Summary
Svært ren innbyggere megakaryocytes kan fås fra ledningen blod-avledet CD34+ celler. En metode for CD34+ celle isolasjon og megakaryocyte differensiering er beskrevet her.
Abstract
Blodplater produksjon forekommer hovedsakelig i benmargen i en prosess kjent som thrombopoiesis. Under thrombopoiesis skille blodkreft stamfar celler til skjemaet Platederivert forløpere kalt megakaryocytes, som uhelbredelig skiller for å løslate blodplater fra lenge cytoplasmatiske prosesser kalt proplatelets. Megakaryocytes er sjeldne celler begrenset til benmargen og er derfor vanskelig å høste i tilstrekkelig antall til laboratoriebruk. Effektiv produksjon av menneskelig megakaryocytes kan bli oppnådd i vitro ved dyrking CD34+ celler i riktig forhold. Protokollen detaljert her beskriver isolering av CD34+ celler av magnetiske celle sortering fra navlestreng blodprøver. De nødvendige skritt for å produsere svært ren, moden megakaryocytes under serum-free forhold er beskrevet. Detaljer om fenotypiske analyse av megakaryocyte differensiering og besluttsomhet for proplatelet formasjon og blodplater tilbys også. Effektor som påvirker megakaryocyte differensiering og/eller proplatelet formasjonen, som anti-Platederivert antistoffer eller thrombopoietin mimetics, kan legges til kulturperler celler å undersøke biologisk funksjon.
Introduction
Isolering av tilstrekkelig antall primære menneskelig megakaryocytes (MK) til vanlige laboratoriebruk er ikke gjennomførbart på grunn av deres lave frekvenser i benmargen, der de utgjør ~0.01% celler kjerne1. Et praktisk alternativ er ex vivo ekspansjon og differensiering av blodkreft stilk og progenitor celler i nærvær av bestemte vekstfaktorer. En rekke cytokiner inkludert stamcelleforskningen faktor (SCF, c-kit ligand) og interleukin (IL) -3 og IL-11 har vært er ansatt i kultur systemer å produsere MKs. Thrombopoietin (TPO) den mest effektive vekst og differensiering faktoren for megakaryocytic kulturer og er effektive alene eller sammen med andre cytokiner, slik som SCF og IL-3-2. TPO kan fungere på stammen celle populasjoner føre både spredning og modning av MKs2.
MK produsere blodplater fra cytoplasmatiske utstikkende deler kalt proplatelets og, i vivo, . ca 1 x 1011 blodplater er er dannet daglig for å opprettholde Platederivert tellinger av 150-400 x 109/l. Platederivert produksjon i vitro opptil 1000 -Brett lavere enn den i vivo estimerer3, og dette har gitt opphav til mange kultur vilkår bruker CD34+ blodkreft stamfar celler å forbedre MK og blodplater produksjon i vitro. Den opprinnelige kilden til CD34+ celler brukes for MK differensiering var menneskelig perifert blod4. Cellen kilder andre benmarg5,6, embryonale stamceller/indusert pluripotent stamceller (ESC/iPSC)7og navlestreng blod (UCB)8,9,10 . Human benmarg CD34+ 11 og mus avstamning negative benmarg celler5 produsere MK og blodplater i vitro; Likevel er mangelen på tilgjengelighet for human benmarg begrenser bruken som en kilde til CD34+ celler. Derimot representerer ESC og iPSC en ubegrenset kilde av celler for i vitro Platederivert produksjon. Blodplater produksjon fra disse cellene krever mater celler som murine OP9 celler og lengre kultur perioder. Blodplater-avledet mater-gratis forhold synes å være mindre funksjonelle12. iPSC-avledet blodplater er sannsynlig å være av bruk i klinisk siden de kan utvides til stor skala. Denne prosessen krever lentiviral-mediert signaltransduksjon transkripsjonsfaktorer og langsiktig celle kultur13.
UCB er et tilgjengelig CD34+ celler som lett kan brukes i forskning innstillingene. TPO alene kan fremme differensiering av ledningen blod-avledet CD34+ celler, og dette gir opphav til svært ren, moden MKs uten behov for serum kosttilskudd eller co kultur med mater celler. Andre cytokiner som SCF kan redusere differensiering fra UCB CD34+ celler, mens Flt-3 ligand og IL-11 fremme produksjon av umodne megakaryocytes14. Denne protokollen beskriver produksjon av svært ren MK kulturer fra ledningen blod CD34+ celler i serum-free forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen ble godkjent av det Sør Øst Sydney menneskelige forskning etikk og ratifisert av universitetet av New South Wales' menneskelige forskning etikk. Navlestrengsblod fra friske blodgivere ble levert av den Sydney Cord Blood Bank (Sydney, NSW, Australia). Mengder ca 100 mL ble brukt for denne prosedyren.
Merk: Arbeid i en klasse II biosafety kabinett med steril teknikk. Dekontaminere utsiden av ledningen blod sekken med 70% etanol. Bruke sterilt instrumenter (saks, pinsett) for denne prosedyren.
1. ledningen blod cellen forberedelse og isolering av CD34+ celler
- Forberede sterilt separasjon buffer (SB) med fosfat bufret saltvann (PBS), pH 7.2, og som inneholder 0,5% bovin serum albumin og 2 mM EDTA.
- Dispensere 10 mL av SB i en 50 mL konisk tube (en tube per 10 mL blod er nødvendig). Bruke en G18 sløv nål montert på en 10 mL sprøyte, trekke 10 mL blod fra posen og støte inn i 50 mL rørene som inneholder 10 mL av SB.
- Legge til 15 mL av lymfocytt separasjon media (se Tabell of Materials) til bunnen av røret som inneholder fortynnet blodet, oppretter to lag.
Merk: Dispensere media sakte på bunnen av røret for å unngå å blande de ulike lagene. - Sentrifuge rør på 1200 × g i 30 min ved romtemperatur (RT) med uten pause og uten akselerasjon.
- Overføre laget nær midten av røret som inneholder mononukleære celler (ca 5-10 mL fra hver rør) i en ny 50 mL tube med en Pasteur pipette. Legge til SB hver rør til et totalt volum på 50 mL.
- Sentrifuge 400 × g i 10 min på RT. Forkast nedbryting.
- Resuspend celle pellets med en Pasteur pipette i 5-10 mL SB. kombinere suspendert cellene og gi volum til 50 mL med SB.
- Telle celler Trypan blå flekker og en hemocytometer eller automatisert celle counter (se Tabell for materiale). Å finne ut prosentandelen av CD34+ celler i utvalget, resuspend 2.5 × 105 celler i 100 µL av SB og flekk ved å legge 10 µL anti-CD34-PE antistoff i 15-30 min på 4 ° C. Analyser av flowcytometri (figur 1A).
- Sentrifuger rør på 400 × g i 10 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
Merk: Hvis ikke nødvendig umiddelbart mononukleære celler kan fryses på dette stadiet. - Resuspend celler i 300 µL av SB per 108 celler. Legge til 100 µL av FcR menneskelige IgG (blokkerer reagens, se Tabellen for materiale) og 100 µL av CD34 magnetiske perler per 108 celler. Bland forsiktig og ruge på 4 ° C i 30-40 minutter.
Merk: En enkeltcelle suspensjon kreves (eventuelt høypassfilteret cellene selv en 30 µm ør reagenser). Bruk reagens volumene beskrevet her for 108 celler eller mindre. For mer enn 108 celler, skalere opp reagenser (SB, blokkerer løsning, og CD34 magnetiske perler) tilsvarende. - Forberede kolonnen LS separasjon under inkubasjonstiden ved å plassere kolonnen LS i en magnetisk holder og vask med 3 mL SB. Forkast avløpsvann.
Merk: LS separasjon kolonner kan lastes opp til 2 × 108 totalt cellene. Mindre og større kolonner er tilgjengelige. - Legge 5-10 mL SB til celle blanding og sentrifuge 400 × g for 10 min. kast nedbryting.
- Resuspend celler i 1,5 mL SB og laste celle suspensjon (1,5 mL) på kolonnen LS. Samle flyten gjennom inneholder umerkede cellene i en 15 mL samling rør (negativ brøkdel #1). La væsken renne og vaske kolonnen med 1,5 mL SB.
- Laste inn samlet flyten gjennom (3 mL) tilbake i kolonnen og samle flyten gjennom i samme 15 mL samling rør (negativ brøkdel #1). Vask kolonnen LS 3 ganger med 3 mL SB.
Merk: Eventuelt cellene i negativ fraksjonen (12 mL) kan være farget med anti-CD34 mot konstatere erobringen av CD34+ celler av kolonnen LS. - Fjerne kolonnen fra magnetiske skilletegnet og flush celler sakte med en sprøytestempelet i en ny 15 mL tube med 2 mL SB.
- Plasser kolonnen på magnetiske skilletegn og laste den 2 mL av celler tilbake i kolonnen. Samle flyten gjennom og vask med 2 mL SB. Dette er en negativ brøkdel #2 (4 mL).
- Fjerne LS kolonne fra magnetiske skilletegn og legge 2 mL SB. Flush celler jevnt og fast med en sprøytestempelet å samle CD34+ celle brøkdel. Telle celler trypan blå flekker og en hemocytometer eller automatisert celle telleren.
- Sentrifuger rør med positiv brøken 400 × g i 15 min på 4 ° C. Kast nedbryting. Resuspend celler i serum-frie medier for CD34+ celler (SFM, se Tabellen for materiale).
Merk: Hvis ikke nødvendig umiddelbart, celler kan fryses i flytende nitrogen på dette stadiet.
2. renheten sjekk av isolerte CD34+ celler
- Stain 2 x 104 celler fra positiv brøkdel med 10 µL anti-CD34-PE antistoff og 20 µL anti-CD45-PerCP antistoffer i 15 min på 4 ° C (bruk et eget rør for isotype kontroller) (figur 1B).
- Legg 1 mL av SB å vaske. Sentrifuge 400 × g for 10 min. Resuspend pellets i 200 µL av SB.
- Utføre flyt cytometric analyse og gate levende celle befolkningen å utelate rusk (figur 1B). Angi porten for PE og PerCP positive bestander hjelp av PE og PerCP isotype kontroller (figur 1B) og finne ut prosentandelen av CD34+/CD45+ celler.
3. megakaryocyte differensiering
- Frø 5 × 105 celler/mL CD34+ celler i 2 mL SFM supplert med 50 ng/mL rekombinant menneskelig thrombopoietin (rhTPO) per brønn i en 12-vel plate. Inkuber celler ved 37 ° C, 5% CO2 i en fuktet atmosfære. Hvis celler confluent før de er nødvendige for analyse, høste celler og delt inn i flere brønner med fersk media og rhTPO.
Merk: To eller tre brønner bør være forberedt på å kontrollere differensiering på ulike tidspunkt (f.eks, 7, 9 og 10). - Høste celler fra brønnene avsatt til å overvåke differensiering uten å forstyrre cellene i andre brønnene.
- Flekk celler med 20 µL anti-GPIIb/CD41-FITC antistoffer og 10 µL anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 antistoff i et siste volum på 100 µL. rør satt opp en kontroll ved hjelp av respektive isotype kontroll antistoffer. Inkuber i 15-30 min på 4 ° C.
- Legg 1 mL av SB å vaske.
- Legg 1 mL av SB å vaske. Sentrifuger 400 × g for 10 min. Resuspend pellets i 100 µL av SB og spinn på et glass lysbilde 1000 x g for 5 min. fastsette celler på lysbildet ved å dyppe i metanol for 30 s. luften tørr, legge til 20 µL av montering mediet som inneholder DAPI (se Tabell for materiale) , dekk med en dekkglassvæske, og visualisere bruke fluorescerende mikroskop (figur 2A).
- Vask med 2 mL PBS/0.1% triton-X 100 sentrifuge 400 × g i 10 min, resuspend i 100 µL av samme bufferen og legge anti-musen IgG-Alexa 594 og anti-kanin IgG-Alexa 488 (1: 100). Inkuber i 30 min ved romtemperatur, vask med 2 mL PBS/0.1% triton-X 100, resuspend i 100 µL av samme bufferen og legge til 20 µL av anti CD42b-APC. Så spinn cellene på glass lysbilder som beskrevet i trinn 3.6.1 og forberede prøver mikroskopiske visualisering som beskrevet i trinn 3.6.1.
- Vask en gang med 1 mL av SB og resuspend pellets i 300 µL hypotonisk citrate buffer (1,25 mM natriumsitrat, 2,5 natriumklorid, 3,5 druesukker) inneholder 20 µg/ml propidium iodide og 0,05% Triton-X 100. Inkuber i 15 min på 4 ° C beskyttet mot lyset.
- Legge til RNase i en endelig konsentrasjon på 20 µg/mL og ruge i 30 min på 4 ° C beskyttet mot lyset. Bestemme intensiteten av propidium iodide av flowcytometri ved å samle 30 000 til 50 000 hendelser av CD41-FITC+ befolkningen (figur 2C).
4. proplatelet teller, blodplater opplisting og blodplater aktivisering
- Høste celler (fra trinn 3.1) dager 8 eller 9 av differensiering og frø på 1 × 104 celler/godt i 48-og plater i 200 µL av fersk SFM supplert med 50 ng/mL rhTPO. Kultur i 5 dager på 37 ° C, 5% CO2.
Merk: For kvantifisering formål, frø brønner i tre eksemplarer. Dette lav tetthet kreves for visualisering og telling av proplatelet-bærende MK. Proplatelets vanligvis starte vises etter 2 dager med kultur. Toppen er mellom dager 4 og 5. - Antall proplatelet-bærende MK hele brønnen på en invertert lys mikroskop med 10 X eller 20 X mål.
Merk: En oppvarmet (37 ° C) mikroskop fasen er å foretrekke, siden å holde cellene i romtemperatur over lengre forårsaker krymping av proplatelet utvidelser. Proplatelets er observert som lenge servertillegg fra MK kroppen. Hver MK kan ha flere proplatelet utstikkende deler. Som proplatelets utvikle, reduseres kroppen til MK i størrelse. - Høste celler og sentrifuge 400 x g i 10 min ved romtemperatur. Stain celler med 20 µL anti-menneskelige CD41-FITC antistoff, som beskrevet i trinn 3.3 og 3.4. Beregning av proplatelet-bærende MK (pbMK): pbMK (%) = [(Proplatelet-bærende MKs/vel) / (totalt CD41+ celler / vel)] x 100
- Hvis du vil telle blodplater utgitt til kultur medium, forsiktig bland cellene med en Pasteur pipette og samle 100 µL dager 14 eller 15 kultur.
- Flekker med 20 µL anti-CD41-FITC antistoff i 20-30 minutter på 4 ° C. Definere en kontroll tube med respektive isotype kontroll antistoffer.
- Tilsett 150 µL av SB og 50 µL av teller perler.
- Cytometric analyse, sette FSC og SSC logge skala for flyt. Bruk normal menneskelig blodplater fra blodplater-rich plasma farget med CD41-FITC som beskrevet i delen 4.4.1 sette gating for blodplater (figur 3A).
- Analysere farget blodplater med telling perler av flowcytometri. Samle 1000 hendelser for å telle perler bruker FSC versus SSC spredningsdiagram (figur 3A). Beregne antall blodplater basert på CD41-FITC positive hendelser (figur 3B) ved hjelp av formelen:
Blodplater per µL = [(antall CD41-FITC positive hendelser)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/prøve volum)]
- Analysere Platederivert aktivisering, forsiktig bland cellene med en Pasteur pipette og samle 100 µL dager 14 eller 15 kultur. Legg 1 mL av Tyrode's buffer (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2 0.2 mM Na2HPO4, 12 mM NaHCO3, 5,5 D-glukose, pH 6,5) og sentrifuger 200 x g for 5 min til pellets celler.
- Samle nedbryting og sentrifuger 800 x g for 10 min å pellets Platederivert størrelse partikler.
- Forkast nedbryting og resuspend i 100 µL Tyrodes bufferen. Legge til 20 µL av PAC1-FITC antistoffer og adenosindifosfat (ADP) i en siste konsentrasjon på 20 µM. Incubate ved romtemperatur for 20 min. analyser av flowcytometri å finne ut prosentandelen av FITC positive hendelser. Bruke friske menneskelige blodplater behandlet på samme måte som en positiv kontroll (Figur 3 c).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen gjør at utarbeidelsen av svært ren MK kulturer fra ledningen blod-avledet CD34+ celler. Andelen CD34+ celler i ledningen blod er ca 1,3%15 (figur 1A) og antall mononukleære celler (trinn 1.8) varierer fra 90-300 x 106 per UCB enhet. Renheten av CD34 / CD45 + celler etter isolasjon varierer fra 90 til 99% (figur 1B). MK (definert som CD41+ celler) er observert tidlig i serum-free CD34+ celle kulturer i nærvær av rhTPO. På dag 7, prosentandelen av modne MK (CD41+ og CD42a+ celler) er vanligvis 30-40% (figur 1 c). De høyeste nivåene av CD41+ og CD42a+ dobbel positiv celler (90-99%) er observert mellom dager 10 og 12 av differensiering (figur 1 c). Variasjon observert avhenger hovedsakelig ledningen blod kilden og renheten av CD34+/CD45+ celler isolert i trinn 1.17. Avkastningen av modne MK på dag 10 varierer fra 5-10 per inngang CD34+ celle. Eldre MK (CD41+/CD42b+) observert under fluorescerende mikroskopi er vist i figur 2A. Kultivert MK vises som store, vanligvis multinucleated celler (figur 2A, pilspisser). MKS detaljert innhold ble bestemt av vWf (grønn) og CD62p (p selectin, rød) flekker (figur 2B). Ploidy distribusjon i kulturperler MKs vises i figur 2C.
Proplatelets er lang, beaded fiber eller filamenter som strekker seg fra MK kroppen. Proplatelets kan være flere hundre mikrometer lang16 og inneholder grener og distended regioner. En karakteristisk proplatelet-bærende MK er illustrert i figur 2D. Prosentandelen av proplatelet-bærende MK (pbMK) var 1,3 ± 0,17%.
Blodplater kan analyseres og regnet som beskrevet i protokollen. Som vist i figur 3B, innenfor de fleste blodplater i cellekultur supernatant analytisk porten av eksterne blodplater og er positivt for Platederivert markøren CD41 (figur 3B). Blodplater avkastningen fra denne metoden varierer fra 19 til 42 blodplater per MK. blodplater produsert i kultur kan aktiveres av blodplater agonister som ADP som økt binding av aktivisering-spesifikke PAC1 monoklonalt antistoff (Figur 3 c) .
Figur 1: Flow cytometri tomter CD34+ isolasjon og MK differensiering i kultur. (A) mononukleære celler (port som vises i venstre panel) renset fra menneskelige ledningen blod (trinn 1.8) var farget med anti-CD34-PE antistoffer til å angi prosentandelen av CD34+ celler i utvalget (1,3%, høyre panel). (B) etter separasjon, positiv brøken (trinn 1.17) var farget med anti-CD34-PE og anti-CD45 PerCP antistoffer. Den beriket CD34+ befolkningen angis i figuren (98.1%, høyre panel, øvre høyre kvadrant). (C) fenotypiske analyse av MK differensiert i vitro fra CD34 + celler i 7 dager eller 11 dager var farget med anti-CD41 og anti-CD42a antistoffer. Eldre MK er positivt for begge CD41+ og CD42a+ (øvre høyre kvadrant). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: MK flekker, ploidy og proplatelet formasjon i vitro. (A) fluorescerende bilder av dag 11 MK med anti-CD41-PE og CD42b-APC antistoffer. Kjerner var farget med DAPI. Gul pilspiss angir flere kjernefysiske MKs. skala bar, 30 µm. (B) fluorescerende bilder av dag 14 MK beiset med anti vWf (grønn), anti CD62p (rød) og anti-CD42b-APC (rosa) antistoffer. Kjerner var farget med DAPI. Skala bar, 15 µm (C) representant gating strategi viser ploidy distribusjon av CD41+ hendelser. Grafen (nedre panel) viser observert fordelingen av ploidy klasser (n = 4), feil barer, SD. (D) karakteristisk morfologi av proplatelet-bærende MK vises. MK kroppen er angitt med pilen. Lenge cytoplasmatiske prosesser fra MK (proplatelets) angis med pilspisser. Det kan være uklart i enkelte områder/felt av enten en eller to MK produserer disse proplatelet utvidelser. Dette bør bli regnet som en proplatelet-bærende MK. bilder tatt med en invertert mikroskop, 10 X mål. Skala Bar, 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Overflod av blodplater produsert i vitro og blodplater aktivisering. (A) Human blodplater fra blodplater-rich plasma ble brukt til å angi analytisk porten med logaritmisk skala for fremover og side xy (venstre panel). Panelet til høyre viser celler fra MK kulturer. Blodplater produsert i vitro er observert i analytisk porten definert for menneskelig blodplater. Celler og telling perler angis i figuren. PLT, blodplater (B) blodplater produsert i vitro var farget med anti-CD41 antistoff. Menneskelige blodplater fra blodplater-rich plasma ble brukt å angi analytisk porten med logaritmisk skala for fremover og siden scatter og sammenligne profilen i CD41-FITC gate. C-FITC, FITC isotype kontroll (C) Platederivert etter behandling av ADP til en siste konsentrasjon på 20 µM. menneskelige blodplater fra blodplater-rich plasma ble brukt som kontroll (øvre panel). Blodplater produsert i kultur vises i den nedre paneler. Binding av PAC1 angir antistoff Platederivert aktivisering. C-FITC, FITC isotype kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her er egnet for konsekvent produksjon av MK og blodplater i kultur fra navlestrengsblod. Disse cellene kan brukes å studere ulike prosesser som effekten av legemidler eller biologiske aktiviteter på MK spredning, differensiering, proplatelet formasjon og blodplater produksjon.
En rekke kultur medier og cytokin kombinasjoner har blitt presentert i litteraturen. Tillegg av cytokiner som stilk cellen faktor, Flt-3 ligand, IL-3 og IL-6 støtter CD34+ celle spredning. Men resulterer denne ekspansjonen i redusert MK renhet i kultur-14. Metoden som presenteres her, serum-frie medier og rhTPO alene, tillater ikke betydelig utvidelse av progenitor celler, men tillater unilineage megakaryocytic spredning og differensiering og konsekvent produksjon av MK (90-99% CD41+ CD42a+ dobbel positiv celler) uten forurensning fra andre linjene. Kultur perioden for MK-formasjonen er 10 til 12 dager uten behov for støtte stromal eller mater celler. Dette sammenligner gunstig med andre metoder som krever større kultur perioder (over 20 dager)17,18. Blodplater avkastningen fra nåværende protokollen er 19-42 blodplater per MK eller 420 blodplater per inngang CD34+ celle. De fleste protokoller resulterer i lavere Platederivert gir18,19.
Selv om avkastningen er høy i forhold til andre metoder, for store kilder av CD34 celler å produsere nok antall blodplater for terapeutisk bruk. Ledningen blod MK moden til en lavere pris, er generelt mindre (av lavere ploidy klasser) og har redusert Platederivert produksjon kapasitet20. Likevel frisk UCB er vanligvis en mer tilgjengelig ressurs, og dette representerer en betydelig fordel for forskere. Andre metoder som kan gi høyere avkastning MK og blodplater med terapeutiske mål har også vært beskrevet13,17.
Det er noen kilder til variasjon å vurdere: A) kvaliteten på ledningen blod enheten. Bare ledningen blod samles innen 24 timer skal brukes som en kilde til CD34+ celler. Ledningen blod enheter som inneholder clots skal også forkastes. B) andelen CD34+ celler i mononukleære celle fraksjonen (trinn 1.8): bruk av mononukleære celle brøker med mindre enn 0,3% CD34+ celler kan føre lav avkastning relativt lav renhet CD34+ celler. Disse cellene er ikke anbefalt for MK differensiering. Det er viktig å la væsken renne av tyngdekraften bare (f.ekstrinn 1.13, 1.14, 1,16). Hvis kolonnen blokkering, er det anbefalt å fjerne kolonnen fra magneten presse cellene forsiktig med sprøytestempelet i en ny tube og laste på en ny equilibrated kolonne.
En rekke forhold påvirker Platederivert tall og funksjon. Trombocytopeni refererer til en markant nedgang i blodplater tall som kan føre til ekstern og intern blødninger. Auto-immune forhold som immun trombocytopeni (ITP) og narkotikainduserte trombocytopeni (DITP) er kjente årsaker til trombocytopeni21,22. Andre immune sykdommer som systemisk lupus erythematosus og revmatoid artritt kan også ha skadevirkninger blodplater. Ikke-immune årsakene til trombocytopeni inkluderer kreftbehandling, alvorlige traumer, infeksjoner, benmarg feil og kirurgi. På grunn av høy utnyttelse av blodplater av pasienter som gjennomgår kjemoterapi eller mottar stilk cellen transplantasjon, har trobmocyttransfusjon stadig økt de siste tiårene. MK og blodplater forskning vil utvilsomt hjelpe utviklingen av storskala Platederivert produksjon for klinisk bruk. Tilgjengeligheten av i vitro produsert funksjonelle blodplater kan forhindre Platederivert knapphet og tillate Platederivert blodoverføringer i ildfast pasienter. MK differensiering og blodplater produksjon i vitro er viktige verktøy for studier og forståelse av både pathological betingelser og fysiologiske mekanismene som fører til dannelse av blodplater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne bekrefter støtte av australske Health and Medical Research Council (prosjekt stipend 1012409 koblet til BHC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture Reagents | |||
| Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Serum-free media for CD34+ cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 Isolation Reagents | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL) |
| Sterile separation buffer (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry and Cell Staining Reagents | |||
| PE Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| PerCP mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 dilution |
| PerCP isotype control | BD Biosciences | 349044 | 1:10 dilution |
| FITC Mouse anti-Human CD41a | BD Biosciences | 340929 | Final antibody concentration 1:5 dilution. |
| APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody |
| Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal | Abcam | AB6994 | 1:200 dilution |
| V450 mouse anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 dilution |
| V450 isotype control | BD Biosciences | 580373 | 1:20 dilution |
| PAC1-FITC antibody | BD Biosciences | 340507 | 1:10 dilution |
| Anti CD62p mouse monoclonal | Abcam | AB6632 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 dilution |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype control antibody |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Counting beads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Smaller and larger columns are also commercially available |
| MidiMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile | In Vitro technologies | 352063 | |
| Glass slides | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Inverted microscope | Leica | DMIRB inverted microscope | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| Cell analyser | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cytospin centrifuge | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Cell analyser software | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
| Single cell analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Fluorescent microscope software | Zeiss | Zen 2 blue edition |
References
- Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
- Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells. Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).
- Reems, J. -A., Pineault, N., Sun, S. In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art. Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).
- Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional. Blood. 85 (2), 402-413 (1995).
- Perdomo, J., et al. A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production. J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).
- Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage. Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).
- Feng, Q., et al. Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells. Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).
- Bruno, S., et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution. Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).
- Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro. Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).
- Lev, P. R., et al. Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count. Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).
- Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells. Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).
- Lu, S. -J., et al. Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice. Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).
- Moreau, T., et al. Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming. Nature Commun. 7, 11208 (2016).
- De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood. Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem cells. 13 (2), Dayton, Ohio. 158-166 (1995).
- Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. Mechanics of proplatelet elaboration. J Thromb Haemost. 5, Suppl 1. 18-23 (2007).
- Matsunaga, T., et al. Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells. Stem cells. 24 (12), Dayton, Ohio. 2877-2887 (2006).
- Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds. Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).
- Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand. J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).
- Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation. Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).
- Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. Drug-induced Immune Thrombocytopenia. Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).
- Stasi, R., et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management. Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).
