Summary
En ny teknik til hurtig antigen visning på en bakteriel overflade præsenteres, som indebærer overflade biotinylation efterfulgt af udsættelse for proteiner af interesse i fusion med monomere begærlighed. Lastning BCG med udvalgte antigener med held forbedrer sin immunogenicitet, tyder på, at overflade dekoration kan erstatte traditionelle genetiske metoder.
Abstract
Tuberkulose (TB) er en alvorlig infektionssygdom og kun tilgængelig vaccine M. bovis bacillus Calmette Guérin (BCG) er sikker og effektiv til beskyttelse mod børns svær TB meningitis og nogle former for formidlet TB, men undlader at beskytte mod pulmonal TB, som er den mest udbredte form for sygdommen. Lovende strategier til at forbedre BCG i øjeblikket stole enten på sin transformation med gener kodning immundominant M. tuberkulose (Mtb)-specifikke antigener og/eller komplementering med gener kodning Co-faktorer, som ville stimulere antigen præsentere celler. Store begrænsninger for disse strategier omfatter lav effektivitet, lave stabilitet og udtryk vektorer usikker sikkerhedsniveau. I denne undersøgelse præsenterer vi en alternativ tilgang til forbedring af vaccine, som består af BCG komplementering med eksogene proteiner af interesse på overfladen af bakterier, i stedet for transformation med plasmider kodning tilsvarende gener. Først, proteiner af interesse er udtrykt i fusion med monomere begærlighed i standard E. coli udtryk systemer og derefter bruges til at dekorere overfladen af biotinylated BCG. Dyreforsøg ved hjælp af BCG overflade dekoreret med surrogat ægalbumin antigen viser, at den modificerede bakterien er fuldt immunogen og i stand til at inducere specifikke T-celle svar. Alt støtte data præsenteres her kraftigt en roman og effektiv metode for omformningen den nuværende BCG-vaccine, der erstatter den møjsommelige konventionelle tilgang af komplementering med eksogene nukleinsyrer.
Introduction
Forskellige strategier er blevet foreslået at erstatte den nuværende TB vaccine BCG, herunder protein adjuverende systemer, viral vektoriserede teknologier, svækkede levende M.tb stammer og genetisk modificerede stammer, BCG, enten for at indføre gener over udtrykker BCG antigener, der ikke er tilstrækkeligt til udtryk under infektion1 eller Mtb-specifikke antigener ikke forekommer i BCG2. Genteknologi, står dog over for mange hindringer herunder den usikre niveau af sikkerhed, den tidskrævende proces og den lave effektivitet af udtryk vektorer4,5. Med hensyn til forbedring af BCG, en alternativ tilgang er nødvendig for at forbedre immunogenicitet uden behov for usikre genetiske vekslen.
I denne undersøgelse introducerer vi en roman strategi for visning af rekombinante proteiner af interesse på BCG cellens overflade, der er baseret på den velkendte høj-affinitet begærlighed interaktion med biotin. Denne tilgang giver mulighed for hurtig og reproducerbare fastgørelse af rekombinant begærlighed fusion proteiner på overfladen af biotinylated BCG, der letter bred manipulationer af BCG at opnå maksimal forbedring af dets effektivitet samtidig opretholde sin fremragende sikkerhed optage, observeret i løbet af årtier af brug.
Avidin affinitet for biotin er meget høj (Kd = 10−15 M) og når dannet, biotin-begærlighed komplekset er meget stabil og kan kun afbrydes under denatureringen betingelser6. Dog for denne type af interaktion til at tjene som en gene overførsel metode alternativ, er langsigtede men reversible visning af rekombinante proteiner nødvendige. Derfor indførte vi her en lav affinitet monomere begærlighed (Kd = 10−7 M), fører til reversibel udgivelsen af protein fra overfladen dekoreret BCG engang indtagne inde antigen præsentere celler. For at give en proof of concept, vi har testet denne metode bruger et monomere begærlighed kimære protein svarende til et surrogat antigen stammer fra ægalbumin (æg)7,8. Resultaterne viste, at BCG cellens overflade kan er være dekoreret nemt og hurtigt med monomere begærlighed fusion proteiner og at denne binding til BCG overflade er stabil og reproducerbar uden påviselige ændringer i bakteriel vækst og overlevelse. Også, vi fandt at BCG dekoreret med monomere begærlighed sammensmeltet med æg (AviOVA) kan fremkalde en svarer til induceret af BCG immunrespons genetisk udtrykker den samme antigen både in vitro- og in vivo. Denne teknologi af reversibel visning af proteiner af interesse på bakteriel overfladen er derfor en effektiv erstatning for traditionelle gen overførsel metoder og kan skabe en platform for bred manipulationer af BCG og yderligere programmer i vaccine udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrene blev opretholdt i henhold til protokoller godkendt af Animal Care og brug udvalg på University of British Columbia. Forsøg blev godkendt af Animal Care og brug udvalg og udført efter den canadiske Rådet om dyrs pleje retningslinjer. Forsikring om dyrs velfærd antallet er A11-0247.
1. generation af monomere begærlighed Fusion proteiner udtrykker plasmider
- Sub klon monomere begærlighed sekvens12 i pDEST17 plasmid mellem de "CTC" og "GAA" websteder, hvilket svarer til 133-134bp. (dvs.mellem 6-histag og pDEST17 Attr1 rekombination site) at opnå p17-Avi.
Bemærk: Monomere begærlighed DNA sekvens er vist nedenfor. De tre mutationer indført i wild-type begærlighed at opnå monomere begærlighed er vist i fed tegn.
gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc
agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
AogGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga - Design primere flankeret med AttB1 og AttB2 lokaliteter svarende til æg polypeptid757-1035 (-Ab- og H-2_Kb-begrænset epitoper) DNA-sekvens. Primer sekvenser er: Attb1-æg
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT og Attb2-æg
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 og Attb2 sekvenser er fed).- PCR-Forstærk æg polypeptid757-1035 DNA-sekvens med primere ovenfor, der bruger pUC57-æg plasmid som en skabelon.
- Klon PCR-produkter til pDONR-221 gennem en lokationsspecifik i vitro rekombination reaktion (fxBP Clonase) at få pDONR-æg.
- Overføre gen af interesse i p17-Avi ved hjælp af LR Clonase reaktion for at opnå p17-Avi-æg.
Bemærk: Oplysninger om BP og LR rekombination kloning, se producentens manual.
2. monomere begærlighed Fusion Protein udtryk, rensning, og hvorved man genfolder
- Omdanne p17-Avi-æg plasmid til E. coli BL21 og fremkalde 250 mL af E. coli BL21 kultur med IPTG (0,1 M) i 3 timer ved 37 ° C.
-
Lysis af bakterier og inklusion organer oploesning
- Pellet induceret BL21 kultur 250 mL af 30 min af centrifugering på 4.000 x g og ved 4 ° C.
- Indsamle pellets i 10 mL af lysisbuffer (50 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, 6 M guanidin-HCL, pH 1,5-2,5) og Inkuber i 15 min. ved 95 ° C. Der inkuberes natten over ved stuetemperatur på en rotator.
- Centrifuge 30 min på 15.000 x g og 4 ° C og indsamle supernatanten.
-
Rense Avi-æg fra supernatanten (Solubilized optagelse organer brøkdel) ved hjælp af Ni-NTA kolonner.
- Fortynd optagelse organer 1:2 med lysisbuffer.
- Brug 4 mL af Ni-NTA harpiks pr. 250 mL af kultur-afledte optagelse organer.
- Vask 3 x med 10 mL af lysisbuffer (pH 7,0).
- Elueres med 10 mL af eluering buffer (lysis buffer pH 7,0 med 250 mM imidazol).
- Refold elueret protein af gradvis fortynding (1:10) og hurtige vortexing i Tris buffer (pH 7,5) indeholdende 1 mM DTT, 200 mM NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0,5 mM Tween 80, 500 mM arginin og 200 mM NaCl i 30 min. ved stuetemperatur.
- De-salt og buffer exchange refolded protein fra Tris buffer i PBS med protein koncentratorer ifølge producentens protokoller.
- Fjerne aggregater ved centrifugering for 30 min på 3.500 x g og 4 ° C, og gemme delprøver af opløseligt protein ved-20 ° C.
3. Biotinylation af BCG cellens overflade
- Vokse BCG i Middlebrook 7H 9 bouillon med 10% OADC (oliesyre, albumin og dextrose løsning) og 0,05% Tween 80 ved 37 ° C på en shaker platform på 50 rpm indtil OD = 0,5-1.
Bemærk: BCG er en biosikkerhed niveau 2 patogen og alle eksperimenter vedrørende BCG bør ske i et kabinet med passende personlige værnemidler biosikkerhed. - Vask 109 BCG 3 gange med 500 µL af iskold endotoxin gratis PBS plus 0,1% Tween80 (PBST) (pH 8.0). Suspendere BCG pellet i sterile endotoxin gratis PBS.
-
Umiddelbart før anvendelsen, forberede 1 mL af 10 mM Sulfo-NHS SS biotin i sterile filtreret vand.
- Inkuber bakterier med 1 mL 0,5 mm af Sulfo-NHS SS biotin ved stuetemperatur i 30 min.
-
Vask mærket bakterier 3 gange med 500 µL af Ice kolde PBST at fjerne ikke-reagerede biotinylation reagens.
- Genopslæmmes pellet i 1 mL PBST.
-
For at vurdere biotinylation effektivitet, pletten 108 biotinylated BCG med Streptavidin-FITC (1: 100, 25 µL) ved stuetemperatur i 20 min.
- Inkuber farvede bakterier i 1 mL 2% PFA i 20 min. ved stuetemperatur og derefter undersøge niveauet af biotinylation ved flow flowcytometri analyse.
4. Fænotypen af Biotinylated mykobakterier: vækst og overlevelse
-
Vokse BCG stammer i Middlebrook 7H 9 bouillon med 10% OADC (oliesyre, albumin og dextrose løsning) og 0,05% Tween 80 ved 37 ° C på en shaker platform på 50 rpm.
- Optage det optisk densitet (OD600) af bakteriekulturen over en 8-dages periode.
-
Brug BCG-Luc (tidligere beskrevet9) til at registrere overlevelse af bakterier i makrofager.
- Inficere RAW264.7 celler med biotinylated BCG-Luc (MOI 10:1) eller ubehandlet BCG-Luc (kontrol) og inkuberes ved 37 ° C over en 48 h tidsperiode.
- Vaske celle monolag og derefter lyse med 0.025% SDS at frigive indtaget bakterier.
- Måle bioluminescens produktion med Luciferase assay system og luminometrisk.
Bemærk: Luminescence signal er betegnende for bakteriel levedygtighed. Henvises der til producentens manual for oplysninger om luciferase assay.
5. bindende af monomere begærlighed-Fusion Protein Biotinylated BCG overflade
- Bland 5 x 108 biotinylated BCG med Avi-protein (10 μg/mL finalen i PBS-T) i 1 time ved stuetemperatur på shaker platform.
- Vask bakterier 3 gange med 500 µL af Ice kolde PBST og pletten med kanin anti-begærlighed antistof (Ab) (1: 100 fortynding, tidligere beskrevet10) i 20 min. ved stuetemperatur og derefter med FITC konjugeret gede anti-kanin IgG Ab i de samme betingelser.
- Vaske bakterier 3 gange med 500 µL af PBST og analysere ved flowcytometri at vurdere omfanget af overflade dekoration.
6. ingot af mykobakterier
- Biotinylate bakterier ifølge trin 3.1-3,4 og pels biotinylated bakterier med Avi-æg efter trin 5.1.
- Alikvot biotinylated og belagt bakterier (108), vask med PBS og genopslæmmes i 0,5 mL ingot medier (25% Sauton medium, 75% H2O og 1,5% Na-glutamat).
- Overføre bakterier til hætteglas og fryse i et-80 ° C fryser natten over.
- Lyophilize fyldt og frosne hætteglas i 24 timer ved hjælp af en fastfrysning tørretumbler.
- Store tørrede prøver ved stuetemperatur og rekonstruere i PBS når det er nødvendigt.
- Gentag trin 3.5 til at evaluere biotinylation og overflade belægning stabilitet.
7. fagocytose Assay
- Vokse RAW 264.7 makrofager celler i 10 cm diameter kultur retter i DMEM medium indeholdende 5% FCS, 1% hver af L-glutamin, HEPES, ikke-essentielle aminosyrer, og penicillin og streptomycin indtil 70-80% confluency.
- Seed 2 x 106 RAW 264.7 makrofager celler i en 6-godt plade. Tillad celler til at overholde natten over ved 37 ° C og 5% CO2.
- Generere DsRed BCG (tidligere beskrevet9) dekoreret med Avi-æg (DsRed BCG-Avi-æg) Ifølge trin 3.1-3.4 og 5.1.
- Inficere rå celler med DsRed BCG-Avi-æg eller ubehandlet DsRed BCG på MOI 20:1 i 24 timer ved 37 ° C.
- Vaske cellerne tre gange og trypsinize med 1 mL 0,25% trypsin ved 37 ° C i 10 min for at fjerne delvist aftagne bakterier.
- Fix i 2,5% PFA i PBS i 20 min. ved stuetemperatur.
- Vask 3 x med PBS og analysere ved flowcytometri.
8. intracellulære handel med æg dekoreret Biotinylated BCG i makrofager
-
Fluorescens mikroskopi
- Seed 3 x 105 RAW 264.7 makrofager celler på coverslips i en 24-godt plade. Tillad celler til at overholde natten over ved 37 ° C og 5% CO2.
- Inficere makrofag celler med mykobakterier (MOI 10:1) i vedligeholdelse medier uden antibiotika ved 37 ° C og 5% CO2 til 4 til 24 h.
- Vaske cellerne og trypsinize for at fjerne overflade vedlagte, ikke-indtages bakterier som skridt 7,5.
- Fix inficerede celler i 2,5% PFA i PBS i 20 min. ved stuetemperatur efterfulgt af 3 vasker med PBS.
- Permeabilize celler i blokerer/permeabilization buffer (0,1% Triton X-100, 3% BSA i PBS) i 20 min. ved stuetemperatur.
- Brug specifikke antistof af interesse (f.eks.kanin anti-begærlighed Ab) på 10 μg/mL i permeabilization buffer i 20 min. ved stuetemperatur efterfulgt af sekundær antistof (fxFITC-ged anti-kanin IgG) i 20 min.
- Vask celler 3 x med PBS, én gang med vand, og montere på dias i 10 μL af vandige montering medium at minimere fluorescens photobleaching.
- Undersøge dias af digital Konfokal mikroskopi ved hjælp af et epifluorescensmikroskop udstyret med 63 x / 1.4 Plan-Apochromat mål. Optag billeder ved hjælp af et digitalt kamera koblet til mikroskop software.
-
Autoradiografi farvning og elektronmikroskopi
- Seed 2 x 106 RAW 264.7 makrofager celler i 6-godt plader.
- Fix BCG inficerede makrofager med 4% PFA for 4 h i stuetemperatur.
- Vask prøver to gange med PBS.
- Integrere prøver i 4% lavt smeltepunkt agarosegelelektroforese, og dehydrere i 70% ethanol.
- Overføre prøver til akryl harpiks og polymerisere ved 50 ° C.
- Skære 60 nm sektioner med en mikrotom og indsamle sektioner på nikkel gitre.
- Etiket prøver med 10 μg/mL begærlighed antistof i 1 time ved stuetemperatur eller 4 ° C natten over i inkubation løsning (PBS og 0,1% BSA) og derefter vaskes med inkubation løsning guld-konjugeret F(ab')2 af ultra-små gede-anti-kanin IgG (1/20) i 1 time ved stuetemperatur temperatur i inkubation løsning.
- Vaske sektioner i destilleret vand, pletten i 2% glutaraldehyd, vask igen, luft tørre, og undersøge med elektronmikroskop.
9. animalsk Immunization og orgel behandling
Bemærk: Alle trin bør ske i et kabinet biosikkerhed.
- Pass biotinylated og protein belagt bakterier gennem 271/2G kanyle 10 gange at gøre enkelt cellesuspension.
-
Tage 1 x 106 bakterier i 100 μL af endotoxin-fri PBS og immunisere en kvindelig C57BL/6 mus (-Ab, H - 2 Kb, 5-6 ugers gammel) subkutant i harmoniske af halsen.
- Injicere kontrol mus med 100 μL af PBS alene.
-
Aflive immuniserede mus 20 dage efter immunisering af CO2 inhalation efterfulgt af cervikal dislokation.
- Isolere milten og overføre det til RPMI medier.
-
Mash milt gennem en 70 µm celle si med en 5 mL sprøjte stemplet.
- Skylles med 5 mL af RPMI. Centrifuge (800 x g, 3 min) til at isolere en enkelt cellesuspension.
- Nedbryder RBC med musen biotin positiv markering kit med biotin-Ter119/Erythroid celler Ab.
- Centrifuge og genopslæmmes celler i 10 mL af komplet RPMI (10% FCS, 1% L-glutamin, 1% penicillin, 1% streptomycin og 50 μM 2-ME).
10. jeg-Ab tetramer farvning at bestemme frekvenser af Antigen-specifikke CD4+ T-celler og intracellulære cytokin farvning at bestemme frekvenser af Antigen-specifikke T celler frigive cytokiner i immuniseret dyr
-
Tetramer farvning
- Pletten splenocytes fra kontrol og immuniserede mus (~ 20 x 106 celler) med PE-konjugeret-Ab-æg323-339 tetramers (1/12,5 fortynding) i 1 timer ved 37 ° C i binding buffer (PBS med 2% FCS og 0,1% NaN3).
- Tilføje AF647 CD4 Ab (1:25) og 7-ald (at opdage døde celler) til splenocytes i 20 min. ved stuetemperatur.
- Analysere prøver ved flowcytometri.
- Erhverve 500.000 begivenheder i regionen CD4 positive til at bestemme hyppigheden af tetramer positive begivenheder.
Bemærk: Samlede splenocytes er defineret af den videnskabelige Styringskomité/FSC dot skamplet, levende celler af udelukkelse af 7-ald positive begivenheder, og CD4 delmængder af gating AF647 positive begivenheder.
-
Hyppigheden af Antigen specifikke intracellulære cytokin frigiver T celler
- Overførsel ca 1 × 107 splenocytes til 4 mL af komplet RPMI medium i seks-godt plader med eller uden rekombinant æg (10 µg/mL) og Inkuber i 16 h.
- Behandling af celler med Brefeldin A (1:1, 000) for en yderligere 5 h.
- Vask med PBS og intracellulære cytokin farvning som følger:
- Pletten celle prøver med PE-CD8 eller PE-Cy7-CD4 Ab (1:50 i binding buffer) i stuetemperatur i 30 min.
- Fix i 4% PFA ved stuetemperatur i 20 min.
- Permeabilize bruger permeabilization løsning, ifølge producentens anvisninger.
- Vaske cellerne og etiket med AF647-konjugeret IFN-γ Ab (1:50) i 20 min. ved stuetemperatur.
- Vaske cellerne og underlægge flow flowcytometri analyse som beskrevet ovenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med de generelle procedurer beskrevet ovenfor, blev det undersøgt, gennemførligheden af BCG overflade biotinylation og dekoration med surrogat antigen æg. Immunogenicitet af den modificerede BCG blev derefter testet in vivo. Bakteriel overfladen var let mærket med biotin til hurtig visning af begærlighed kimære antigener uden påviselige ændringer i bakteriel fænotyper. Den resulterende modificerede BCG er effektivt indtages af antigen præsentation celler og kan fremkalde en OVA-specifikke immunrespons i mus.
Generation af monomere begærlighed fusion plasmider og proteiner
Et udtryk plasmid p17-Avi blev genereret for at være kompatibel med Gateway metode skal anvendes til at producere monomere begærlighed fusion proteiner. OVA blev klonet i p17-Avi og udtrykt i E. coli, derefter renset og refolded som beskrevet ovenfor (figur 1).
Biotin tillægger effektivt den bakterielle overflade og påvirker ikke bakteriel vækst eller overlevelse
Bakterier var mærket med forskellige koncentrationer (0-1 mM) af biotin og farves at undersøge effektiviteten af overflade biotinylation ifølge protokoller ovenfor. Flow flowcytometri analyse viste en total omlægning af fluorescens histogram i bakterier mærket med 0,5 mM biotin (figur 2), og denne koncentration blev brugt i hele denne undersøgelse til at generere biotinylated bakterier. Næste, vi undersøgte effekten af bakteriel overflade ændring på bakteriel fænotype og fandt, at biotinylated og kontrol ubehandlet BCG vises en lignende vækst profil over en 8-dages periode (figur 3A). BCG udtrykker luciferase (BCG-Luc)9 blev brugt til at behandle bakterielle overlevelse i makrofager. Luminescence signaler indikerer bakteriel levedygtighed blev indspillet over 48 h. Resultaterne viste lignende profiler af gradvis levedygtighed fald mellem biotinylated og kontrol bakterier (figur 3B). Afslutningsvis, angive disse data klart, at bakteriel overflade biotinylation ikke påvirker enten bakteriel vækst eller overlevelse inde makrofager, hvilket er vigtigt, da øget overlevelse i makrofager kunne betyde en stigning i bakteriel virulens.
Effektiviteten af bakteriel overflade dekoration
Biotinylated bakterier var belagt med æg antigen peptid i fusion med monomere begærlighed, ifølge protokoller ovenfor. Flow flowcytometri analyse viste minimal niveauer af æg binding til ikke-biotinylated bakterier (MFI = 8.31 ± 0,42, figur 4A, toppanelet) og betydelige niveauer af æg binding til biotinylated bakterier (MFI = 54.67 ± 4,98) i forhold til kontrol bakterier (MFI = 5.92 ± 0,22, figur 4A, lavere panel).
Stabilitet af BCG overflade dekoration
Da konventionelle levende BCG vacciner er formuleret som tørret pulver, blev et vigtigt spørgsmål, der opstod i løbet af denne undersøgelse modificeret BCG efter frysetørring, rekonstitution og opbevaring på køl eller stuetemperatur stabilitet. Derfor, vi undersøgte overflade visning af Avi-æg i frysetørret BCG Avi-æg (overflade indrettede i Avi-æg) og i indrettede frisk bakterielle præparater. Resultater (figur 4B) viste, at niveauer af Avi-æg på bakteriel overfladen forblev stabil og kan påvises en måned efter ingot og opbevaring i stuetemperatur i forhold til friske præparater, BCG Avi-æg, der viste sig at denne overflade dekoration metode er egnet til vaccine udvikling.
Makrofag fænotype er ikke berørt af bakteriel overflade dekoration
For at se om denne overflade dekoration metode forstyrrer bakteriel indrejse i værtsceller, brugte vi RAW264.7 celler og DsRed bakterier9 til at udføre en fagocytose assay beskrevet i ovennævnte protokol. Figur 4 c viste at bakteriel overflade dekoreret BCG har ikke væsentlig indgriben med bakteriel post (22,5 ± 1.57%) i forhold til ubestrøget vildtype BCG (24.47 ± 1,18%) angiver, at overflade dekoration af BCG har ingen effekt på makrofag fænotype.
Avidin fusion proteiner rejse intracellulært og co lokalisere med MHC molekyler
For at undersøge Avi-æg-dekoreret BCGS skæbne i makrofager, var vedhængende rå celler inficeret og undersøgt af Fluorescens mikroskopi, som beskrevet i ovennævnte protokol. Billeder fås (figur 5A) viste, at Avi-æg var ikke kun til stede på den bakterielle overflade, men også fritliggende og omplantede til cytoplasmaet fjernt for bakterier. Yderligere Kontroller dette resultat, vi udførte en Autoradiografi farvning eksperiment og billeder fås viste tydeligt at Avi-æg antigener der ikke kun findes på BCG overflade, men også kan løsne sig fra BCG overflade, krydse phagosomal membranen, og rejser mod cytosol (figur 5B). For at undersøge yderligere om Avi-æg dekoreret bakterier var i stand til at levere deres overflade protein last til antigen præsentation pathway, blev makrofager smittet med Avi-æg BCG, som beskrevet i protokollen, og underkastes Konfokal analyser. Resultater (figur 6A) viste, at der var colocalization af Avi-æg med-A molekyler, tyder på, at begærlighed fusion protein løsrevet og omplantes til antigen præsentation rum hvor de blev indlæst på MHC II molekyler. Resultaterne viste også, at Avi-æg peptid Co lokaliserer med klasse I molekyler i BCG phagosomes når farves til H-2_kb (fig. 6B), som viste, at der er potentielle præsentation af Avi-æg antigen til CD8+ T celler ved den makrofag. Disse data tyder på, når overfladen dekoreret bakterier Indtast makrofager, antigener, der er i stand til trafik mod antigen præsentation veje.
Overflade indrettede bakterier er fuldt immunogen
At undersøge, om overflade indrettede BCG er i stand til at inducere en specifikke immunrespons in vivo, C57BL/6 mus blev immuniseret med PBS alene (kontrol), wild-type BCG, Avi-æg dekoreret BCG, og BCG genetisk omdannet med et plasmid give udtryk for en lignende æg antigen. Immuniserede mus blev ofret 20 dage senere og frekvenser af æg-specifikke CD4+ T celler og embryoner-specifikke T-celler frigive cytokiner blev opdaget, i henhold til protokollen. Resultater (figur 7A-B) viste en større andel af æg-specifikke CD4+T-celle respons i dyr immuniseret med BCG belagt med Avi-æg i forhold til BCG WT. BCG genetisk modificeret til at udtrykke æg viste en lignende immunrespons til BCG AVI-æg (figur 7). Disse data viste, at metoden bakteriel overflade dekoration er i stand til at fremkalde en betydelig udvidelse af antigen specifikke CD4+ T celler og graden af T-celle respons induktion er sammenlignelig med BCG genetisk manipuleret til at udtrykke en lignende æg antigen.
Da intracellulære cytokiner er også vigtige indikatorer for antigen specifikke T-celle svar, blev intracellulære cytokiner farvning (ICS) eksperimenter udført for at yderligere vurdere T-celle immunrespons ved fastlæggelsen af udtryk og frekvenser af effektor cytokiner i dyr immuniseret med æg-dekoreret bakterier og bakterier genetisk forvandlet med en OVA udtrykker plasmid. Vi undersøgte niveauer af IFN-γ udgivelse, som er en kendt indikator for beskyttende reaktion mod intracellulære bakterier11. Vi viste, at vi var købedygtig opdager lignende niveauer af æg-specifikke IFN-γ frigive CD4+ celler i dyr immuniseret med bakterier overflade dekoreret med æg (BCG-Avi-æg og BCG-p19-Avi-æg) i forhold til dyr immuniseret med bakterier genetisk udtrykker æg (BCG-p19-æg) (figur 8A). Vigtigere, vi var også i stand til at opdage betydeligt højere frekvenser af IFN-γ producerer CD8+ T-celler i dyr immuniseret med BCG-Avi-æg i forhold til dyr immuniseret med BCG genetisk udtrykker æg (fig. 8B-C) der viser, at biotin-begærlighed medieret overflade visning af antigen metodologi kan effektivt erstatte BCG transformation med nukleinsyrer.
Figur 1: konstruktion af en rekombination kloning plasmid til produktion af begærlighed fusion proteiner. (A) en gen segmentet kodning til monomere begærlighed blev syntetiseret med begrænsning sites NdeI og opdag og subcloned i pDEST17 mellem 6 x histidin og gateway kassette til at generere p17-Avi plasmid. OVA peptid252-345 DNA sekvenser afsluttes med attB websteder blev klonet i pDONR221. Derefter var æg gener subcloned i p17-Avi. Billede redigeret og genoptrykt med tilladelse fra PLOS ONE12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: effektivitet af BCG biotinylation. BCG var biotinylated med forskellige koncentration af NHS-SS-biotin i 30 min. ved stuetemperatur, så mærket med FITC-streptavidin, og analyseret ved flowcytometri. Resultaterne præsenteres som histogrammer af grønne fluorescens intensitet og Indsæt diagram repræsenterer den gennemsnit ± SEM af gennemsnitlig fluorescens intensiteter (MFI) fratrukket 3 uafhængige forsøg. * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. Billede redigeret og genoptrykt med tilladelse fra PLOS ONE12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Biotinylation af BCG overflade ikke påvirkede sin vækst eller overlevelse i makrofager. (A) Biot-BCG og kontrol umærket vildtype BCG blev dyrket i komplet 7 H 9 medier, og replikering blev overvåget over en 8-dages periode. Resultaterne udtrykkes som vækstkurver, dvs, mener absorbans på 600 nm som funktion af tiden ± SEM fra 3 uafhængige forsøg. (B) makrofager blev smittet med Biot-BCG-Luc eller styre umærkede BCG-Luc for angivne perioder og derefter cellen lysates var forberedt og analyseres for bioluminescens at opdage levedygtige bakterier. Resultaterne udtrykkes som: relativ lys enheder (RLU) ± SEM fra 3 uafhængige forsøg. Billede redigeret og genoptrykt med tilladelse fra PLOS ONE12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Avi-æg bindende Biot-BCG og dens stabilitet. (A) Biot-dsRed-BCG (bakterierne udtryk for rød fluorescens, tidligere beskrevet9) og kontrol ikke-biotinylated dsRed-BCG blev blandet med Avi-æg stuetemperatur 1 h og omfanget af æg bindende blev evalueret af overflade farvning med kanin anti-begærlighed antistof og FITC-ged anti-kanin IgG (FL1). Prøverne blev vasket og analyseret ved flowcytometri. Resultaterne præsenteres som histogrammer af grønne fluorescens intensitet, og værdier er gennemsnit ± SEM af MFI for Biot-BCG-AviOVA binding fra tre uafhængige forsøg. (B) frysetørret Biot-BCG belagt med Avi-æg og frisklavet Avi-æg-Biot-BCG blev mærket og analyseres ved flowcytometri som beskrevet i A. Vises data er repræsentative for tre uafhængige eksperimenter, og værdier er gennemsnit ± SEM af MFI af Avi-æg-Biot-BCG bindende fremstillet af tre uafhængige forsøg. (C) rå makrofager var inficeret med DsRed BCG-Avi-OOVA eller DsRed-BCG i 24 timer ved 37 ° C. Prøver var derefter vasket, behandlet med trypsin, fast og analyseret af FACS. Resultaterne udtrykkes som røde fluorescens histogrammer, der afspejler omfanget af fagocytose. Værdier angiver gennemsnitlige procentdel ± SEM af celler indtagelse BCG fremstillet af tre uafhængige forsøg. Billede redigeret og genoptrykt med tilladelse fra PLOS ONE12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Avi-æg løsriver sig fra BCG overflade og krydsede den phagosomal membran mod cytosol. (A) tilhænger rå celler på cover underkjoler var inficeret med æg-indrettet dsRed-BCG i 24 timer ved 37 ° C og derefter fast/permeabilized og farves med kanin anti-begærlighed antistof og FITC-ged anti-kanin IgG. Prøver var monteret på objektglas og analyseret af digital Konfokal mikroskopi. Røde signaler angive placeringen af BCG og grønne signaler afspejler lokalisering af Avi-æg. Den stiplede linje angiver makrofag celle grænse og nederst til højre panel er en 4 X forstørrelse af indsætte vist i venstre panel. (B) tynde sektioner af BCG-AviOVA inficeret rå celler var fast med PARAFORMALDEHYD og inkuberes sekventielt med anti-begærlighed antistof og guld-konjugeret gede anti-kanin IgG at visualisere Avi-æg og med en elektron mikroskop undersøgt. Forstørrelse af 12.000 X er vist. Pilespidserne angive Avi-æg adskilles fra BCG overflade og eksporteres phagosome membran. De viste billeder er repræsentanter for to uafhængige forsøg. Billede redigeret og genoptrykt med tilladelse fra PLOS ONE12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: begærlighed-fusion antigen Co lokaliseret med MHC klasse II og klasse i molekyler. Vedhængende BMA3.1A7 celler, en mus makrofag cellelinie, var inficeret med æg indrettet normal god landbrugspraksis-BCG (udtrykker grøn fluorescerende, tidligere beskrevne9) til 4 h og derefter stimuleret med IFN-γ for 24 h. celler blev derefter fast/permeabilized og farves med kanin anti-begærlighed antistof, Alexa 594 anti-kanin IgG og enten Alexa 647 rotte anti-mus-A (A) eller Alexa 647 rotte anti-mus H-2_kb (B). Prøver var monteret på objektglas og analyseret af digital Konfokal mikroskopi. Grønne signaler angive placeringen af BCG-normal god landbrugspraksis og røde signaler afspejler lokalisering af Avi-æg. Blå signaler angive placeringen af MHC klasse II eller klasse i molekyler. Den stiplede linje angiver området af interesse. Pilespidser angive Avi-æg colocalization med MHC molekyler. Billeder vist er repræsentanter for to uafhængige forsøg. Billede redigeret og genoptrykt med tilladelse fra PLOS ONE12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: In vivo CD4+ T-celle respons til æg-dekoreret BCG. C57BL/6 mus blev injiceret subkutant med BCG overflade dekoreret med æg, uforandret BCG vildtype, PBS (kontrol), BCG genetisk omdannet til express æg (BCG-p19-æg) eller omdannet med kontrol plasmid og overflade dekoreret med Avi-æg ( BCG-p19-AviOVA). Efter en 20-dages periode, blev splenocytes tilberedt af milt af aflivede dyr og farves med PE-konjugeret-Ab-æg323-339 tetramers (A) efterfulgt af AF647-CD4 antistof og 7-ald. Prøverne blev derefter analyseret ved flowcytometri. Resultaterne udtrykkes som to-parameter dot parceller, der viser den gennemsnitlige frekvenser ± SEM af tetramer positive begivenheder i CD4+ befolkning fra to dyr/gruppe. Vises data er repræsentative for tre uafhængige eksperimenter (ialt seks mus blev undersøgt med celle prøver fra hver mus evalueret i tre eksemplarer). Dataene i grafer (B) udtrykt som betyder værdi ± SEM af det absolutte antal (i alt 500.000 begivenheder) af æg tetramer specifikke CD4+ celler i fra to dyr/gruppe og tre uafhængige forsøg. * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. Billede redigeret og genoptrykt med tilladelse fra PLOS ONE12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: frekvenser af T-celler frigive cytokiner som svar på Avi-æg belagt BCG-vaccination. Splenocytes fra immuniserede mus med PBS, BCG Wild-type, BCG WT overflade indrettede i Avi-æg, BCG-p19-æg, og med BCG-p19-AviOVA blev stimuleret med rekombinant æg protein for 16 h efterfulgt af en 5 h-periode behandling med Brefeldin A. Cells var derefter vaskes og farves først med PE-Cy7 anti-CD4 (A) eller PE anti-CD8 antistof (B) så AF647 anti-IFN-γ antistof. Celler blev derefter vaskes og analyseret ved flowcytometri. Resultaterne udtrykkes som to-parameter dot grunde til at vise den gennemsnitlige frekvenser ± SEM af IFN-γ producerende celle subsets i CD4+ og CD8+ befolkninger fra to dyr/gruppe. Vises data er repræsentative for tre uafhængige eksperimenter (ialt seks mus blev undersøgt med celle prøver fra hver mus evalueret i tre eksemplarer). Dataene i grafer (C) er udtrykt som gennemsnit af absolutte tal ± SEM af IFN-γ frigive CD4+ T celler (venstre graf) eller IFN-γ frigiver CD8+ T celler (højre graf) fra to dyr/gruppe og tre uafhængige forsøg. * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. Billede redigeret og genoptrykt med tilladelse fra PLOS ONE12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi rapporteret i denne undersøgelse en ikke-genetiske metode til hurtig og effektiv visning af eksogene proteiner på BCG overflade tilføje enten specifikke antigener eller specifikke funktionelle egenskaber forventes at effektivt forbedre den bakterie immunogenicitet. Vi viste, at BCG cellens overflade kunne være let biotinylated til øjeblikkelig overflade dekoration med begærlighed fusion proteiner. Den samlede procedure kan udføres inden for 2 timer, mens genetiske transformation og udvalg af positive kloner kræver 2 til 3 måneder af tidsforskydning. Overflade ændring påvirker ikke bakteriel vækst og overlevelse. Bakterier dekoreret med surrogat antigen æg var i stand til at levere antigenet i antigen præsentation pathway og induceret specifikke immunrespons in vivo, som blev evalueret ved flowcytometri assays herunder MHC tetramer farvning og intracellulære cytokin farvning (ICS). Vigtigere, viste i vivo undersøgelser klart, at dekoreret overflade bakterier kunne fremkalde lignende niveauer af immunrespons sammenlignet med BCG genetisk manipuleret til at udtrykke lignende antigener.
Avidin biotin interaktion er den stærkeste non-kovalente interaktion kendt i naturen med en Kd 10−15 M13. Det er ikke kun et nyttigt værktøj, der almindeligvis anvendes i biologiske forskning14, men også for nylig vist sig at være relevant i cancer behandling15,16. I denne undersøgelse, en tredobbelt mutation (N54A, W110K og N17I) blev anvendt til vildtype begærlighed at konvertere tetramert begærlighed i form af monomere begærlighed, der er væsentligt reduceret begærlighed-biotin affinitet (Kd= 10−7 M) og binder reversibelt til biotin. Denne monomere begærlighed blev brugt til at udvikle en p17-Avi plasmid, der er kompatibel med Gateway rekombination kloning (Invitrogen) for en et-trins hurtige udtryk for et protein af interesse. Denne nye version af monomere begærlighed har flere fordele, herunder at forhindre store bakteriel klump sammenlægning og forbigående/Vendbar bakteriel overflade visning af proteiner af interesse. Derfor, når indtages af cellen vært, Avi-fusion proteiner kan løsne sig fra overfladen af biotinylated bakterier og trafik intracellulært. Endelig, mutationerne konvertere begærlighed i en ikke-glykosyleret form, der kunne anvendes i gær eller transgene planter17,18 til produktion af store mængder af begærlighed fusion proteiner i eukaryote systemer. Denne form af monomere begærlighed blev valgt i stedet for en version af monomere streptavidin (mSA)19, som har både streptavidin og rhizavidin sekvenser og havde en højere bindende affinitet (Kd 10−9 M) i forhold til mAvidin. Med indledende test, havde mSA chimera protein en meget lavere bindende effektivitet til biotinylated bakterier i forhold til mAvidin chimera protein. Denne undersøgelse, derfor var baseret på mAvidin, men monomere streptavidin eller andre former for streptavidin/avidin vil også være en mulighed for andre programmer.
Vellykket gennemførelse af de beskrevne protokoller afhænger af kvaliteten af den genererede fusion protein og effektiviteten af den bakterielle overflade biotinylation. Elueret Avi-mærkede protein bør være de-saltet og buffer udveksles i PBS ved hjælp af ordentlig molekylvægt protein koncentrator. Nedbør kan forekomme ved høj koncentration faktorer for nogle proteiner, derfor koncentration faktor bør testes og bestemmes ved hjælp af små mængder af elueret protein på første, fx0,5 til 1 mL af solubilized inklusion krop fortyndes i 20 mL PBS og så koncentreret. Det er også vigtigt at holde temperaturen af protein omkring 4 ° C under hele processen for at undgå udfældning.
For at forbedre effektiviteten af bakteriel overflade biotinylation, bør Sulfo-NHS SS biotin opbevares i den originale beholder i mørke ved 4 ° C. Reagenset er meget fugt følsomme; Derfor bør være ekvilibreres hætteglas indeholdende reagenset til stuetemperatur før åbning. Også, bør biotin stamopløsning (10 mM) gjort umiddelbart før anvendelsen som NHS-ester gruppe hydrolyserer og bliver ikke-reaktiv meget hurtigt. Biotin stamopløsning kan gemmes og genbruges; en ny biotin hætteglasset er nødvendig for hver biotinylation eksperiment. For de bedste resultater anbefales frisk kulturer af BCG, friske medier, samt friske buffere. Som nævnt i protokollen, kunne biotinylated og belagt BCG frysetørret og bevaret i mindst 30 dage uden at det påvirker kvaliteten af den overfladebehandling. Dette er især nyttigt, når at sende eller overføre prøver fra én placering til en anden eller når du udfører lange kursus eksperimenter.
Denne BCG overflade dekoration metode giver også andre spændende muligheder for at analysere og evaluere immunogenicitet af nyudviklede vaccine kandidater i en hurtig og præcis måde. Det primære mål for nye TB vaccine er at fremkalde TH1 type celler såsom CD4+ og CD8+ T celler at spille vigtige roller i beskyttelse mod TB. Avidin-biotin system udviklet i denne undersøgelse giver et meget nyttigt værktøj til at vurdere disse T-celler svar. Denne nye teknologi hurtigt vise rekombinante proteiner/antigener på BCG overflade repræsenterer et fantastisk værktøj til at evaluere hurtigt og præcist den beskyttende effekt af mange immunogen proteiner (fxudskilles specifikke M.tb proteiner), og dermed kan omsættes til udvikling af effektive vacciner.
Ved at justere og varierende koncentration af Avi-fusion proteiner på bakteriel overflade, kunne en anden fordel ved denne metode være at vise samtidigt forskellige antigener af interesse på bakteriel overfladen for at maksimere effektiviteten af vaccine. Da undersøgelser har vist, at BCG forstyrrer vigtigt makrofag funktioner såsom phagosome modning20,21 og antigen præsentation21, kunne en mulighed for yderligere at forbedre BCG udsmykning BCG overflade med en kombination af faktorer, der vides at fremskynde phagosome modning sammen med antigener af interesse.
Nogle begrænsninger af denne teknologi omfatter kravet om masseproduktion af rekombinante proteiner, som kunne være udfordrende og dyrt i lavindkomstlande områder. Derudover ville producerer hårdt at rense proteiner kræve fejlfinding og optimering. Men disse begrænsninger kan omgås med forbedring af rekombinante protein produktionsteknologier. En anden begrænsning omfatter muligheden for at naturligt forekommende anti-begærlighed antistoffer fælles i laboratoriet dyr og mennesker22 kunne hæmme brugen af begærlighed til terapeutiske formål. Men andre labs har testet sikkerhed og virkning af begærlighed terapi og har vist at begærligheds sikkerhed og effektivitet ikke var påvirket væsentligt af dens immunogenicitet23. Interessant, nedsat konvertering vildtype tetramert begærlighed til monomere form betydeligt sin immunogenicitet24.
For at opsummere, kan denne nye teknologi udnytte en begærlighed-biotin system for at forbedre BCGS immunogenicitet via en hurtig og reproducerbare ikke-bakteriel overflade gensplejsning med proteiner af interesse med succes erstatte traditionelle transformation af BCG med antigen-kodning plasmider. Desuden, denne nye metode kan ikke kun gøre det lettere for forbedring af den nuværende BCG vaccine, men kan også give en roman platform for hurtig evaluering af stort set enhver potentiel antigen eller proteiner normalt svært at udtrykke genetisk i BCG, med brede applikationer i TB vaccine udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Dr. R Stokes for BCG Pasteur stamme og A. Talal for teknisk support. Vi takker også GenScript for hjælp med gen syntese.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endotoxin-free RPMI 1640 | StemCell Technologies | 36750 | |
| Sulfo-NHS SS biotin | Thermo Fisher | 21328 | |
| FITC-conjugated streptavidin | Sigma-Aldrich | S3762 | |
| Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer | MBL International | TS-M710-1 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| TALON polyhistidine-Tag purification resin | Clontech | 635501 | |
| Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| AF647 rat anti-mouse IFN-g | BD Bioscience | 557735 | |
| AF647 rat anti-mouse I-A/I-E | BD Bioscience | 562367 | |
| PeCy7 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 552775 | |
| PE rat anti-mouse CD8 Ab | BD Bioscience | 561095 | |
| AF 647 rat anti-mouse H-2kb | BD Bioscience | 562832 | |
| FITC-conjugated goat anti rabbit antibody | Thermo Fisher | 31635 | |
| AF 647 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG | Electron Microscopy Sciences | 25100 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Diagnostic Systems | 271310 | |
| OADC | BD Diagnostic Systems | B11886 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| RAW 264.7 murine macrophage cell lines | American Type Culture Collection | ||
| pDEST17 plasmid | Invitrogen | 11803012 | |
| pUC57-OVA plasmid | GenScript | SD1176 | |
| BP clonase | Invitrogen | 11789020 | |
| LR clonase | Invitrogen | 11791043 | |
| pDONR221 plasmid | Invitrogen | 12536017 | |
| Ni-NTA columns | Qiagen | 31014 | |
| Pierce protein concentrators | Thermo Fisher | 88527 | |
| Flurosave | Calbiochem-Novabiochem | 345789 | |
| Axioplan II epifluorescence microscope | Carl Zeiss Inc | ||
| CCD digital camera | Retiga EX, QImaging | ||
| Tecnai G2 200kV electron microscope | FEI Company | G2 200Kv | |
| 70μm Falcon cell strainer | Thermo Fisher | 87712 | |
| EasyStep mouse biotin positive selection kit | StemCell | 18556 | |
| biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody | BioLegend | 116203 | |
| Brefeldin A | BD Pharmingen | 555029 | |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Pharmingen | 554714 | |
| Bright-Glo Luciferase assay system | Promega | e2620 | |
| Turner Biosystem luminometer | Promega | TD-20/20 | |
| Leica EM UC6 microtome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Novalyphe NL 500 freeze dryer | Savant Instruments | NL 50 | |
| Wheaton boroscilicate glass vials | Wheaton | VWR 66011-675 |
References
- Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
- Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
- Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
- Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
- Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
- Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
- Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
- Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
- Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
- Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
- Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833 (2015).
- Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. Avidin-biotin technology in targeted therapy. Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).
- Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. Radioimmunotherapy of brain tumor. Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).
- Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
- Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
- Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
- Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
- Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
- Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
- Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
- Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).
