmerking: De pH-indicator in de Buffer PB kom paarse wanneer toegevoegd aan het monster. Voeg 10 & #181; L 3M NaOAc pH 5.0 te verlagen de pH van het monster. - DNA bepalen concentratie met behulp van een fluorescentiespectroscopie.
Opmerking: Dit protocol levert meestal 100-400 ng kraal-gebonden DNA. Geen DNA moet worden gedetecteerd in het eluaat van de negatieve controle waarin EdC niet werd toegevoegd in stap 1.3. - DNA kan worden opgeslagen in een lage DNA-bindende tube op 4 of -20 ° C en kan worden gebruikt voor PCR in real time of hoge doorvoer sequencing analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het gebruik van klik chemie voor de zuivering van DNA uit cellen werd eerst bereikt door de methode iPOND21. Het doel van iPOND is om te zuiveren van cellulaire replicatie vorken voor de identificatie van geassocieerde eiwitten. Wij hebben deze techniek te studeren specifiek vDNA eiwitinteractie tijdens infectie aangepast. Manipulatie van de aanpak van label virale genoom met EdC (Figuur 1), gecombineerd met gesynchroniseerde infecties, heeft toegestaan voor de selectieve isolatie en het onderzoek van afzonderlijke populaties van vDNA. DNA van de HSV-1 heet met EdC (Figuur 1) ter vergemakkelijking van de covalente gehechtheid aan een fluorophore voor imaging of Biotine voor zuivering (Figuur 2). Virus kan worden prelabeled voordat de infectie voor de analyse van eiwitten binnenkomende genoom (figuur 1A) zijn gekoppeld of label tijdens de replicatie van DNA voor de analyse van eiwitten die zijn gekoppeld aan nieuw samengestelde vDNA (figuur 1B)25. Bovendien, pulse chase analyse kan worden gebruikt om te onderzoeken van de aard van de eiwitten verbonden met de virale replicatie vorken (Figuur 1 c)26. DNA kan worden gevisualiseerd binnen cellen ruimtelijke om informatie te verstrekken over de aard van de gelabelde DNA en steun voor geïdentificeerde vDNA-eiwitinteractie (Figuur 3). Samen genomen, de protocollen die hier beschreven staan toe dat het proteoom onderzoek van meerdere aspecten van productieve infectie inzicht geven in dynamische veranderingen die zich voordoen op de HSV-1 genomen. Deze benaderingen kunnen verder worden aangepast om te onderzoeken latentie en reactivering, fenotypes verbonden met de virale mutanten te bestuderen en te bestuderen van andere DNA en RNA virussen.
Aspecten van dit eiwit zuivering methode werden aangepast vanaf Leung et al. 22. hier een belangrijke verbetering voor de zuivering van EdC label DNA is het gebruik van streptavidine T1 kralen in plaats van daar beklede agarose kralen. Voor het optimaliseren van DNA zuivering, werden verschillende soorten kralen daar beklede getest voor niet-specifieke binding wanneer infectie werd uitgevoerd in de afwezigheid van EdC en voor maximale eiwit herstel in aanwezigheid van EdC (figuur 4A). Voor deze experimenten, werd westelijke bevlekken uitgevoerd voor de vDNA-bindend-proteïne ICP4. Zuivering uitgevoerd op streptavidine T1 kralen in de minste hoeveelheid van de binding van de achtergrond in de afwezigheid van EdC en het herstel van de maximale eiwit in aanwezigheid van EdC resulteerde.
Eiwitten vDNA gekoppeld kunnen worden geïdentificeerd door proteomic methoden, met inbegrip van het westelijke bevlekken en massaspectrometrie. Westelijke bevlekken kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de dynamiek van bekende interacties en massaspectrometrie kan worden gebruikt als een onbevooroordeelde benadering voor het identificeren van roman vDNA geassocieerde eiwitten. Een voorbeeld van eiwit opbrengst als een functie van toenemende EdC labeling is weergegeven in figuur 4B. Een uitstrijkje, in plaats van een duidelijke verbanden patroon, wordt meestal waargenomen door Coomassie Blue kleuring. Dit is waarschijnlijk omdat er DNA aanwezig in het monster eiwit of omdat er een overvloed aan eiwit. Het is ook belangrijk op te merken dat de koper katalysator gebruikt in de reactie van de klik gedeeltelijke afbraak van eiwitten en nucleïnezuren28,29kan veroorzaken. Door het westelijke bevlekken, worden vergelijkbare niveaus van ICP4 meestal aangetroffen in eluaten (stap 3.5.5.) na zuivering van vDNA die was gelabeld voor 60 min met EdC als dat aanwezig is in dezelfde hoeveelheid input monster bereid uit nucleaire lystates (stap 3.3.6.). Deze informatie kan worden gebruikt als een gids om te bepalen of herstel voldoende voor het verzenden van de resterende massaspectrometrische analysemateriaal.
Nano vloeistofchromatografie met tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) kan worden uitgevoerd, zoals eerder beschreven25 ter identificatie van eiwitten gezuiverde vDNA is gekoppeld. LC-MS/MS gegevens worden geanalyseerd door het vergelijken van waarden van de spectrale tellen (SpC) tussen het EdC-geëtiketteerden experimentele monster en de bijbehorende labelloze negatieve controle. Eiwitten worden geacht te worden verrijkt met het experimentele monster gebaseerd op de volgende criteria: 1) eiwit heeft ten minste 5 spectrale graven (SpC) in het experimentele monster, 2) eiwit wordt niet gedetecteerd in het besturingselement of is verrijkt over de controle door ten minste viervoudig gebaseerd op het verdelen van de SpC waarden, en 3) de proteïne is verrijkt over de controle in twee of meer biologische wordt gerepliceerd. De genormaliseerde spectrale overvloed factor (NSAF: 
) kan worden gebruikt om de rekening voor de verschillen in molecuulgewicht (MW) en totaal eiwit opbrengst. Deze vergelijking bepaalt de relatieve overvloed aan afzonderlijke proteïnen binnen een monster en voorziet in een directe vergelijking van twee verschillende experimentele omstandigheden waarin verschillende hoeveelheden vDNA worden gezuiverd (bijvoorbeeld input virale genoom (vergelijken Figuur 1A) gerepliceerd genoom (figuur 1B)).
Er zijn meerdere manieren om eiwit verrijking gegevens te presenteren. Enkele voorbeelden zijn cirkeldiagrammen, Venn-diagrammen en eiwit-interactienetwerken. Cirkeldiagrammen kan worden gebruikt ter illustratie van het aandeel van eiwitten die zijn geïdentificeerd en waarvan bekend is dat het functioneren in een specifieke biologisch proces (figuur 5A). Echter, kunnen problemen optreden wanneer één eiwit heeft meer dan één biologische functie, die vaak het geval is. Het is ook moeilijk om gegevens te vergelijken in verschillende cirkeldiagrammen. Venn-diagrammen zijn handig om aan te tonen van de relaties tussen eiwitten geïdentificeerd onder verschillende experimentele omstandigheden, maar bieden geen functionele informatie over de eiwitten geïdentificeerd (figuur 5B). Eiwit-interactienetwerken portretteren een visuele illustratie van mogelijke interacties tussen geïdentificeerde eiwitten en informatie verstrekken over de soorten biologische processen die zijn betrokken (figuur 5C). Verschillende online bronnen zijn beschikbaar voor het toewijzen van de voorspelde eiwit-eiwitinteractie met inbegrip van de tekenreeks (Search Tool voor het ophalen van de interactie genen/eiwitten)30. Online hulpmiddelen zijn over het algemeen uitgerust om verwerken van proteomics gegevens uit een verscheidenheid van soorten en waardevolle informatie verstrekken over host eiwitten die betrokken zijn in de mechanica van het virale genoom. Virale eiwitten zijn echter meestal niet in databases, die analyse compliceren kunnen opgenomen. Daarom is het belangrijk om te overwegen de belangrijkste conclusies die men overbrengen willen zou wanneer besloten wordt hoe om proteomics gegevens te presenteren.
Figuur 1:Ong > Approaches to label DNA van de HSV-1. (A) voor de gehaltebepaling van de staat van inkomende virus, rusten MRC-5 cellen in G0 zijn geïnfecteerd met HSV-1 prelabeled en genomen zijn vehiculumcontrolegroep op minder dan 4 hpi te studeren niet-gerepliceerde viraal DNA. (B) voor de gehaltebepaling van de Braziliaanse deelstaat gerepliceerd virus, MRC-5 cellen zijn besmet met labelloze HSV-1 en EdC (oranje sterren) is toegevoegd aan het groeimedium van geïnfecteerde cellen en uitgebroed voor 2-4 uur na het begin van virale DNA-replicatie (≥4 hpi). (C) te assay virale replicatie vorken, geïnfecteerde cellen zijn pols aangeduid met EdC voor 5-20 min. replicatie vorken kunnen vervolgens worden achtervolgd met deoxyC. EdC label DNA is oranje. Dit cijfer is gewijzigd van Dembowski en DeLuca25. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Procedures in dit artikel wordt beschreven voor analyse van het EdC label DNA. (A) een overzicht van de methode voor imaging EdC label DNA. Tagged DNA is vertegenwoordigd in het groen. (B) een overzicht van de methode voor de zuivering en downstream analyse van EdC label vDNA. Dit cijfer is gewijzigd van Dembowski en DeLuca25. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Visualisatie van EdC label DNA. Cellen waren besmet, label en beeld zoals beschreven in Figuur 1 en Figuur 2. Representatieve beelden van gelabelde cellulaire en virale DNA worden weergegeven. Cellulaire DNA colocalizes met Hoechst vlek en vDNA met ICP4. Schaal bar: 5 µm.This cijfer werd vanaf Dembowski en DeLuca25 en Dembowski et al. gewijzigd 26. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Representatief eiwit zuivering resultaten. (A) vergelijking van eiwit opbrengst wanneer zuivering stappen werden uitgevoerd met behulp van verschillende soorten daar gecoat kralen. Infectie werd uitgevoerd in het bijzijn van EdC (+) om te vergelijken eiwit opbrengst of bij gebreke van EdC (-) te vergelijken achtergrond bindend. Infecties en labelen van EdC werden uitgevoerd zoals beschreven in figuur 1B en DNA-eiwitcomplexen werden gezuiverd volgens de stappen in figuur 2B vergelijkbare hoeveelheden van verschillende soorten daar gecoat kralen gebruikt. BOVENPANEEL: vergelijking van eiwit opbrengst na zuivering op daar agarose kralen of daar M-280 gestreken. Onderste paneel: vergelijking van eiwit opbrengst na zuivering op streptavidine M-270, M-280, streptavidine-C1 of streptavidine T1. Westelijke bevlekken werd uitgevoerd met een antilichaam tegen de virale eiwitten ICP4. Gezuiverde ICP4 wordt weergegeven in de eerste baan voor vergelijking. Langere blootstelling van het onderste paneel moest waarnemen van een soortgelijke intensiteit van ICP4 in rijstroken "280" zoals in het bovenste deelvenster. (B) vertegenwoordiger eiwit zuivering resultaten als een functie van de tijd van EdC labeling worden weergegeven. Infecties en labelen van EdC werden uitgevoerd zoals beschreven in figuur 1B en DNA-eiwitcomplexen werden gezuiverd volgens de stappen in figuur 2B met behulp van streptavidine T1 kralen. EdC labeling werd uitgevoerd voor 0, 20, 40 of 60 min en Coomassie Blue kleuring (boven) en westelijke bevlekkende (onder) resultaten worden weergegeven. Westelijke bevlekken werd uitgevoerd met antilichamen specifiek voor ICP4, UL42 of GAPDH. Het eluaat steekproef werd genomen uit stap 3.5.5. en lysate uit stap 3.3.6. De pijl geeft daar, terwijl L eiwit ladder aangeeft. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Voorbeelden van verschillende manieren om te presenteren van de gegevens van proteomics. (A) cirkeldiagrammen samenvatten eiwitten die werden geïdentificeerd door de Spectrometrie van de massa van het eiwit eluaten virale genoom gezuiverd op 6 hpi is gekoppeld. Waarden geven het aantal eiwitten voor elke functionele categorie geïdentificeerd. T geeft het totale aantal eiwitten geïdentificeerd. Kleuren geven aan de volgende categorieën: transcriptie - RNA verwerking, rood -, groen - paarse chromatine remodeling, oranje - gele, DNA-replicatie - nucleair vervoer, teal - cytoskelet, donkerblauw - HSV structurele proteïnen en gray - andere/onbekend. (B) Venn-diagrammen verbeelden de overlapping van eiwitten geïdentificeerd moeten worden gekoppeld aan virale genoom bij 6, 8 of 12 hpi. (C) A STRING kaart beeldt eiwitten verrijkt op virale replicatie vorken na een 5 min EdC puls. Menselijke eiwitten verrijkt door 5-voudig t.o.v. de labelloze negatieve controle staan in de functionele interactie kaart, die werd gegenereerd met behulp van STRING30 met instellingen voor gegevens weer te geven alleen hoge vertrouwen interacties. Gene namen werden gebruikt om de kaart van interacties. Cirkels geven eiwitten die functie in de dezelfde biologisch proces. Dit cijfer werd vanaf Dembowski en DeLuca25 en Dembowski et al. gewijzigd 26. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol omvat meerdere stappen die, indien niet zorgvuldig gevolgd in aanzienlijk verlaagd eiwit opbrengst of verontreiniging met cellulaire DNA resulteren kunnen. Het is essentieel dat de stationaire cellen om ervoor te zorgen dat de cellulaire DNA niet is gelabeld en gezuiverd voor alle experimenten worden gebruikt. Dit kan worden bevestigd door het ontbreken van cellulaire DNA-polymerase in de eiwitSteekproef omdat HSV-1 geen gebruik van cellulaire DNA-polymerase voor genoom-synthese. Tijdens EdC labeling en kernen oogsten stappen, moeten de monsters worden gespreid om ervoor te zorgen dat elk even wordt verwerkt. Tijdens reiniging stappen, moet worden gezorgd om nog maar niet te manipuleren kernen door teveel pipetteren. Dit kan leiden tot voortijdige lysis van kernen, evenals monster verlies als gevolg van vasthouden aan de zijkanten van de uiteinden van de pipet. Bovendien, de ultrasoonapparaat stap moet worden geoptimaliseerd voor individuele sonicators en de hoeveelheid daar beklede kralen gebruikt voor Biotine bindend moet worden getitreerd voor optimale eiwit opbrengst.
Verschillende wijzigingen kunnen worden aangebracht in dit protocol en omvatten het gebruik van verschillende virussen of celtypes of de toevoeging van een stap naar de dwarslijn eiwitten aan DNA. Bij het kiezen van een celtype voor proteoom onderzoek te gebruiken, is het belangrijk om te controleren op de beschikbaarheid van een eiwit sequentie database voor die soort. Een gebrek aan middelen van proteomics zal downstream analyse van eiwit gegevens aanzienlijk kunnen beperken. Een andere beperking is de behoefte aan een groot aantal cellen, dus het kan moeilijk zijn om genoeg primaire cellen, zoals neuronen, voorbereiden op dit experiment. Deze methode moet verenigbaar zijn met andere DNA of RNA virussen zijn, zolang de virale infectie is niet afhankelijk van de cellulaire DNA-replicatie. Bovendien zou het interessant zijn om te verkennen van de veranderingen in DNA-eiwit interacties die in HSV-1 mutanten plaatsvinden. Een andere wijziging van dit protocol, zou de toevoeging van een formaldehyde crosslinking stap voor isolatie van kernen, die in strengere wassen voorwaarden tijdens zuivering21 voorzien zou. De toevoeging van formaldehyde zal niet van invloed op de mogelijkheid om te oogsten kernen maar kan leiden tot verminderde eiwit opbrengst vanwege het moeilijk het omkeren van crosslinks tijdens eiwit elutie.
Resultaten van dit protocol vertegenwoordigen de gemiddelde stand van viraal DNA onderzocht. Het is daarom moeilijk om te onderscheiden als complexen samen op de dezelfde of afzonderlijke DNA-moleculen zijn. vDNA labeling van methoden die hier worden beschreven in combinatie met hoge resolutie beeldvorming kan worden gebruikt om te controleren of gegevens van proteomics en kan helpen onderscheid maken tussen verschillende populaties van gelabelde DNA in een cel. ChIP-seq kan bovendien worden gebruikt als een follow-up methode waarin de specifieke locaties en eiwitten op het virale genoom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij erkennen Hannah Fox voor hulp bij de voorbereiding van dit manuscript. Dit werk werd gesteund door de NIH R01AI030612 verlenen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
| 600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 stock | Stocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best | ||
| Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| 2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| Nuclear Extraction Buffer (NEB) | Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
| Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
| (+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
| Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
| Click Reaction Mix | Prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
| Freezing buffer | Prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
| Buffer B1 | Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B2 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B3 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
| 2x Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
| Cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
| Standard western blotting reagents | |||
| NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | Prepare 3% in 1x PBS |
| Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
| Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | Prepare according to manufactorer's protocol |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
| Mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
| chloroform:isoamyl alcohol | Mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
| 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| 3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
| Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
| Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Heat blocks | 65 °C and 95 °C |
References
- Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields virology. , 6th, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health. (2013).
- Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
- Wagner, L. M., DeLuca, N. A. Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription. PloS One. 8, e78242 (2013).
- Taylor, T. J., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8. J Virol. 78, 5856-5866 (2004).
- Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors. Virology. 330, 487-492 (2004).
- Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology. Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).
- Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0. J Virol. 89, 220-229 (2015).
- Suk, H., Knipe, D. M. Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells. Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).
- Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex. J Virol. 84, 12504-12514 (2010).
- Sampath, P., Deluca, N. A. Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells. J Virol. 82, 2339-2349 (2008).
- Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities. J Virol. 80, 2358-2368 (2006).
- Cliffe, A. R., Knipe, D. M. Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection. J Virol. 82, 12030-12038 (2008).
- Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection. J Virol. 78, 9689-9696 (2004).
- Kent, J. R., et al. During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription. J Virol. 78, 10178-10186 (2004).
- Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. J Virol. 82, 3530-3537 (2008).
- Catez, F., et al. HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons. PLoS Pathog. 8, e1002852 (2012).
- Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J Virol. 81, 10991-11004 (2007).
- Tang, Q., et al. Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10. J Virol. 77, 5821-5828 (2003).
- Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).
- Maroui, M. A., et al. Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment. PLoS Pathog. 12, e1005834 (2016).
- Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA. Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).
- Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions. BioTechniques. 55, 204-206 (2013).
- Hobbs, W. E. 2nd, DeLuca, N. A. Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0. J Virol. 73, 8245-8255 (1999).
- Lomonte, P., Everett, R. D. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle. J Virol. 73, 9456-9467 (1999).
- Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes. PLoS Pathog. 11, e1004939 (2015).
- Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes. PLoS Pathog. 13, e1006166 (2017).
- Bjornberg, O., Nyman, P. O. The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme. J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).
- Chiou, S. H. DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex. J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).
- Kennedy, D. C., et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions. J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).
- Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).
