Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Omfattende protokoll for å prøve og prosessen benmarg for å måle målbare gjenværende sykdom og Leukemic stamceller i akutt myelogen leukemi

Published: March 5, 2018 doi: 10.3791/56386
Automatic Translation
*1,2, *3, 1, 1, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2,4, 1, 3, 1
1Department of Hematology, VU University Medical Center, 2Pediatric Oncology/Hematology, VU University Medical Center, 3Janssen Research & Development, LLC, 4Princess Máxima Center for Pediatric Oncology
* These authors contributed equally

Summary

Oppdagelsen av minimal eller målbare gjenværende sykdom (MRD) er en viktig prognostiske biomarkør for raffinering risikovurdering og forutsi tilbakefall i akutt myelogen leukemi (AML). Disse omfattende retningslinjer og anbefalinger med beste praksis for konsekvent og nøyaktig identifikasjon og påvisning av MRD, kan hjelpe i å gjøre effektiv AML behandlingen avgjørelser.

Abstract

Svar vilkår i akutt myelogen leukemi (AML) har nylig blitt re-etablert, med morfologiske undersøkelse benyttes for å fastslå om pasienter har oppnådd fullstendig forlatelse (CR). Omtrent vil halvparten av de voksne pasientene som angitt CR tilbakefall innen 12 måneder på grunn av resultatet av gjenværende AML cellene i benmargen. Kvantifisering av disse gjenværende leukemi celler, kalles minimal eller målbare gjenværende sykdom (MRD), kan være en robust biomarkør for prediksjon av disse relapses. Videre har retrospektiv av flere studier vist at tilstedeværelsen av MRD i benmargen av AML pasienter korrelerer med dårlig overlevelse. Ikke bare er leukemic befolkningen, reflektert av cellene skjuler en leukemi forbundet immun-fenotypen (LAIP), tilknyttet kliniske utfallet, men så er de umodne lavfrekvente subpopulasjon av leukemi stamceller (Lexmarks Løsningssenter), begge kan være overvåkes gjennom flowcytometri MRD eller MRD-lignende tilnærminger. Tilgjengeligheten av sensitive analyser at påvisning av gjenværende leukemi (stem) celler på grunnlag av sykdom-spesifikke eller sykdomsassosierte funksjoner (unormal molekylære markører eller avvikende immunophenotypes) har drastisk forbedret MRD vurdering i AML. Men bør gitt den iboende heterogenitet og kompleksiteten i AML som en sykdom, metoder for prøvetaking benmargen og MRD og Lexmarks Løsningssenter analyse være harmoniserte når mulig. I dette manuskriptet beskriver vi en detaljert metodikk for tilstrekkelig benmarg leveringstanken prøvetaking, transport, prøve behandling for optimal multi-farge flyt cytometri vurdering og gating strategier for å vurdere MRD og Lexmarks Løsningssenter for å hjelpe i terapeutisk beslutningsprosesser for AML pasienter.

Introduction

Akutt myelogen leukemi (AML) er en malignancy av benmargen preget av feil i modning programmet, med unormal spredning og akkumulering av myeloid progenitor celler, hemming av vanlige hematopoiesis, og til slutt benmarg feil . Sykdommen er svært heterogen forhold til morfologi, immunophenotype, cytogenetics, molekylær avvik og genuttrykk signaturer og behandlingsrespons og behandlingen utfallet1,2. Nåværende ledelsen inkluderer induksjon kjemoterapi med sikte på å oppnå komplett forlatelse (CR), etterfulgt av etter remission behandling, i stor grad styrt resultatene av molekylære, cytogenetic og immunophenotypic studier og består av enten flere kurs av flere kjemoterapi eller (autologous eller allogene) stilk cellen transplantasjon3. Til tross for høy remisjon priser etter intensiv kjemoterapi for opptil 90%, 5-års overlevelse hos voksne er bare ca 30% - 40%, hovedsakelig på grunn av utviklingen av tilbakefall som er vanligvis motstandsdyktige mot kjemoterapi og dermed svært vanskelig å behandle. Utfallet i barn er bedre, men omtrent en tredjedel også tilbakefall. Derfor tidlig deteksjon av overhengende tilbakefall fyller et udekket medisinske behov og kan veilede etter remission terapi4.

Gjenværende sykdom etter terapi kan gjenspeile summen av alle diagnose og etter diagnose motstand mekanismer/faktorer; Dermed kan sin måling være prognostiske og instrumentale for guiding behandling. Muligheten for defining gjenværende sykdom (tidligere kalt minimal gjenværende sykdom og nå referert til som målbare gjenværende sykdom eller MRD) langt under morfologiske nødvendighetskriteriet 5% blast celler endrer landskapet av risiko classification. For tiden de to metodene hovedsakelig brukes til å oppdage MRD er flyt cytometri- og molekylær-baserte, sistnevnte blir vurdert av revers transkriptase PCR (RT-qPCR)5 eller, men i et tidlig stadium av neste generasjons sekvensering (NGS). Mange studier hos voksne også som barn vist allerede at ulike MRD tilnærminger gir sterk prognostiske informasjon i AML både etter induksjon og konsolidering terapi6,7, og en ny definisjon av sykdom byrde ( overordnet morfologiske CR) fremstår nå8. Dette tyder på at MRD vurdert av flyt og/eller molekylær teknikker bør bli, og faktisk allerede blitt, standard i alle kliniske i AML.

Dette manuskriptet diskuterer detaljerte flyt cytometri prosedyren for å få en nøyaktig og reproduserbar immunophenotypic karakteristikk av MRD i benmargen prøver, inkludert beinmargen prøvetaking og behandling prosedyrer foregående flowcytometri. Tilgjengeligheten av god kvalitet benmarg samples ved diagnostisering og oppfølging er avgjørende for suksessen til denne målingen over kliniske områder og kliniske studier. Faktisk er disse pre analytisk også av avgjørende betydning for molekylær (PCR og NGS) MRD. Immunophenotypic karakteristikk av MRD, er aberrantly uttrykt indikatorer kombinert med normal myelogen og stamfar markører, til å identifisere en leukemi-assosiert immunophenotype (LAIP)9. MRD måler resulterende av mange faktorer som påvirker svar terapi, som innebygd eller ervervet leukemi resistens, pharmacodynamics og kinetics terapi, immun overvåking og etterlevelse. MRD er derfor en veldig sterk etter diagnose prognostiske parameter tilknyttet kliniske utfallet når dichotomized på cut-off nivå bestemmes av mottakeren drift karakteristisk (ROC) analyse. For våre voksen AML kohort av HOVON 42a studere, cut-off settes på 0,1% LAIP positive celler/totalt hvite blodlegemer. Bruker dette kriteriet for å bestemme negative vs positiv MRD status, kan en gruppe pasienter identifiseres som har en betydelig dårligere tilbakefall forekomsten, tilbakefall-fri og total overlevelse6. I tillegg beskriver vi måling av umoden, resistente leukemi celler med stilk cellen-lignende funksjoner (CD34 + CD38-leukemi stamceller eller Lexmarks Løsningssenter), som gir en sterk prediktor for pasient utfall10. Sammen LAIP og Lexmarks Løsningssenter tilnærminger skjemaet flyt cytometric MRD tilnærming. LAIP tilnærmingen passer for omtrent 90% av pasienter, mens Lexmarks Løsningssenter tilnærming kan brukes i ca 80% av pasientene. Sammen over 95% av pasientene kan vurderes for en parameter eller begge.

Til slutt gir denne publikasjonen en detaljert operative beskrivelse for å vurdere MRD av flowcytometri. Dette inkluderer: 1) harmonisering og/eller standardisering av benmarg utvalgstrekking, 2) eksempel transport veiledning 3) detaljert beskrivelse av leukemic celle gjenkjenning med FACS bruker flere antistoff panelene inkludert enkeltcelle tube tilnærminger å karakterisere Lexmarks Løsningssenter, 4) oppsett av FACS maskiner for standardisert målinger, 5) analyseprogrammer for MRD målinger og 6) analyseprogrammer for Lexmarks Løsningssenter gjenkjenning.

Vi tar sikte på å vise alle fasetter av prosedyren inkludert eksempel utarbeidelsen siden som er sjelden diskutert mens det er en viktig sak for kvaliteten på det ultimate resultatet. Benmarg aspirasjon og biopsi er kliniske prosedyrer brukes til å evaluere blodkreft cellene i benmargen. Dette utføres sammen med en full blodstatus (CBC) og blodutstryk. Den optimale metoden for benmarg aspirasjon er avgjørende for nøyaktig diagnose og oppfølging for MRD måling. I tillegg inneholde en vellykket benmarg leveringstanken nok celler for å utføre LAIP og Lexmarks Løsningssenter flyt analyse (minst 10 millioner levedyktig celler). Her beskriver vi metoden for å utføre en benmarg aspirasjon og gi retningslinjer, som skal resultere i tilstrekkelig celle utvalg (og grense potensialet for hemodilution) behov for nøyaktig diagnostikk og ytterligere forskning. Disse pre analytiske vurderinger er også av avgjørende betydning for molekylær (PCR og NGS) MRD tilnærminger. Alle prøver for immunophenotyping bør behandles fortrinnsvis innen 24 timer av samlingen. Selv om det ikke anbefales, kan benmargen og eksterne blodprøver fortsatt behandles og analysert når holdt opptil 72 h ved omgivelsestemperatur. I tillegg bør alle handlings med materialet utføres under sterile forhold, for å aktivere kryonisk bevaring av sterile celler for senere forskning/kvalitetsvurdering osv.

Protocol

Protokollen følger retningslinjene i forskning koden og etikk for forskning i VU University Medical Center.

1. benmarg aspirasjon og prøve forberedelse

  1. Pasienten og materielle forberedelse
    1. Fyll en eller to 10 mL sprøyter med 1% lidocaine bruker en 16-gauge nål. Erstatte nålen etter en 21-gauge nål.
    2. Sett to dråper 5% EDTA på et ur-glass.
    3. Definere glass lysbilder (n = 15 konsekvent pasienten nummerering og dato) for smøre forberedelsene.
    4. Plasser pasienten i laterale liggesår posisjon. Finn superior posterior iliaca ryggraden og merke med pennen.
      Merk: Generelt, bakre overlegen iliaca ryggraden er plassert en hånd bredde distale iliaca bølgetopp og en hånd bredde lateral til midtlinjen. I kvinner være selve ryggraden litt mer lateralt, i noen menn mer mediale.
    5. Rense huden med chlorhexidine 0,5-1% i etanol fra tiltenkte biopsi området utover i sirkler.
    6. Åpne pakken av sterile hansker, oppføre det sterile hansken og legge ned pakken på tabellen for å opprette et sterilt felt. Åpne pakken med aspirasjon nålen og plassere det i det sterile feltet.
    7. Infiltrere huden og subkutant vev og endelig periosteum. På periosteum, administrere lidocaine slik at et område på 1 cm diameter har vært anesthetized.
      Merk: Tilstrekkelig administrasjon av lidocaine til periosteum er en av de viktigste faktorene for pasientens komfort. Teste om periosteum har vært tilstrekkelig anesthetized ved å tappe den tiltenkte biopsi plasseringen med introdusert nålen og be om pasienten føler smerter. Merke: barn er fullt anesthetized under hele prosedyren.
    8. Hold leveringstanken nålen (15 Ga x 2,8") med den proksimale enden i håndflaten og pekefinger mot siden av nålens metall aksel nær spissen; denne plasseringen gir bedre kontroll.
    9. Introdusere nålen med en roterende bevegelse (av raskt vekslende pronating/supinating bevegelser) gjennom huden mot iliaca ryggraden og bringe nålen i kontakt med bakre iliaca ryggraden.
    10. Sikre at nålen er introdusert til bedøvet området periosteum; pasienten skal føle seg bare trykk og ingen smerter. Hvis pasienten føler smerte, enten flytte nålen eller administrere flere lidocaine.
    11. Bruker mild, men fast press, forhånd nålen mens rotere den i en vekslende med klokken-mot urviseren. Inngangen til margtransplantasjon hulrommet oppdages vanligvis av redusert motstand.
    12. Fjern stylet fra nålen. Fest en 10 mL tom sprøyte nålen.
    13. Bruke negative trykket ved uttak sprøytestempelet med en mild trekk. Advare pasienten at de kan føle en krampeaktig følelse og smerte når marg er å være aspirated. Hvis ikke nok benmarg spiklene utgis, skal en annen aspirasjon utføres med en rask uavgjort. De fleste spiklene vil være i de første 1-2 mL fra den første trekk. Sug opp bare 1-2 mL for å unngå fortynne prøven.
      Merk: Fortynning vil resultere i hemodilution og kan forvirre MRD resultater).
    14. Fjerne sprøyten og erstatte stylet i aspirasjon nålen. Kaste ut en del av margen i et ur-glass og resten i en 8 mL tube belagt med heparin.
      Merk: Invertere hver rør umiddelbart etter å plassere margtransplantasjon leveringstanken i prøven røret for å sikre tilstrekkelig anticoagulation. Benmarg koagulering er ofte årsaken til upassende materiale. Ekstra benmarg kan være aspirated fra samme sted, men helst nålen er avansert 5-10 mm før en ny leveringstanken er tatt. Helst bør ikke mer enn 2 uavgjorte per innsetting nivå tas. Sørg for å markere rør med økende tall som representerer først, andre og/eller påfølgende trekker. Det er felles regel bruke i første trekning for mest relevante diagnostiske analyse.
    15. Eventuelt trekke nålen fra innsetting stedet og gjeninnføre det inn i margtransplantasjon hulrommet noen millimeter fra det opprinnelige stedet for innsetting og gjenta.
      Merk: Ikke Sug opp mer enn 1-2 mL per trekk, betydelig blod forurensning unngås.
    16. Gjenta ofte materiale er nødvendig. Når tilstrekkelig materiell for bestemte klinisk studie-protokollen er pustende fjerne benmarg nålen.
      Merk: Ved treg eller ellers vanskelig benmarg ambisjoner bruk av sprøyter som var pre spyles med antikoagulerende kan være nyttig. Ved en tørr trykk, utføre en trephine biopsi som er utenfor omfanget av dette manuskriptet.
  2. Utarbeidelse av utstryk for morfologiske eksamen
    1. For optimal morfologiske vurdering, plukke ut spiklene (f.eks med en plast slikkepott) fra leveringstanken i ur-glass og legg dem på et glass lysbilde.
    2. Forsiktig plassere en annen objektglass over lysbildet med margen og skyv; unngå noe press.
      Merk: Bare i tilfelle stor benmarg spiklene lett trykk kan være utøvet, for å redusere tykkelsen på celle spredning. Prosedyren drar nytte av hjelp fra en assistent som kan håndtere prøven rørene. Nøyaktig merking av rør med pasienten antall og antall sekvensiell benmarg trekningen er avgjørende.
    3. Tørk lysbildet godt, og utfør deretter kan Giemsa Grünwald flekker (se tabell av materialer). Undersøke under lys mikroskop for morfologi (se figur 1).
      Merk: Figur 1A viser flekker av sunn benmarg består av ulike funksjonelle celletyper mens figur 1B en AML pasient med overveiende leukemic støt. Du bedre definerer gjenværende leukemic byrden ved må immunophenotyping utføres.

2. transport av materiale for videre behandling

  1. Utarbeidelse av prøvene for transport
    1. For å sikre at materialet ikke vil lekke og rør ikke vil bryte, sikre riktig emballasje (se figur 2).
      Merk: Fra våre og andre opplevelser levedyktigheten til cellene er best bevart når benmargen holdes ved romtemperatur. Langsiktig transport er dette best oppnås ved hjelp av romtemperaturen 'Gelpack' til hjelp i temperatur stabilitet under transport.
    2. Etiketten pakker og legge til riktig skjemaer for å unngå tap av pakken, langvarig transport eller bytte av pasienter.
      Merk: Dette skal minst inneholde: (skjemaet 1) pasientdataene. Dette bør inkludere studere antallet, og vanligvis "Dato av fødselen". Avgjørende for riktig behandling av materialet etter ankomst ved mottak lab, er en klar uttalelse om spesielt forespurte laboratoriet analyse (molekylær diagnostikk, immunophenotyping, MRD etc.) i dette skjemaet. (Skjema 2) Adresse og telefon antallet av en kontaktperson, og når nødvendig, papirer for toll. For å unngå å miste pakker i posten, varsler sender laboratoriet alltid motta laboratoriet som et utvalg har blitt sendt. Bruk av "track and trace" anbefales.
  2. Motta prøver fra andre institutter
    1. Kontroller at egnet logistikk er på plass ved Institutt for prøven på laboratoriet så snart den er levert ved institute.
      Merk: For optimal logistiske organisasjon fortrinnsvis en central laboratorium er nødvendig, som mottar og samler alt materiale fra den lokale klinikken og eksterne sykehus. Det er spesielt viktig å tilordne protokoller for distribusjon og klar kommunikasjon med executive laboratoriene.
    2. Etter å ha mottatt prøvene, nøyaktig Merk riktig nummereringen i papirutgave skjemaer og en sikret database som inneholder viktig felt som MRD ID-nummer, prøve spesifikke ID-nummeret, sykehuset registreringsnummer, sende institute, fødselsdato, materiale type (benmarg eller perifert blod), antall hvite blodlegemer (WBC), dato av benmarg aspirasjon, datoen for måling av prøven og alle kommentarer relevant for kvaliteten på målingen.
      Merk: Helst denne databasen er også utstyrt inneholder tilleggsdata (eller koblet til andre databaser) analyseresultater og ytterligere pasientdataene som oppfølging data.

3. strøm Cytometer oppsett

Merk: Denne delen er basert på Euroflow instruksjoner. 11

  1. Oppsett av photomultiplier (avdrag) spenninger for FCS SSC parametere og målet fluorescens kanaler
    1. For FCS SSC oppstart flyt cytometer og utføre det "Cytometer installasjon og sporing (CST)" kjøre på flyt cytometer med CST perler (se tabell av materialer). Lyse røde blod celler fra en frisk donor (beskrevet i kapittel 4.1).
      1. Opprett et nytt eksperiment (menyen: eksperiment, nye eksperimentere, velger tomt eksperimentet) bruke produsentens programvare (se tabell av materialer) med et frem scatter (FSC) versus sidelengs (SSC) dot spredningsdiagram konfigurere parameterne FSC og SSC. Navn dette eksperimentet FSC/SCC avdrag dato. Først bruke gjeldende innstillinger for cytometer (Høyreklikk: "Bruk gjeldende CST"). Disse innstillingene har blitt generert med CST ytelse sjekken bruker CST-kalibrering perler (se tabell av materialer). Juster FSC og SSC visualisere lymfocytter i "global eksperiment innstillinger". I våre flyt-cytometer er 285 V og 400 V hhv. Krysse av "Aktiver kompensasjon" i: inspektør/Instrument innstillinger/kompensasjon.
      2. For å vurdere størrelsen på celler (FSC) og tetthet (SSC) lysed begynner å måle umerket perifert blod celler av funksjonen "erverve celler". Gate lymfocytter og justere/finjustere FSC og SSC spenninger nå følgende mener målverdier for gated lymfocytt befolkningen: FSC: 100.000 (range 95 000-105,000); SSC: 15.000 (range 13 000-17 000).
      3. Kjøpe og registrere data ved å måle minst 10.000 hendelser. Kontroller gjennomsnittet FSC og SSC målverdier for gated lymfocytter og Juster om nødvendig.
    2. For å definere målet fluorescens bruke kanaler avdrag spenninger 8-peak rainbow perler kalibrering partikler (se tabell av materialer).
      1. Opprett et nytt eksperiment på FACS for 7-topper. Opprette et regneark "Betyr fluorescerende målintensitet (MFI)" med alle nødvendige dot tomter (n = 2; FSC versus SSC, FITC versus PE), histogrammer (n = 8, et histogram for hvert fluorescens detektor) og statistikk som viser referansen peak verdier (MFI og variasjonskoeffisienten (CV)) for hver fluorescens kanal.
      2. Forberede fersk en løsning som inneholder 1 dråpe (± 60 µL) av rainbow perler i 1 mL av dH2O. forsiktig vortex å blande perlene i løsningen.
      3. Bruk innstillingene for innbetaling av FSC/SSC spenninger ovenfra og begynner å måle fluorescens av rainbow perler ved hjelp av funksjonen "kjøpe" (uten opptak) på "Lavt" infusjonshastigheten med en terskel på 5000. Bruk "rektangulære gate knappen" til gate singlet perler befolkningen P1 i FSC versus SSC dot tomten. Gate den 7th topp - befolkningen P2 i FITC versus PE dot tomten.
      4. Fortsette oppkjøpet av de 7-topper Rainbow perle fjæring og justere/finjustere avdrag spenningene i alle fluorescens kanaler å nå MFI målverdier ifølge kommenterte MFI målet kanalene som følger med perler.
      5. Bruk "Record" å samle inn data over 10.000 hendelser og sjekk MFI for de 7th Peak perler. Korriger avdrag spenninger hvis nødvendig. En gang målet MFI verdier for 7th toppen nås, post/overskrive filen sluttverdier avdrag.
      6. Lagre siste avdrag verdiene og navnet på filen avdrag installasjon med datoen, som skal lagre i katalogen av produsentens programvare. Bruk dette avdrag oppsettet for korrigere utslippet for hver fluorescens fargestoff.
  2. Fluorescens kompensasjon innstillinger
    1. Merke et rør for kontrollen unstained kvinne og hver fluorochrome konjugert antistoff (se tabell S1 for de brukte fluorochromes). Pipetter 100 µL bufferen i hver retning.
    2. Vortex ampullen av multicolor kompensasjon perler (se tabell av materialer) grundig og deretter legge til 1 full dråpe (± 60 µL) av disse perlene i hver retning.
      Merk: Unngå dryppende perler på siden av røret mens du legger dem til hver rør. Dette kan føre til lav bead konsentrasjon og kan påvirke resultatene av kompensasjonsplanen.
    3. Pipetter riktige volumet beregnes for en test av fluorochrome-konjugerte antistoffer tilstrekkelig (som ville være tilstrekkelig stain 106 celler) i tilsvarende rør og vortex grundig. Ikke Legg antistoff til unstained kvinne kontroll røret. Inkuber i 15 til 30 min i mørket ved romtemperatur (RT).
    4. Legge til 4 mL vaskebuffer (fosfat-bufret saltvann (PBS)/0.05% azide-0.1% menneskelige serum albumin (HSA) (se tabell av materialer)) til hver tube. Sentrifuge rørene på 300g for 10 min. fjerne nedbryting og resuspend perle pellet ved å legge til 0,2 mL vaskebuffer hver rør. Vortex rør grundig.
    5. Åpne produsentens analyseprogramvare (se tabell av materialer) og Opprett et nytt eksperiment (menyen: eksperiment, nye eksperimentere, velger tomt eksperimentet) og endre som kompensasjon-fil med dagens dato.
    6. Gå til "innstillinger for cytometer" og bruker innstillingen avdrag under 3.1. Pass på at terskelen i FSC er 5000 og kompensasjon verdiene i alle brukte fluorochromes er null.
    7. Opprette kompensasjon kontroller, inkludert etikett-spesifikke rør, etter behov. Husk å ta en unstained kvinne kontroll. Velg menyen: eksperiment, kompensasjonsoppsett, opprette kompensasjon kontroller.
    8. Last unstained kvinne kontroll røret og justere P1 porten rundt singlet perle befolkningen og sikre at P1 porten inneholder bare singlet perler.
    9. Høyreklikk P1 porten og velg "Gjelder for alle kompensasjon Controls". Registrere data for alle enkelt merket fluorescens rørene. Kontroller at P2 gate omfatter positiv befolkningen på hver fluorescens histogrammet. Om nødvendig justere porten.
    10. Beregne kompensasjon. Velg eksperiment, kompensasjonsoppsett, beregne kompensasjon.
    11. Hvis kompensasjonsberegningen ikke er vellykket, vises en feilmelding. Foreta nødvendige justeringer, og omberegn. Når kompensasjonsberegningen er vellykket, vises en dialogboks stadige navn for kompensasjonsoppsett.
    12. Angi et navn (for eksempel åå-MM-DD 8 fargeoppsett) og klikk, koble og lagre. Kompensasjonsoppsett lagres også i kompensasjon installasjonen katalogen.
      Merk: De samme innstillingene kan brukes for alle eksperimenter ved hjelp av den samme fluorophores.

4. flyt cytometri vurdering (LAIP og Lexmarks Løsningssenter)

Merk: Her beskriver vi bulk lysis prosedyren før farging, som gjør stain en foretrukket konsentrasjon av WBC. De fleste MRD protokoller bruker denne tilnærmingen selv om noen har brukt andre alternativer som flekker før lysis. Hele benmarg flekker før lysis minimerer fortrinnsrett celle tap12, men har ulempen av uforutsigbar, lavt celle konsentrasjoner.

  1. Bulk lysis av celler
    Merk: Hold unmanipulated prøvene horisontalt på RT, når flyt cytrometric oppkjøpet ikke kan utføres samme dag for å starte hele prosedyren neste dag.
    1. Resuspend anticoagulated benmarg prøve å homogenitet av invertere utvalget flere ganger. Bestemme konsentrasjonen av bein margtransplantasjon celler (hvite blodlegemer (WBC)) at en celle teller kammer med cellen flekker Tuerk løsning (se tabell av materialer).
    2. Pipetter nødvendig volumet av benmargen i en separat 15 mL tube. Celler er avhengig av antall separat flekker rør; for en flekker (en tube) bruk ca 2 x 106 hvite blodlegemer for LAIP mål og 8 x 106 hvite blodlegemer for måling av Lexmarks Løsningssenter røret.
    3. Lyse røde blod celler ved å legge lysing løsning (se tabell av materialer). Nødvendig antall lysing løsning bør være 10 ganger volumet av cellen suspensjon.
    4. Bland forsiktig ved inversjon og Inkuber i 10 min på RT. Sentrifuge for 7 min 800g ved RT. Forkast nedbryting (f.eks med en vakuumpumpe eller Pasteur pipette). Resuspend celle pellet i fosfat-bufret saltvann (PBS)/0.05% azide-0.1% menneskelige serum albumin (HSA) (se tabell av materialer) på RT. Bruk det maksimale volumet av røret.
    5. Sentrifuge for 7 min 800g ved RT. forkaste nedbryting (f.eks med en vakuumpumpe eller Pasteur pipette). Nytt avbryte celle pellet PBS/0.05% azide-0.1% HSA å en cellen konsentrasjon 100 x 106 WBC/mL, og del over antall tiltenkte rør.
  2. Farging av celler for flowcytometri
    1. Pipetter monoklonalt antistoff (MoAb) cocktail løsning bland inn i aktuelle fluorescens-aktivert cellen sorter (FACS) rørene og ruge med lysed bein margtransplantasjon celler i 15 min i mørket.
      Merk: Dette er svært viktig når tandem-fargestoffer brukes. For eksempel se mikser panelene elever med en standard brukt i vårt laboratorium (tabell S1).
    2. Vask cellene med 3 mL PBS/0.05% azide-0.1% har. Sentrifuge celler for 5 min på 400g. Kast nedbryting (f.eks med en vakuumpumpe eller Pasteur pipette) og resuspend celle pellet i 300 µL PBS/0.05% azide-0.1%HSA.
    3. For Lexmarks Løsningssenter måling: resuspend celle pellet i 400 µL PBS/0.05% azide-0.1% HSA og legge 4 µL av Tom perler (f.eks Spherotech, se tabellen i materialer) bruke som negativ kontroll befolkningen i analysen.
    4. Åpne MRD eller Lexmarks Løsningssenter eksperiment lay-out på FACS (se tabell av materialer) og mål for MRD minst 100.000 WBC gated hendelser for måling av AML pasientprøvene diagnose og 1 X 106 WBC for AML samples ved oppfølging. For Lexmarks Løsningssenter måle eksperimenter minst 4 x 106 WBC både diagnose og oppfølging pålitelig Lexmarks Løsningssenter resultatet.
    5. Lagre dataene med et standardisert riktig filnavn for analyse av resultatene. Lage en oversikt over de forskjellige målte markørene på AML cellene og AML stamceller (positive, negative, over/under uttrykk) og lagre disse dataene i journalen lab.
    6. I tilfelle det er ingen diagnose LAIP tilgjengelig, måling alle 4 rør på oppfølging for å sikre at eventuelle målbare kan LAIP identifiseres i en forskjellig fra vanlig tilnærming.
    7. Velg den mest pålitelige LAIP(s)13 i diagnose og skaffe så mange hendelser som mulig, men > minimum tall definert.

5. identifikasjon av leukemi forbundet Immuno-fenotyper (LAIP): analyser av ulike celle populasjoner

Merk: FCS filer kan analyseres med flere program for optimal visualisering av ulike celle populasjoner (se tabell av materialer).

  1. Hvite blodlegemer befolkningen
    1. Gate CD45 positiv cellene og levedyktig vises cellene, utelate lav FSC (ikke-levedyktige celler, erythroid celler) i FSC/SSC handlingen; Disse inneholder WBC (figur 3Ajeg). Vis WBC og bruk en av de primitive markørene (for eksempel CD34, Figur 3Aii) til å fastslå den endelige plasseringen av eksplosjonene i de CD45dim området (figur 3Aiii).
    2. Gate CD45dim cellene og tilbake gate cellene i FSC/SSC handlingen (figur 3Bjeg). Fjern CD34 porten (figur 3Bii) ved rapportering % cellene i denne porten som % støt i befolkningen treet i programmet. Vis eksplosjonene i en SSC/CD34 plot og gate CD34 positive cellene (figur3Biii).
  2. Lymfocytter
    1. Bruke lymfocytter som en intern kontroll: myelogen populasjoner som en negativ kontroll og lymfoide populasjoner som en positiv.
    2. Start fra befolkningen hvite blodlegemer (figur 4A). Gate lymfocytter som CD45høy/SSClav befolkningen (figur 4B).
    3. Kontroller at det er ingen myeloide celler i porten i CD34, CD117, CD13 eller CD33 og gate CD13 negative/CD33 negativ celler (Figur 4C-E). Kall denne befolkningen 'lymfocytter' i befolkningen treet (figur 4F).
  3. LAIP på diagnose
    1. Gate eksplosjonene og senere CD34 positive cellene i en SSC/CD34 plot og kaller disse "primitive stein" i befolkningen treet.
    2. Tegne det primitive celler, i dette tilfellet CD34 positive og lymfocytter i ny tomten med en lymfoide markør (CD7) mot en myelogen markør (CD33). Gate avvikende befolkningen (se retningslinjer supplerende fil 1) og kaller dem "LAIP positive" i befolkningen treet.
      Merk: Den siste valgt LAIP rapporteres som % LAIP på befolkningen blast. Sensitivitet og spesifisitet stabilitet i LAIPs kan etableres bare av personell med utstrakt erfaring i MRD målinger. Summen av disse parameterne bestemmer kvaliteten på LAIP. Eksempler på fire forskjellige LAIP vurderinger på diagnose er gitt i figur 5 Ad.
    3. Bestemme uttrykk for LAIPs (% på eksplosjonene) og bevare disse dataene i en database eller excel-fil.
    4. Lage rapporter av FACS analyser og notater av LAIPs som må brukes på MRD målinger.
      Merk: Definisjonen av LAIPs er autorisert i et team av eksperter siden det er en viktig funksjon for nøyaktige MRD målinger på Følg opp.
  4. MRD på oppfølging
    1. Gate eksplosjonene som beskrevet i 5.1 men avhengig av tidspunktet etter terapi; riktig vurdering av denne porten kan være utfordrende. Fokus på LAIP fenotypen som ble etablert på diagnose og gate befolkningen umodne.
    2. Som beskrevet i 5.1. finne riktig blast porten basert på det definerte aberrancy og være klar til å regenerere benmargen og vanlige uttrykk for å gate dem ut
    3. Gjenta de samme gating strategi hele oppfølging poeng og bestemme MRD som prosent av LAIP celler i befolkningen hele hvite blodlegemer. Se for eksempel figur 6A og 6B.
    4. Rapportere MRD positivitet når % av MRD er ≥ 0,1% av de hvite blodcellene. Skrive ut analysert data i standardformat å diskutere ukentlig MRD laget. Registrere resultatene etter at konsensus er nådd. La resultatene godkjennes av systemansvarlig før kommunisere resultatene av klinikere.

6. analyse av stilk cellen MRD (Lexmarks Løsningssenter enkeltrør)14

  1. Analyser av Lexmarks Løsningssenter diagnose og oppfølging
    1. Gate blast cellene som beskrevet i delen 5.1.
    2. Som potensielle negative kontroll for CD38, gate røde celler-fraksjon (dvs. gjenværende røde blodlegemer etter lyse, karakterisert som SSClav/FSClav og CD45negativ). Eventuelt døde celler og cellen fragmenter kan ekskluderes ved en ekstra gate i denne tomten.
    3. Bestemme i leukemic blast porten subpopulasjon med uttrykk for CD34. Velg innenfor denne befolkningen i CD34+ CD38- celler (bruke som cut-off: øvre kant av tomt kalibrering perler for terskelen vilje (se tabell av materialer), red-fraksjon eller bruk 103 som avskjæringspunkt). Kaller denne befolkningen 'CD38lav progenitors' (figur 7).
      Merk: Se utfyllende fil 1 for ytterligere informasjon om innstillingen CD38-cut fra nivåene.
    4. Bestemme innenfor denne CD38lav befolkningen den sanne CD34 + CD38svært lav stamcelleforskningen populasjonen medianen til den røde brøken, nedre del av Tom kalibrering perler eller velge 102 som avskjæringspunkt (figur 7 ). Se utfyllende fil 1 for ytterligere detaljer om hvordan de CD38-cut fra nivåene.
    5. I begge befolkninger, gate leukemic stamceller g. normal blodkreft stamceller (Lexmarks Løsningssenter vs HSC) ved å analysere hver leukemic indikator i panelet (i.e. CD45RA, kombi-6 (CLEC12A, TIM-3, CD7, CD11b, CD22 og CD56 i PE), CD123, CD33 og CD44).
    6. Tegne inn stilk cellen markøren rundt kontra andre stamcelleforskningen merke sammenligne positivitet/negativitet med positivitet/negativitet av andre markører og finjustere Lexmarks Løsningssenter versus HSC frekvens.
    7. Rapportere prosentandelen av umodne eksplosjonene, lymfocytter, CD34 + celler. For alle separate markører, Vis det totale antallet CD38lav og CD38sanses i konsentrasjoner og antall CD38lav og CD38sanses i konsentrasjoner som markør positive (og dermed neoplastic).
    8. Velg for markøren som beste skiller normal blodkreft stamceller vs leukemic stamceller for videre analyse. Beregning av Lexmarks Løsningssenter og HSC som prosent av totale WBC.
      Merk: En prosentandel av Lexmarks Løsningssenter ≥ 0.004% rapporteres som Lexmarks Løsningssenter positivt i diagnose, mens cut-off er 0,0001% på oppfølging. Avvikende stamceller gating i oppfølging prøver ligner analyse som på diagnose, men cellen tallene i befolkningene som stilk cellen kan være svært liten. Dermed nødvendigheten av å skaffe nok hendelser.

Representative Results

I 90% av AML pasienter kan minst én LAIP identifiseres. For å generere nøyaktige prosentverdiene LAIP + celler av primitive blast cellene på diagnose, innstillingen av blast gate er avgjørende og trenger bekreftelse som visualisert i Figur 3. Et eksempel på hver pasient skjuler en bestemt type aberrancy på det CD34 + primitive celler er visualisert i figur 5. For måling av MRD på oppfølging, tidligere definerte LAIP + cellene er gated og definert som prosent av LAIP + celler av WBC. Derfor er innstillingen for denne porten avgjørende for riktig MRD resultat. Figur 6 viser en pasient som forblir i fullstendig forlatelse og en pasient som tilbakefall etter å ha MRD positive resultater (≥ 0,1%) etter andre syklus av induksjon terapi.

Gjeldende protokollen er bare egnet til å definere stamceller i CD34 + celler, siden grundig karakteristikk av dette rommet har vist at CD38-befolkningen havner mest potente stilk cellen som brøkdel. For å skille Lexmarks Løsningssenter fra HSC i denne fraksjonen, brukes ekstra markører. Oftest valgte indikatorer for å skille Lexmarks Løsningssenter er CD45RA og combi kanalen skjuler 6 bestemt Lexmarks Løsningssenter markører merket med PE. Basert på ytterligere kliniske evalueringer, en cut-off ≥ 0.004% ble definert som Lexmarks Løsningssenter-positive og ble assosiert med dårligere overlevelse på diagnose mens et cut-off nivå på 0,0001% ble brukt på følge etter etter opp10.

Figure 1
Figur 1 : Bein margtransplantasjon smøre. A) frisk donor og B) AML pasient (FAB 5 undertype). Giemsa flekk på 100 x forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Riktig emballasje for biologiske væsker. Mer informasjon om regler og forskrifter for transport biologiske væsker kan finnes på nettsiden15 av Centers for Disease Control og Prevention. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Gating strategi for å definere blast celler. A) Gating CD45dim, B) Gating CD34 + eksplosjonene.

Figure 4
Figur 4 : Gating lymfocytter. A) blå celler er WBC vises i FSC/SSC tomten, B) grønne celler er lymfocytter preget av CD45høy/SSClav, C) eksempler av negativitet for CD34, D) negativitet for CD117 og E) negativitet for CD13, F) i ulike celletyper vises i en Oversikt over befolkningen treet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : LAIPs på AML diagnose. A) LAIP basert på tvers av slekten aberrancy (CD7 på CD33 uttrykke celler), B) LAIP basert på asynkron differensiering (CD11b på CD13 uttrykke celler), C) LAIP basert på overuttrykte i forhold til normale celler (CD34svært høy på CD13 uttrykke celler), D). LAIP basert på underexpression i forhold til normale celler (HLA-DRlav CD33 uttrykke celler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : LAIP fulgte i løpet av terapi. A) LAIP definisjon på diagnose (CD34 / CD13 / CD33-) og tap av LAIP under oppfølging i en pasient som forble i kontinuerlig komplett remisjon, B) LAIP definisjon på diagnose (CD117 / CD7 / CD33 +) og utholdenhet av LAIP under oppfølging i en pasient som tilbakefall. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 : Stamcelleforskningen gating. A) Gating av de forskjellige CD34 / CD38 bestander basert på perler (CD38lav er under den øvre grensen av perler, mens CD38svært lav er definert som ekte negative cellene representerer Lexmarks Løsningssenter og ligger nedenfor median av perler), B) to Eksempler på pasienter med skille mellom HSC og Lexmarks Løsningssenter på oppfølging basert på CD45RAneg og CD45RApos uttrykk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ekstra fil 1. Vennligst klikk her å downoad filen.

Ekstra filen 2. Vennligst klikk her å downoad filen.

Ekstra filen 3. Vennligst klikk her å downoad filen.

Discussion

God data er tilgjengelig som viser bevis for MRD positivitet å være assosiert med dårlig overlevelse, og derfor MRD vurdering kan forbedre pasient utfall av gir deg prognostiske informasjon som klinisk beslutninger kan gjøres. Derfor er en konsekvent og harmoniske metode for immuno-fenotypiske vurdering av MRD viktig til slutt forbedre pasientens terapi. Dette er også viktig når du sammenligner kliniske studier over forskjellige kliniske områder, og kan til slutt hjelp i klinisk beslutningsstøtte gjør og tjene som et surrogat klinisk endepunkt for total overlevelse. Forestillingen om at solid retningslinjer er berettiget for nøyaktig og konsekvent MRD målinger har ført til en felles handling av europeiske leukemi nettverk (ELN) design toppmoderne retningslinjer. Denne omfattende dokument blir publisert sent-2017, og vil være instrumentell for mange kollokvier og laboratorier fremover.

Avgjørende skritt i protokollen

En viktig og ofte oversett del av MRD analyse er effekten av prøven kvalitet på nøyaktig bestemmelse av MRD. Dette er tydeligere når materialet har å bli transportert til andre institutter i globale kliniske forsøk gitt de ekstra driftsmessige hensyn som må tas hensyn til i denne innstillingen. For å redusere risikoen for å blande opp pasienten er informasjon og rettidig levering av prøver tilstrekkelig administrasjonen avgjørende. Igjen, på dette stadiet av transporten den korrekte former og/eller import i elektronisk sykehus systemer med klart tildelinger forespurte analysen er nødvendig. Merke scenen ved behandling av MRD prøvetaking er også avgjørende siden det kan være relevant for klinisk beslutningsstøtte (for eksempel etter andre løpet av terapi) og bør derfor defineres klart. Bruk av uekte data (som for eksempel januar 1 per fødselsår) øker risikoen for å blande opp pasienter eller analyser. Hvis påkrevet ved lov, bør en alternativ anonymisert måte legitimasjon brukes.

Alle prøver for immunophenotyping bør behandles fortrinnsvis innen 24 timer av samlingen. Selv om det ikke anbefales, kan benmargen og eksterne blodprøver fortsatt behandles og analysert når holdt opptil 72 h ved omgivelsestemperatur. I tillegg alle handlings med materialet kan best utføres under sterile forhold, slik at ytterligere kryonisk bevaring av celler i (lokal) biobanker fortsatt relevante: mange kliniske studier har flere analyser til å undersøke nærmere leukemi celler med respekt til molekylær immuno-fenotypiske og funksjonelle funksjoner som skal utføres på et senere tidspunkt. Men detaljene for biobanking er ikke innenfor dette manuskriptet.

Bruke MRD som et diagnostisk verktøy innebærer at det må akkreditert laboratorium, ikke bare for flowcytometri, men også om kvalitetskontroll av MRD vurdering. Dette krever distribusjon prøver å spesifikk referanse laboratorier eller (re) analysere flyt filer med MRD målinger av referanse.

Denne artikkelen beskriver de viktigste handlingene fra benmargen leveringstanken samling til fastsettelse av MRD i klinisk prøver - krever en hele team av eksperter med bestemte oppgaver, ansvar, og hyppige kommunikasjon for effektiv karakterisering og analyse. Siden hver aktivitet er avgjørende for prosedyren, anbefales det å ha lyd logistikk inkludert protokoller ved hvert laboratorium og tilstrekkelig sikkerhetskopi personell som er spesielt opplært på aktiviteten. I tillegg, siden det er noen relativt subjektive trinn delvis av prosedyrer (spesielt LAIP og Lexmarks Løsningssenter avvikende markør identification), er det viktig å ha diskusjoner om resultatet av teamet, og har den endelige rapporten er godkjent av et team av veiledere. Dagens innsats arbeider computer software utvikling som vil bidra til å standardisere (LAIP og Lexmarks Løsningssenter) MRD analysen.

Modifikasjon og feilsøking

Hver lab kan ha sitt eget sett av antistoffer som kan brukes til å definere de forskjellige subpopulasjoner selv om å ha en standardisert ryggrad av markører er avgjørende for sammenlignbare resultater, som beskrevet i ELN toppmoderne retningslinjer for MRD målinger dokument nevnt over. Uansett valgte markører det er noen problemer som kan gjøre analyse av resultatene vanskelig og må tas i betraktning.

Begrensninger av teknikken

Identifikasjon av LAIP og Lexmarks Løsningssenter avvikende markør uttrykk er først vurdert på diagnose og overvåket over tid (under og etter terapi) for nøyaktig karakteristikk av MRD fenotypen. Mens over 95% av pasientene kan evalueres via LAIP eller Lexmarks Løsningssenter (eller begge), fortsatt noen pasienter har ingen definerte LAIPs eller ingen CD34 + CD38-LSCs presentere CD34 negative støt eller har en manglende diagnose prøve. I disse tilfellene, er det fortsatt verdt å prøve å måle MRD med et panel av antistoffer bredt som antall tilgjengelige celler tillater og velg den mest pålitelige (gir sterkeste æren av leukemic celler) LAIP. Vurderer at en andel av pasienter som til slutt tilbakefall ikke helt ligner diagnose immunophenotype, på grunn av heterogenitet AML Disease, måle et bredt panel av antistoffer i MRD anbefales allikevel. Disse immunophenotypic Skift blast celler og LSCs og har vist seg å oppstå under terapi16 og measureable sykdommen kan være basert på disse såkalte kommende populasjoner. Denne gangen men er det ikke fastslått om alle immunophenotypic Sub-populasjoner vil føre til sykdommen tilbakefall, og er derfor ikke vanlig praksis å rapportere MRD skreddersydd-terapi basert på disse cellene i kliniske forsøk. Det er viktig å merke seg at risikoen for manglende Lexmarks Løsningssenter på grunn av befolkningen Skift er redusert av en tube tilnærming som den viktigste aberrancy definere markører er i en flowcytometri (PE) kanal14.

Betydning når det gjelder eksisterende metoder

Metoden beskrevet i denne protokollen er avhengig av definisjonen av en eller flere LAIPs, hvilke celler følges under behandling. En ulempe med denne metoden er at det har nylig vist at LAIP kan endres i løpet av terapi. Denne måten noen kommende populasjoner med forskjellige avvikende indikatorer kan være savnet. For å omgå dette, ville det være best å måle alle avvikende markører i stedet for bare de på diagnose. Dette vil da være lik "annerledes fra vanlig" tilnærmingen som brukes av flere laboratorier17.

Framtidige applikasjoner

MRD har nylig fått ekstra oppmerksomhet for romanen klinisk prøve design. I æra av spesialiserte behandlingstilbud og målrettet medikamentell behandling, bruk av MRD som et resultat tiltaket vil redusere tiden det tar å opprette klinisk effekt av romanen behandlinger, til slutt slik at raskere innføring av haster terapeutiske alternativer i klinikken. Betydningen av aktuelle logistikk og praktisk effektuering av en harmonisert MRD vurdering er avgjørende for fremtidige AML suksess som FDA er for tiden undersøker muligheten for å bruke MRD som et surrogat endepunkt i stedet for total overlevelse måler18.

Disclosures

Antistoff cocktailer brukes til validering av stilk cellen røret i flere uavhengige institutter fotograferingen av BD. Forfatterne ikke avsløre i forhold til dette manuskriptet.

Acknowledgments

Denne forskningen har blitt støttet av hollandske Kreftforeningen (ALPE 2013-6371) og Egbers grunnlag for VONK. Vi takker nederlandske AML-MRD arbeidsgruppen for samarbeid og fruktbart diskusjoner for kontinuerlig forbedring og standardisering av AML-MRD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Biosciences 120995496,060996589 and 013729 FACS Canto II 
BD Biosciences 555360 CD7 FITC
DAKO F076701 CD2 FITC
Sanquin M1613 CD36 FITC
BD Biosciences 332778 CD15 FITC
BD Biosciences 335039 CD45RA FITC
BD Biosciences 345810 CD56 PE
BD Biosciences 337899 CD22 PE
BD Biosciences 345785 CD14 PE
Miltenyi Biotec 130-080-801 CD133 PE
BD Biosciences 562566 Clec12a PE
BD Biosciences 565568 Tim-3 PE
BD Biosciences 332774 CD7 PE
BD Biosciences 333142 CD11b PE
BD Biosciences 337899 CD22 PE
BD Biosciences 345810 CD56 PE
BD Biosciences 347222 CD34 PERCP-CY5.5
BD Biosciences 558714 CD123 PERCP-CY5.5
Beckman Coulter B49221 CD117 PE-CY7
BD Biosciences 562854 CD33 BV421
BD Biosciences 345791 CD19 APC
BD Biosciences 333143 CD11b APC
BD Biosciences 345800 CD33 APC
BD Biosciences 345807 CD38 APC
BD Biosciences 641411 HLA-DR APC-H7
BD Biosciences 560532 CD44 APC-H7
BD Biosciences 562596 CD13 BV421
BD Biosciences 348811 CD34 PE-CY7
Beckman Coulter A96416 CD45 Krome Orange
BD Biosciences 655873 CD45 HV500c
BD Biosciences 655051 CST beads 
BD Biosciences 555899 Pharm lysing solution
BD Biosciences 644204 Multicolor CompBeads
BD Biosciences 655051 CST beads
BD Biosciences FACSDiva software
Cytognos Infinicyt 
Spherotech Euroflow RCP-30-5a
Sigma-Aldrich Tuerk solution
Spherotech BCP-100-5 Blank Calibration Particles Beads
         HSA
         Azide
         ddH2O

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Döhner, H., et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel. Blood. 129 (4), 424-447 (2017).
  2. Zwaan, C. M., et al. Collaborative Efforts Driving Progress in Pediatric Acute Myeloid Leukemia. J Clin Oncol. 33 (27), 2949-2962 (2015).
  3. Cornelissen, J. J., et al. The European LeukemiaNet AML Working Party consensus statement on allogeneic HSCT for patients with AML in remission: an integrated-risk adapted approach. Nat Rev Clin Oncol. 9 (10), 579-590 (2012).
  4. Grimwade, D., Freeman, S. D. Defining minimal residual disease in acute myeloid leukemia: which platforms are ready for "prime time"? Hematology. 2014 (1), 222-233 (2014).
  5. Krönke, J., et al. Monitoring of minimal residual disease in NPM1-mutated acute myeloid leukemia: a study from the German-Austrian acute myeloid leukemia study group. J Clin Oncol. 29 (19), 2709-2716 (2011).
  6. Terwijn, M., et al. High prognostic impact of flow cytometric minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia: data from the HOVON/SAKK AML 42A study. J Clin Oncol. 31 (31), 3889-3897 (2013).
  7. van der Velden, V. H. J., et al. Clinical significance of flowcytometric minimal residual disease detection in pediatric acute myeloid leukemia patients treated according to the DCOG ANLL97/MRC AML12 protocol. Leukemia. 24 (9), 1599-1606 (2010).
  8. Ossenkoppele, G., Schuurhuis, G. J. MRD in AML: time for redefinition of CR? Blood. 121 (12), 2166-2168 (2013).
  9. Feller, N., et al. MRD parameters using immunophenotypic detection methods are highly reliable in predicting survival in acute myeloid leukaemia. Leukemia. 18 (8), 1380-1390 (2004).
  10. Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9 (9), e107587 (2014).
  11. Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
  12. Paietta, E. Assessing minimal residual disease (MRD) in leukemia: a changing definition and concept? Bone Marrow Transplant. 29 (6), 459-465 (2002).
  13. Loken, M. R., et al. Residual disease detected by multidimensional flow cytometry signifies high relapse risk in patients with de novo acute myeloid leukemia: a report from Children's Oncology Group. Blood. 120 (8), 1581-1588 (2012).
  14. Zeijlemaker, W., et al. A simple one-tube assay for immunophenotypical quantification of leukemic stem cells in acute myeloid leukemia. Leukemia. 30 (2), 439-446 (2015).
  15. Guidance for Collection, Transport and Submission of Specimens for Ebola Virus Testing. , https://www.cdc.gov/vhf/ebola/healthcare-us/laboratories/specimens.html (2017).
  16. Bachas, C., et al. The role of minor subpopulations within the leukemic blast compartment of AML patients at initial diagnosis in the development of relapse. Leukemia. 26 (6), 1313-1320 (2012).
  17. Ravandi, F., et al. Persistence of minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry is highly prognostic in younger patients with acute myeloid leukemia. Cancer. 123 (3), 426-435 (2017).
  18. Hourigan, C. S., et al. Measurable residual disease testing in acute myeloid leukaemia. Leukemia. 31 (7), 1482-1490 (2017).

Tags

Kreftforskning problemet 133 akutt myelogen leukemi målbare gjenværende sykdom leukemic stamceller benmarg aspirasjon leukemi knytte immunophenotype fluorescens-aktivert cellen sorter analyse
Omfattende protokoll for å prøve og prosessen benmarg for å måle målbare gjenværende sykdom og Leukemic stamceller i akutt myelogen leukemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cloos, J., Harris, J. R., Janssen,… More

Cloos, J., Harris, J. R., Janssen, J. J. W. M., Kelder, A., Huang, F., Sijm, G., Vonk, M., Snel, A. N., Scheick, J. R., Scholten, W. J., Carbaat-Ham, J., Veldhuizen, D., Hanekamp, D., Oussoren-Brockhoff, Y. J. M., Kaspers, G. J. L., Schuurhuis, G. J., Sasser, A. K., Ossenkoppele, G. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. J. Vis. Exp. (133), e56386, doi:10.3791/56386 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter