Summary
En meget ren population af megakaryocytes kan fås fra ledningen blod-afledte CD34+ celler. En metode til CD34+ celle isolation og megakaryocyte differentiering er beskrevet her.
Abstract
Trombocyttal produktion forekommer hovedsagelig i knoglemarv i en proces kendt som thrombopoiesis. Under thrombopoiesis differentiere hæmatopoietisk stamceller til form trombocyt prækursorer kaldet megakaryocytes, der terminalt differentiere for at frigive trombocytter fra længe cytoplasmatisk processer betegnes proplatelets. Megakaryocytes er sjælden celler begrænset til knoglemarven og er derfor vanskelige at høste i tilstrækkeligt antal til laboratoriebrug. Effektiv produktion af menneskelige megakaryocytes kan være opnået i vitro ved dyrkning af CD34+ celler under passende forhold. Protokollen detaljeret her beskriver isolation af CD34+ celler ved magnetisk celle sortering fra navlestrengen blodprøver. De nødvendige skridt til at fremstille meget rene, moden megakaryocytes serumfrit betingelser er beskrevet. Også er oplysninger om fænotypiske analyser af megakaryocyte differentiering og bestemmelse af proplatelet dannelse og trombocyttal produktion. Effektorer, der påvirker megakaryocyte differentiering og/eller proplatelet dannelse, såsom anti-trombocyttal antistoffer eller thrombopoietin mimetics, kan føjes til kulturperler celler til at undersøge biologiske funktion.
Introduction
Isolation af et passende antal primære menneskelige megakaryocytes (MK) til almindelig laboratoriebrug er ikke mulig på grund af deres lave hyppighed i knoglemarven, hvor de udgør ~0.01% af nukleeret celler1. Et bekvemt alternativ er ex vivo ekspansion og differentiering af hæmatopoietisk stamceller og stamceller i overværelse af bestemte vækstfaktorer. En række af cytokiner herunder stamceller faktor (SCF, c-kit ligand) og interleukin (IL) -3 og IL-11 har været er ansat i kultur systemer til at producere MKs. Thrombopoietin (TPO) den mest effektive vækst og differentiering faktor for megakaryocytic kulturer og er effektiv, alene eller sammen med andre cytokiner, såsom SCF og IL-32. TPO kan handle på stamcelle befolkninger til at resultere i spredning og modning af MKs2.
MK producere trombocytter fra cytoplasmatisk fremspring kaldes proplatelets og in vivo ca 1 x 1011 blodplader er er dannet dagligt for at opretholde trombocyt tællinger af 150-400 x 109/L. trombocyt produktion i vitro op til 1000 -fold lavere end i vivo anslår3, og dette har givet anledning til talrige kultur betingelser brug af CD34+ hæmatopoietisk stamceller til at forbedre MK og trombocyttal produktion i vitro. Den oprindelige kilde til CD34+ celler til MK differentiering var humant perifert blod4. Andre cell kilder omfatter knoglemarven5,6, embryonale stamceller/induceret pluripotente stamceller (ESC/iPSC)7og navlestrengen blod (UCB)8,9,10 . Menneskelige knoglemarv CD34+ 11 og mus lineage negative knoglemarv celler5 producere MK og blodplader in vitro; ikke desto mindre, manglen tilgængelighed af menneskelige knoglemarv begrænser dets anvendelse som en kilde til CD34+ celler. Derimod repræsenterer ESC og iPSC en ubegrænset kilde til celler til in vitro- trombocyttal produktion. Trombocyttal produktion fra disse celler kræver feeder celler som murine OP9 celler og kultur længere. Trombocytter fremstillet i feeder-fri betingelser synes at være mindre funktionelle12. iPSC-afledte blodplader er tilbøjelige til at være til nytte i klinisk indstillinger, da de kan udvides til en stor skala. Denne proces kræver lentiviral-medieret transduktion af transkriptionsfaktorer og langsigtede celle kultur13.
UCB er en tilgængelig kilde til CD34+ celler, der let kan anvendes i forskning indstillinger. TPO alene kan fremme differentiering af ledningen blod-afledte CD34+ celler og dette giver anledning til meget ren, modne MKs uden behov for serum tilskud eller fælles kultur med feeder celler. Andre cytokiner som SCF kan nedsætte differentiering fra UCB CD34+ celler, mens Flt-3 ligand og IL-11 fremme produktionen af umodne megakaryocytes14. Denne protokol beskriver produktionen af yderst rene MK kulturer fra navlestrengsblod CD34+ celler i serumfrit betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol blev godkendt af den syd østlige Sydney menneskelige videnskabsetisk Komité og ratificeret af Universitet i New South Wales' menneskelige videnskabsetisk Komité. Navlestrengsblod opnået fra raske donorer blev leveret af den Sydney ledning blodbank (Sydney, NSW, Australien). Mængder af ca. 100 mL blev brugt til denne procedure.
Bemærk: Arbejde i en klasse II biosikkerhed kabinet ved hjælp af aseptisk teknik. Rense ydre af ledningen blod taske med 70% ethanol. Brug sterile instrumenter (saks, pincet) for denne procedure.
1. ledning blod celle forberedelse og Isolation af CD34+ celler
- Forberede sterile adskillelse buffer (SB) med fosfatbufferet saltopløsning (PBS), pH 7,2 og indeholdende 0,5% bovint serumalbumin og 2 mM EDTA.
- Der afpipetteres 10 mL af SB i en 50 mL konisk slange (et rør pr. 10 mL blod er påkrævet). Bruger en G18 stump kanyle monteret på en 10 mL sprøjte, trækker 10 mL af blodet fra posen og dispensere i 50 mL rør indeholdende 10 mL af SB.
- Tilsættes 15 mL lymfocyt adskillelse media (Se Tabel af materialer) til bunden af røret indeholder den fortyndede blod, oprettelse af to lag.
Bemærk: Dispensere media langsomt i bunden af røret skal undgå at blande de forskellige lag. - Der centrifugeres rør på 1.200 × g i 30 min. ved stuetemperatur (RT) med ingen pause og ingen acceleration.
- Overføre lag nær midten af røret med mononukleære celler (ca. 5-10 mL fra hver tube) ind i en ny 50 mL rør ved hjælp af Pasteurs pipette. Tilføje SB til hvert rør til en samlet maengde paa 50 mL.
- Der centrifugeres ved 400 × g i 10 min. ved RT. udsmid supernatanten.
- Resuspend celle pellets omhyggeligt med Pasteur pipette i 5-10 mL af SB. kombinere de suspenderede celler og bringe lydstyrken til 50 mL med SB.
- Tælle celler benytter Trypan blå farvning og en hemocytometer eller automatiseret celle counter (Se Tabel af materialer). For at bestemme procentdelen af CD34 celler+ i prøven, resuspend 2,5 × 105 celler i 100 µL af SB og plet ved at tilføje 10 µL af anti-CD34-PE antistof i 15-30 min. ved 4 ° C. Analysere ved flowcytometri (figur 1A).
- Centrifugeglas på 400 × g i 10 min. ved 4 ° C. Kassér supernatanten.
Bemærk: Hvis ikke krævede straks, mononukleære celler kan indefryses på dette stadium. - Resuspend celler i 300 µL af SB pr. 108 celler. Tilsæt 100 µL af FcR humant IgG (blokering reagens, se Tabel af materialer) og 100 µL af CD34 magnetiske perler pr. 108 celler. Bland forsigtigt og inkuberes ved 4 ° C i 30-40 min.
Bemærk: En enkelt cellesuspension er nødvendig (hvis det er nødvendigt, videregive cellerne selv en 30 µm filter før du tilføjer reagenser). Bruge reagens diskenheder beskrevet her for 108 celler eller mindre. For mere end 108 celler, skalere op reagenser (SB, blokerer løsning og CD34 magnetiske perler) i overensstemmelse hermed. - Forberede LS adskillelse kolonne under inkubationstiden ved at placere LS kolonne i en magnetiske indehaveren og vask med 3 mL af SB. udsmid overløbet.
Bemærk: LS adskillelse kolonner kan indlæses med op til 2 × 108 samlede celler. Mindre og større kolonner er tilgængelige. - Tilføj 5-10 mL af SB til celle blandingen og centrifugeres ved 400 × g i 10 min. supernatanten.
- Resuspend celler i 1,5 mL af SB og indlæse cellesuspension (1,5 mL) på kolonnen LS. Indsamle strømmen gennem de umærkede celler i en 15 mL collection tube (negative brøkdel #1). Lad væsken løbe og vaske kolonnen med 1,5 mL af SB.
- Læg de indsamlede flow gennem (3 mL) tilbage i kolonnen og indsamle gennemstrømningen i den samme 15 mL collection tube (negative brøkdel #1). Vaske kolonnen LS 3 gange med 3 mL af SB.
Bemærk: Hvis det er påkrævet, celler i den negative fraktion (12 mL) kan farves med anti-CD34 antistof at fastslå erobringen af CD34+ celler ved kolonnen LS. - Fjern kolonnen fra den magnetisk separator og skylle celler langsomt med en sprøjte stemplet ind i en ny 15 mL rør med 2 mL af SB.
- Placere kolonne tilbage på magnetisk separator og load celler 2 mL tilbage i kolonnen. Indsamle flow gennem og vask med 2 mL SB. Dette er den negative brøkdel #2 (4 mL).
- Fjerne LS kolonne fra magnetisk separator og tilsættes 2 mL af SB. Flush celler støt og fast med en sprøjte stemplet til at indsamle CD34+ celle brøkdel. Tælle celler benytter trypan blå farvning og en hemocytometer eller automatiseret celle counter.
- Centrifugeglasset med den positive fraktion på 400 × g i 15 min. ved 4 ° C. Supernatanten. Resuspend celler i serumfrit medier for CD34+ celler (SFM, se Tabel af materialer).
Bemærk: Hvis ikke krævede straks, celler kan fryses i flydende nitrogen på dette stadium.
2. renhed Check af isolerede CD34+ celler
- Pletten 2 x 104 celler fra den positive fraktion med 10 µL anti-CD34-PE antistof og 20 µL anti-CD45-PerCP antistof i 15 min. ved 4 ° C (brug en separat tube for isotype kontrolelementer) (figur 1B).
- Der tilsættes 1 mL af SB at vaske. Der centrifugeres ved 400 × g i 10 min. Resuspend pellet i 200 µL af SB.
- Flow cytometric analyse og gate befolkningens levende celle for at udelukke vragrester (figur 1B). Angiv porten for PE og PerCP positive befolkninger ved hjælp af PE og PerCP isotype kontrol (figur 1B) og bestemme procentdelen af CD34+/CD45+ celler.
3. megakaryocyte differentiering
- Frø 5 × 105 celler/mL CD34+ celler i 2 mL af SFM suppleret med 50 ng/mL rekombinant human thrombopoietin (rhTPO) pr. brønd i en 12-godt plade. Inkuber celler ved 37 ° C, 5% CO2 i en fugtig atmosfære. Hvis celler er sammenflydende, før de er nødvendige for analyse, høste cellerne og opdelt i flere brønde med friske medier og rhTPO.
Bemærk: To eller tre brønde skal være forberedt specielt til at overvåge differentiering på forskellige tidspunkter (fx, dage 7, 9 og 10). - Høste celler fra brøndene afsat til at overvåge differentiering uden at forstyrre cellerne i de andre brønde.
- Pletten celler med 20 µL anti-GPIIb/CD41-FITC antistof og 10 µL anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 antistof i en endelige rumfang af 100 µL. rør sæt op et kontrolelement ved hjælp af de respektive isotype kontrol antistoffer. Inkuber i 15-30 min. ved 4 ° C.
- Der tilsættes 1 mL af SB at vaske.
- Der tilsættes 1 mL af SB at vaske. Der centrifugeres ved 400 × g i 10 min. resuspenderes i 100 µL af SB og spin på et glas dias ved 1.000 x g i 5 min. Fix celler på dias ved at dyppe i methanol til 30 s. luft tørre, tilføje 20 µL af montering medier indeholdende DAPI (Se Tabel af materialer) , dække med en coverslip, og visualisere ved hjælp af en fluorescerende mikroskop (figur 2A).
- Vask med 2 mL PBS/0.1% triton-X 100 og centrifugeres ved 400 × g i 10 min., resuspend i 100 µL af den samme buffer og tilføje anti-mus IgG-Alexa 594 og anti-kanin IgG-Alexa 488 (1: 100). Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur, vask med 2 mL PBS/0.1% triton-X 100, resuspend i 100 µL af den samme buffer og tilføje 20 µL anti CD42b-APC. Derefter spin celler på glas dias, som beskrevet i trin 3.6.1 og forberede prøverne for mikroskopiske visualisering, som beskrevet i trin 3.6.1.
- Vask en gang med 1 mL af SB og resuspend pellet i 300 µL af hypotonic citrat buffer (1,25 mM natriumcitrat, 2,5 mM natriumchlorid, 3,5 mM dextrose) indeholdende 20 µg/ml propidium Iodid og 0,05% Triton-X 100. Inkuber i 15 min. ved 4 ° C beskyttet mod lys.
- Tilføje RNase til en endelig koncentration på 20 µg/mL og Inkuber i 30 min. ved 4 ° C beskyttet mod lys. Bestemme intensiteten af propidium Iodid ved flowcytometri ved at indsamle 30.000 til 50.000 begivenheder med befolkningens CD41-FITC+ (figur 2 c).
4. proplatelet optælling, trombocyt tælling og trombocyt aktivering
- Høste celler (fra trin 3.1) på dage 8 eller 9 af differentiering og frø på 1 × 104 celler/brønd i 48-godt plader i 200 µL af frisk SFM suppleret med 50 ng/mL rhTPO. Kultur i 5 dage ved 37 ° C, 5% CO2.
Bemærk: Til kvantitering formål, froe wells i tre eksemplarer. Denne lave tæthedsgrad er påkrævet for visualisering og optælling af proplatelet-bærende MK. Proplatelets normalt starte optræder efter 2 dage af kultur. Peak er mellem dage 4 og 5. - Tæl antallet af proplatelet-bærende MK i det hele godt på en inverteret lysmikroskop bruger 10 X eller 20 X mål.
Bemærk: En opvarmet (37 ° C) mikroskop fase er at foretrække, da at holde cellerne ved stuetemperatur i længere perioder forårsager svind af proplatelet-udvidelser. Proplatelets er observeret som lange extensions fra MK kroppen. Hver MK kan have flere proplatelet fremspring. Efterhånden som proplatelets udvikler, mindskes kroppen af MK i størrelse. - Høste celler og centrifugeres ved 400 x g i 10 min. ved stuetemperatur. Pletten celler med 20 µL-anti-humant CD41-FITC antistof, som beskrevet i trin 3.3 og 3.4. Beregne procentdelen af proplatelet-bærende MK (pbMK): pbMK (%) = [(Proplatelet-bærende MKs/godt) / (samlede CD41+ celler / godt)] x 100
- Hvis du vil tælle blodplader frigives i substratet, forsigtigt blandes cellerne med Pasteur pipette og indsamle 100 µL dage 14 eller 15 i kultur.
- Pletten med 20 µL-anti-humant CD41-FITC antistof for 20-30 min. ved 4 ° C. Oprette en kontrol rør ved hjælp af det respektive isotype kontrol antistof.
- Tilsæt 150 µL af SB og 50 µL af tælle perler.
- Flow cytometric analyse, indstille FSC og SSC til log skala. Brug normal menneskelig blodplader fra trombocyt-rich plasma farves med CD41-FITC som beskrevet i afsnit 4.4.1 sætte gating for blodplader (figur 3A).
- Analysere de farvede blodplader med tælle perler ved flowcytometri. Indsamle 1.000 arrangementer af tælle perler benytter FSC versus SSC scatter plot (figur 3A). Beregne antallet af blodplader baseret på CD41-FITC positive begivenheder (figur 3B) ved hjælp af formlen:
Blodplader pr. µL = [(antallet af CD41-FITC positive begivenheder)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/sample volumen)]
- For at analysere trombocyt aktivering, forsigtigt blandes cellerne med Pasteur pipette og indsamle 100 µL dage 14 eller 15 i kultur. Der tilsættes 1 mL af Tyrode's buffer (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 0,2 mM Na2HPO4, 12 mM NaHCO3, 5,5 mM D-glucose, pH 6,5) og centrifugeres ved 200 x g i 5 min at sammenpresse cellerne.
- Indsamle supernatanten og centrifugeres ved 800 x g i 10 min. til pellet trombocyt mellemstore partikler.
- Kassér supernatanten og resuspend i 100 µL af Tyrode's buffer. Tilføj 20 µL af PAC1-FITC antistof og adenosin ud (ADP) til en slutkoncentration på 20 µM. Incubate ved stuetemperatur i 20 min. analyser ved flowcytometri at bestemme procentdelen af FITC positive begivenheder. Brug frisk menneskelige blodplader behandles på samme måde som en positiv kontrol (figur 3 c).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol tillader tilberedning af yderst rene MK kulturer fra ledningen blod-afledte CD34+ celler. Procentdelen af CD34+ celler i ledningen blod er ca. 1,3%15 (figur 1A) og det samlede antal af mononukleære celler (trin 1.8) spænder fra 90-300 x 106 UCB pr. Renheden af CD34 +/ CD45 + celler efter isolation varierer fra 90 til 99% (figur 1B). MK (defineret som CD41+ celler) observeres tidligt i serumfrit CD34+ celle kulturer i overværelse af rhTPO. På dag 7, procentdelen af modne MK (CD41+ og CD42a+ celler) er normalt 30-40% (figur 1 c). De højeste niveauer af CD41+ og CD42a+ dobbelt positive celler (90-99%) er observeret mellem dage 10 og 12 af differentiering (figur 1 c). Variabiliteten observeret afhænger hovedsageligt ledningen blod kilde og renheden af CD34+/CD45+ celler isoleret i trin 1.17. Udbyttet af modne MK på dag 10 spænder fra 5-10 pr. input CD34+ celle. Modne MK (CD41+/CD42b+) observeret under fluorescerende mikroskopi er vist i figur 2A. Kulturperler MK vises som store, normalt multinucleated celler (figur 2A, pilespidser). MKS granuleret indhold var bestemt af vWf (grøn) og CD62p (p-selectin, rød) farvning (figur 2B). Ploidi distribution observeret i kulturperler MKs er vist i figur 2 c.
Proplatelets er lang, beaded fibre eller filamenter, der strækker sig fra MK kroppen. Proplatelets kan være flere hundrede mikrometer lang16 og indeholder brancher og udspilet regioner. Et karakteristisk proplatelet-bærende MK er illustreret i figur 2D. Procentdelen af proplatelet-bærende MK (pbMK) var 1,3 ± 0,17%.
Blodplader kan analyseres og tælles som beskrevet i protokollen. Som vist i figur 3B, falder de fleste blodplader i cellekultur supernatanten inden for den analytiske gate af perifere blodplader og er positive for trombocyt markør CD41 (figur 3B). Trombocyttal udbytte fra denne metode spænder fra 19 til 42 blodplader pr. MK. trombocytter fremstillet i kultur kan aktiveres ved trombocyttal agonister som ADP som fastsat af øget bindingen af aktivering-specifikke PAC1 monoklonalt antistof (figur 3 c) .
Figur 1: Flow flowcytometri parceller af CD34+ celle isolation og MK differentiering i kultur. (A) mononukleære celler (gated som vist i venstre panel) renset fra menneskelige navlestrengsblod (trin 1.8) var plettet med anti-CD34-PE antistof til at bestemme procentdelen af CD34+ celler i stikprøven (1,3%, højre panel). (B) efter separation, den positive fraktion (trin 1,17) var plettet med anti-CD34-PE og anti-CD45 PerCP antistoffer. Den beriget CD34+ befolkning er angivet i figur (98.1%, højre panel, øverste højre kvadrant). (C) fænotypiske analyser af MK opdelte i vitro fra CD34 + celler i 7 dage eller 11 dage blev farves med anti-CD41 og anti-CD42a antistoffer. Modne MK er positive for begge CD41+ og CD42a+ (øverste højre kvadrant). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: MK farvning, Ploidi og proplatelet dannelse i vitro. (A) fluorescerende billeder af dagen 11 MK farves med anti-CD41-PE og CD42b-APC antistoffer. Kerner blev farves med DAPI. Gul pilespids angiver multi nukleare MKs. skala bar, 30 µm. (B) fluorescerende billeder af dag 14 MK farves med anti vWf (grøn), anti-CD62p (rød) og anti-CD42b-APC (magenta) antistoffer. Kerner blev farves med DAPI. Skalalinjen, 15 µm (C) repræsentative gating strategi viser Ploidi distribution af CD41+ begivenheder. Grafen (nederste panel) viser den observerede distribution af Ploidi klasser (n = 4), fejllinjer, SD. (D) den karakteristiske morfologi af proplatelet-bærende MK er vist. MK kroppen er angivet med pilen. De lange cytoplasmatisk processer strækker sig fra MK (proplatelets) er angivet af pilespidser. Det kan være uklar på nogle områder/områder af se om én eller to MK producerer disse proplatelet extensions. Dette bør tælles som en proplatelet-bærende MK. billeder taget med en inverteret mikroskop, 10 X mål. Skalalinjen, 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Overflod af trombocytter fremstillet in vitro- og trombocyt aktivering. (A) menneskelige trombocytter fra trombocyt-rich plasma blev brugt til at angive den analytiske gate ved hjælp af log skala for frem og side scatter (venstre panel). Højre panel viser celler fra MK kulturer. Trombocytter fremstillet in vitro- er observeret i den analytiske gate defineret for menneskelige blodplader. Celler og tælle perler er angivet i figur. PLT, trombocyttal (B) trombocytter fremstillet in vitro- var farvet med anti-CD41 antistoffer. Menneskelige trombocytter fra trombocyt-rich plasma blev brugt til at angive analytiske porten ved hjælp af log skala for fremad og side scatter og sammenligne profil inden for CD41-FITC gate. C-FITC, FITC isotype kontrol (C) trombocyt aktivering efter behandling af ADP til en endelig koncentration på 20 µM. menneskelige trombocytter fra trombocyt-rich plasma blev brugt som control (øvre paneler). Trombocytter fremstillet i kultur er vist i de nederste del. Binding af PAC1 angiver antistof trombocyt aktivering. C-FITC, FITC isotype kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her egner sig til ensartet produktion af MK og blodplader i kultur fra navlestrengsblod. Disse celler kan bruges til at studere forskellige processer som effekten af lægemidler eller biologiske aktiviteter på MK spredning, differentiering, proplatelet dannelse og trombocyttal produktion.
En række dyrkningsmedier og cytokin kombinationer er blevet præsenteret i litteraturen. Tilsætning af cytokiner som stamceller faktor, Flt-3 ligand, IL-3 og IL-6 understøtter CD34+ celle spredning. Men denne ekspansion resulterer i reducerede MK renhed i kultur14. Den metode, der præsenteres her, ved hjælp af serum-frie medier og rhTPO alene, tillader ikke betydelig udvidelse af stamceller, men tillader unilineage megakaryocytic spredning og differentiering og ensartet produktion af MK (90-99% CD41+ CD42a+ dobbelt positive celler) uden forurening fra andre slægter. Den kultur for MK dannelse er 10-12 dage uden behov for støtte stromale eller feeder celler. Det sammenligner positivt med andre metoder, der kræver større kultur perioder (over 20 dage)17,18. Trombocyttal udbyttet af denne protokol er 19-42 blodplader pr. MK eller op til 420 blodplader pr. input CD34+ celle. De fleste protokoller resultere i lavere trombocyt udbytter18,19.
Selv om udbyttet er høje i forhold til andre metoder, store kilder af CD34 celler er nødvendige for at producere tilstrækkeligt antal blodplader til terapeutisk brug. Ledning blod MK modne til en lavere sats, er generelt mindre (af lavere Ploidi klasser), og har nedsat trombocyttal produktion kapacitet20. Ikke desto mindre friske UCB er generelt en mere tilgængelig ressource og dette repræsenterer en betydelig fordel for forskere. Andre metoder, der kan producere højere udbytter af MK og blodplader med terapeutiske mål har også været beskrevet13,17.
Der er nogle kilder til variation at overveje: A) kvaliteten af ledningen blod enhed. Kun ledningen blod indsamlet inden for 24 timer bør anvendes som en kilde til CD34+ celler. Ledning blod enheder indeholdende blodpropper bør også blive kasseret. B) procentdel af CD34+ celler i mononukleære celler brøkdel (trin 1.8): ved hjælp af mononukleære celler fraktioner med mindre end 0,3% CD34+ celler kan resultere i lave udbytter af forholdsvis lav renhed CD34+ celler. Disse celler er ikke anbefalet til MK differentiering. Det er vigtigt at lade den flydende drain af tyngdekraften kraft kun (fxtrin 1.13, 1,14, 1.16). I tilfælde af kolonne blokering anbefales det at fjerne kolonnen fra magneten, skubbe celler forsigtigt med sprøjte stemplet ind i et nyt rør og genindlæse på en ny afbalancerede kolonne.
En række betingelser påvirker trombocyt nummer og funktion. Trombocytopeni refererer til et markant fald i trombocyttal numre, der kan føre til ydre og indre blødninger. Auto-immune sygdomme som immune trombocytopeni (ITP) og narkotika-induceret thrombocytopeni (DITP) er velkendt årsager til trombocytopeni21,22. Andre immune sygdomme, såsom systemisk lupus erythematosus og reumatoid arthritis kan også have skadelige virkninger på blodplader. Ikke-immune årsager til trombocytopeni omfatter kræftbehandling, alvorlige traumer, infektioner, knoglemarv svigt og kirurgi. På grund af den høje udnyttelse af blodplader af patienter, der gennemgår kemoterapi eller modtager stamcelle transplantation, steget trombocyttal transfusion støt i de seneste årtier. MK og trombocyttal forskning vil uden tvivl bidrage til udvikling af stor skala trombocyt produktion til kliniske applikationer. Tilgængelighed af in vitro- producerede funktionelle blodplader ville forhindre blodplader mangel og tillade trombocyt transfusioner i ildfaste patienter. MK differentiering og trombocyttal produktion i vitro er vigtige værktøjer til undersøgelse og forståelse af patologiske betingelser og de fysiologiske mekanismer, der fører til trombocyt dannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender støtten fra den australske sundhed og Medical Research Council (project grant 1012409 knyttet til BHC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture Reagents | |||
| Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Serum-free media for CD34+ cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 Isolation Reagents | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL) |
| Sterile separation buffer (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry and Cell Staining Reagents | |||
| PE Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| PerCP mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 dilution |
| PerCP isotype control | BD Biosciences | 349044 | 1:10 dilution |
| FITC Mouse anti-Human CD41a | BD Biosciences | 340929 | Final antibody concentration 1:5 dilution. |
| APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody |
| Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal | Abcam | AB6994 | 1:200 dilution |
| V450 mouse anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 dilution |
| V450 isotype control | BD Biosciences | 580373 | 1:20 dilution |
| PAC1-FITC antibody | BD Biosciences | 340507 | 1:10 dilution |
| Anti CD62p mouse monoclonal | Abcam | AB6632 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 dilution |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype control antibody |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Counting beads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Smaller and larger columns are also commercially available |
| MidiMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile | In Vitro technologies | 352063 | |
| Glass slides | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Inverted microscope | Leica | DMIRB inverted microscope | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| Cell analyser | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cytospin centrifuge | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Cell analyser software | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
| Single cell analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Fluorescent microscope software | Zeiss | Zen 2 blue edition |
References
- Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
- Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells. Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).
- Reems, J. -A., Pineault, N., Sun, S. In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art. Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).
- Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional. Blood. 85 (2), 402-413 (1995).
- Perdomo, J., et al. A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production. J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).
- Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage. Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).
- Feng, Q., et al. Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells. Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).
- Bruno, S., et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution. Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).
- Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro. Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).
- Lev, P. R., et al. Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count. Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).
- Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells. Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).
- Lu, S. -J., et al. Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice. Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).
- Moreau, T., et al. Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming. Nature Commun. 7, 11208 (2016).
- De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood. Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem cells. 13 (2), Dayton, Ohio. 158-166 (1995).
- Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. Mechanics of proplatelet elaboration. J Thromb Haemost. 5, Suppl 1. 18-23 (2007).
- Matsunaga, T., et al. Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells. Stem cells. 24 (12), Dayton, Ohio. 2877-2887 (2006).
- Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds. Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).
- Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand. J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).
- Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation. Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).
- Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. Drug-induced Immune Thrombocytopenia. Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).
- Stasi, R., et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management. Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).
