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Immunology and Infection

Expresión de antígenos exógenos en la vacuna de BCG de Mycobacterium bovis por genética no decoración de superficie con el sistema avidina-biotina

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/56421
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine and Vancouver Costal Health Research Institute, University of British Columbia, 2Institute of Biomedical Technology, University of Tampere

Summary

Se presenta una nueva técnica para la visualización rápida de antígeno en una superficie bacteriana, que implica la Biotinilación superficial seguida por la exposición a las proteínas de interés en fusión con avidina monomérica. Carga del BCG con antígenos seleccionados con éxito mejora su inmunogenicidad, lo que sugiere que la decoración superficial puede sustituir los métodos genéticos tradicionales.

Abstract

La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa grave y el bacilo de M. bovis sólo disponible vacuna de Calmette-Guerin (BCG) es seguro y eficaz para la protección contra la meningitis de TB severa de los niños y algunas formas de tuberculosis diseminada, pero no protege contra la tuberculosis pulmonar, que es la forma más prevalente de la enfermedad. Estrategias prometedoras para mejorar la BCG en la actualidad basan en su transformación con genes que codifican inmunodominante M. tuberculosis (Mtb)-antígenos específicos o complementación con genes que codifican factores que estimularían el antígeno las células presentadoras. Principales limitaciones de estos enfoques incluyen el incierto nivel de seguridad de los vectores de expresión, baja eficiencia y baja estabilidad. En este estudio, presentamos un enfoque alternativo a la mejora de la vacuna, que consiste en complementación de BCG con proteínas exógenas de interés en la superficie de las bacterias, en lugar de transformación con los plásmidos codifican genes correspondientes. En primer lugar, las proteínas de interés se expresan en fusión con avidina monomérica en estándar e. coli sistemas de expresión y utilizarlas para decorar la superficie de biotinilado BCG. Con superficie de BCG con antígenos de sustituta ovoalbúmina los experimentos con animales demuestran que la bacteria modificada completamente inmunogénica y capaces de inducir respuestas de células T específicas. En conjunto, los datos presentados aquí fuertemente apoyan un novedoso y eficaz método para remodelar la actual vacuna BCG que reemplaza el enfoque convencional laborioso de complementación con ácidos nucleicos exógenos.

Introduction

Diversas estrategias se han propuesto para reemplazar la actual vacuna TB BCG, incluyendo proteína adyuvante sistemas, tecnologías virales virales, cepas de m. vivo atenuadas y modificadas genéticamente cepas de BCG, ya sea para introducir genes sobre-expresan antígenos de BCG que no expresan suficientemente durante la infección1 o Mtb-antígenos específicos no presentan en BCG2. Ingeniería genética, sin embargo, se enfrenta a muchas barreras incluyendo el incierto nivel de seguridad, el proceso desperdiciador de tiempo y la baja eficiencia de expresión vectores4,5. Con respecto a la mejora de la BCG, es necesario un enfoque alternativo para mejorar la inmunogenicidad sin necesidad de alteraciones genéticas inciertos.

En este estudio, presentamos una nueva estrategia para la visualización de proteínas recombinantes de interés en la superficie celular de BCG que se basa en la interacción bien conocida de alta afinidad de avidina con biotina. Este enfoque permite el accesorio rápido y reproducible avidina recombinante de proteínas de fusión en la superficie de biotinilado BCG, que facilita las manipulaciones amplia de BCG para lograr un perfeccionamiento máximo de su eficacia manteniendo su excelente seguridad registro, observado durante décadas de uso.

Avidina afinidad para la biotina es extremadamente alta (Kd = 10−15 M) y una vez formado, el complejo biotina-avidina es muy estable y sólo puede ser interrumpido bajo desnaturalizar condiciones6. Sin embargo, para este tipo de interacción para servir como una alternativa de método de transferencia génica, exposición a largo plazo pero reversible de proteínas recombinantes se requiere. Por lo tanto, aquí presentamos una avidina monomérica de baja afinidad (Kd = 10−7 M) que conduce a la liberación reversible de la proteína de la superficie decorada BCG una vez ingerido dentro de las células presentadoras de antígeno. Con el fin de proporcionar una prueba de concepto, probamos este método utilizando una proteína quimérica de avidina monomérica corresponde a un antígeno de sustituto derivado de ovoalbúmina (OVA)7,8. Los resultados mostraron que la superficie de la célula de BCG puede ser fácilmente y rápidamente decorada con proteínas de fusión de avidina monomérica y que esta Unión a la superficie de la BCG es estable y reproducible sin cambios perceptibles en el crecimiento bacteriano y la supervivencia. También, encontramos que la BCG con avidina monomérica con óvulos (AviOVA) puede inducir una respuesta inmune similar a la inducida por la BCG genéticamente expresando el mismo antígeno tanto in vitro como in vivo. Esta tecnología de pantalla reversible de proteínas de interés en la superficie bacteriana es un efectivo reemplazo de enfoques de transferencia génica tradicional y puede proporcionar una plataforma para grandes manipulaciones de BCG y otras aplicaciones de vacuna desarrollo.

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Protocol

Todos los animales fueron mantenidos según los protocolos aprobados por los comités de uso en la Universidad de British Columbia y de Animal Care. Experimentos fueron aprobados por los comités de uso y de cuidado Animal y realiza de acuerdo con el Consejo Canadiense sobre directrices de cuidado Animal. El número de bienestar animal seguro es A11-0247.

1. generación de proteínas de fusión de avidina monomérica expresando plásmidos

  1. El clon avidina monomérica secuencia12 en plásmido pDEST17 entre los sitios "CTC" y "GAA" que corresponde a 133-134bp. (es decir, entre la 6-histag y el sitio de recombinación pDEST17 Attr1 ) para obtener p17-Avi.
    Nota: A continuación se muestra la secuencia de ADN monomérica avidina. En caracteres en negrita se muestran las tres mutaciones en avidina de tipo salvaje para obtener avidina monomérica.
    gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc
    agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
    ACAAGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
    tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
    attggtgatg CAAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga
  2. Diseño de primers flanqueados con sitios AttB1 y B2 Attcorrespondiente a OVA polipéptido757-1035 (-Ab- y H-2_Kb-restringido epitopos) secuencia de ADN. Secuencias de la cartilla son: Attb1-OVA
    GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT y Attb2-OVA
    GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 y b2 Attlas secuencias están en negrita).
    1. Amplificar por PCR OVA polipéptido757-1035 secuencia de la DNA con los iniciadores utilizando el plásmido pUC57-OVA como plantilla.
    2. Clonar los productos PCR en pDONR 221 a través de una site-specific en vitro recombinación reacción (p. ej., BP Clonase) para obtener óvulos pDONR.
  3. Transferir el gen de interés en p17-Avi usando la reacción en LR Clonase a obtener p17-Avi-OVA.
    Nota: Para detalles de clonación de recombinación BP y LR, consulte el manual del fabricante.

2. expresión de proteínas de fusión monomérica avidina, purificación y Refolding

  1. Transformar p17-Avi-OVA plásmido en e. coli BL21 e inducir 250 mL de e. coli BL21 cultura con IPTG (0,1 M) de 3 h a 37 ° C.
  2. Lisis de bacterias y solubilización de los cuerpos de inclusión
    1. 250 mL de cultura BL21 inducida de pellets por 30 minutos de centrifugación a 4.000 x g y a 4 ° C.
    2. Recoger pastillas en 10 mL de tampón de lisis (50 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, 6 M guanidina-HCL, pH 1.5-2.5) e incubar durante 15 min a 95 ° C. Incubar durante una noche a temperatura ambiente en un agitador.
    3. Centrífuga de 30 min a 15.000 x g y 4 ° C y recoger sobrenadante.
  3. Purificar el Avi-OVA de sobrenadante (fracción de cuerpos de inclusión solubilizados) usando columnas de Ni-NTA.
    1. Diluir 1:2 de cuerpos de inclusión con tampón de lisis.
    2. Utilizar 4 mL de resina Ni-NTA por 250 mL derivadas de cultivo de cuerpos de inclusión.
    3. Lavar 3 x con 10 mL de tampón de lisis (pH 7.0).
    4. Procederá a la elución con 10 mL de tampón de elución (lysis buffer pH 7.0 con imidazol de 250 mM).
  4. Replegar proteínas eluídas por dilución gradual (1:10) y rápida Vortex en buffer Tris (pH 7,5) que contiene 1 mM TDT, 200 mM NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0.5 mM Tween 80, arginina de 500 mM y 200 mM NaCl durante 30 min a temperatura ambiente.
  5. -Sal y cambio de tampón replegado proteína de tampón Tris en PBS con concentradores de proteínas según los protocolos del fabricante.
  6. Retirar agregados por centrifugación durante 30 min a 3.500 x g y a 4 ° C y guardar alícuotas de proteína soluble a-20 ° C.

3. Biotinilación de superficie de la célula de BCG

  1. Crecer BCG en Middlebrook 7H 9 caldo con 10% OADC (ácido oleico, albúmina, solución de dextrosa) y 0.05% de Tween 80 a 37 ° C en una plataforma del agitador a 50 rpm hasta OD = 0.5-1.
    Nota: BCG es un patógeno de nivel 2 de bioseguridad y todos los experimentos sobre BCG deben realizarse en un gabinete con equipo de protección personal adecuado de bioseguridad.
  2. Lavar 109 BCG 3 veces con 500 μl de PBS libre de endotoxina helada más 0,1% Tween80 (SAFT) (pH 8.0). Suspender el sedimento de la BCG en PBS libre de endotoxina estéril.
  3. Inmediatamente antes del uso, preparar 1 mL de biotina de Sulfo-NHS SS de 10 mM en agua estéril filtrada.
    1. Incubar las bacterias con 1 mL de 0,5 mM de biotina Sulfo-NHS SS a temperatura ambiente durante 30 minutos.
  4. Etiquetado bacterias 3 veces con 500 μl de helado frío SAFT para quitar no reaccionó Biotinilación reactivo de lavado.
    1. Vuelva a suspender el sedimento en 1 mL de SAFT.
  5. Para evaluar la eficiencia de Biotinilación, mancha 108 biotinilado BCG con estreptavidina-FITC (1: 100, 25 μl) a temperatura ambiente durante 20 minutos.
    1. Incubar bacterias teñidas en 1 mL de 2% PFA por 20 min a temperatura ambiente y luego examinar niveles de Biotinilación por análisis de citometría de flujo.

4. fenotipo de biotinilado micobacterias: crecimiento y supervivencia

  1. Crecen las cepas de BCG en Middlebrook 7H 9 caldo con 10% OADC (ácido oleico, albúmina, solución de dextrosa) y 0.05% de Tween 80 a 37 ° C en una plataforma del agitador a 50 rpm.
    1. Anotar la densidad óptica (OD600) de la cultura bacteriana durante un período de 8 días.
  2. Utilizar BCG-Luc (previamente descritos9) para detectar la supervivencia de las bacterias en los macrófagos.
    1. Infectar células 264.7 con biotinilado BCG-Luc (MOI 10:1) o sin tratamiento BCG-Luc (control) y se incubó a 37 ° C durante 48 horas período de tiempo.
    2. Monocapas de células de lavado y luego lyse con 0,025% de SDS para liberar las bacterias ingeridas.
    3. Medir la producción de bioluminiscencia con sistema de ensayo de luciferasa y luminómetro.
      Nota: La señal de luminiscencia es indicativa de la viabilidad bacteriana. Por favor consulte el manual del fabricante para detalles de ensayo de luciferasa.

5. Unión de la proteína avidina-Fusion Monomeric biotinilado BCG superficie

  1. Mezclar 5 x 108 biotinilado BCG con Avi-proteína (final de 10 μg/mL en PBS-T) por 1 h a temperatura ambiente en la plataforma de la coctelera.
  2. Bacterias de lavado 3 veces con 500 μl de SAFT frío helado y tinción con anticuerpos anti-avidina (Ab) (dilución 1: 100, previamente descritos10) por 20 min a temperatura ambiente y luego con FITC conjugan anti-conejo de cabra IgG Ab en las mismas condiciones.
  3. Lave las bacterias 3 veces con 500 μl de Saft y analizar mediante citometría de flujo para evaluar la extensión de la decoración de la superficie.

6. liofilización de micobacterias

  1. Biotinylate bacterias según paso 3.1-3.4 y capa biotinilado bacterias con OVA Avi según el paso 5.1.
  2. Alícuota biotinilado y bacterias recubiertas (108), lavar con PBS y resuspender en medio de la liofilización de 0,5 mL (medio de Sauton 25%, 75% H2O y 1.5% Na-glutamato).
  3. Transferir las bacterias a los frascos de cristal y congelar en un congelador de-80 ° C durante la noche.
  4. Liofilizar frascos de vidrio rellenos y congelados durante 24 horas utilizando una secador de la helada.
  5. Almacenar las muestras secadas a temperatura ambiente y reconstituir en PBS cuando sea necesario.
  6. Repita el paso 3.5 evaluar Biotinilación y estabilidad de la capa de superficie.

7. fagocitosis ensayo

  1. Crecer células de macrófagos RAW 264.7 en platos de cultura de diámetro de 10 cm en DMEM medio conteniendo 5% FCS, 1% por cada uno de L-glutamina, HEPES, aminoácidos no esenciales y penicilina y estreptomicina hasta 70-80% de confluencia.
  2. 2 x 106 RAW 264.7 células macrófagos en una placa de 6 pozos de la semilla. Permitir que las células se adhieran durante la noche a 37 ° C y 5% CO2.
  3. Generar DsRed BCG (previamente descritos9) decorado con Avi-OVA (DsRed BCG-Avi-OVA) según pasos 3.1-3.4 y 5.1.
  4. Infectar células RAW con DsRed BCG-Avi-OVA o no tratada DsRed BCG en MOI 20:1 durante 24 h a 37 ° C.
  5. Lavar las células 3 veces y trypsinize usando 1 mL de tripsina 0.25% a 37 ° C por 10 min para eliminar las bacterias parcialmente independiente.
  6. Fijar en 2,5% PFA en PBS durante 20 min a temperatura ambiente.
  7. Lavar 3 veces con PBS y analizar mediante citometría de flujo.

8. intracelular tráfico de huevos decoradas biotinilado BCG en macrófagos

  1. Microscopía de fluorescencia
    1. 3 x 105 RAW 264.7 células macrófagos en cubreobjetos en un plato 24-well de la semilla. Permitir que las células se adhieran durante la noche a 37 ° C y 5% CO2.
    2. Infectar las células del macrófago con micobacterias (MOI 10:1) en los medios de mantenimiento sin antibióticos a 37 ° C y 5% CO2 4 a 24 h.
    3. Lavar las células y trypsinize para quitar superficie adjuntas, no ingiere bacterias como en el paso 7.5.
    4. Fix infectada células en 2.5% PFA en PBS durante 20 min a temperatura ambiente seguido por 3 lavados con PBS.
    5. Permeabilizar las células en buffer de bloqueo/permeabilización (0,1% Tritón X-100, BSA 3% en PBS) durante 20 min a temperatura ambiente.
      1. Anticuerpo específico uso de interés (por ejemplo, conejo Ab anti-avidina) 10 μg/ml en la permeabilización buffer por 20 min a temperatura ambiente seguido de anticuerpo secundario (p. ej., IgG de anti-conejo FITC-cabra) durante 20 minutos.
    6. Lavar las células 3 veces con PBS, una vez con agua y el montaje de diapositivas 10 μL de medio de montaje acuoso para minimizar el fotoblanqueo de fluorescencia.
    7. Examinar diapositivas mediante microscopía confocal digital utilizando un microscopio de epifluorescencia equipado con 63 x / 1.4 objetivo Plan-Apochromat. Grabar imágenes con una cámara digital acoplada al software del microscopio.
  2. Immunogold de tinción y la microscopia electrónica
    1. 2 x 106 RAW 264.7 células de macrófagos en las placas de 6 pozos de la semilla.
    2. Fijar los macrófagos BCG infectado con 4% PFA durante 4 horas en temperatura ambiente.
    3. Lavar las muestras dos veces con PBS.
    4. Integrar muestras en agarosa de bajo punto de fusión de 4% y deshidratar en etanol al 70%.
    5. Transferir las muestras de resina acrílica y polimerizar a 50 ° C.
    6. Cortar 60 secciones nm con un micrótomo y recoger secciones en rejillas de níquel.
    7. Etiquetar las muestras con anticuerpos de avidina de 10 μg/mL durante 1 hora a temperatura ambiente o a 4 ° C durante la noche en solución de incubación (BSA PBS y 0,1%) y luego lavar con incubación solución conjugados con oro F(ab')2 de ultra pequeña cabra-anti-rabbit IgG (1/20) por 1 h en la sala de temperatura en la solución de incubación.
    8. Lávese las secciones en agua destilada, en glutaraldehído al 2% de la mancha, lavar, secar al aire y examinar con microscopio electrónico.

9. animales vacunas y procesamiento de órganos

Nota: Todas las medidas deben realizarse en un gabinete de bioseguridad.

  1. Biotinilado de paso proteína revestida y bacterias a través de aguja de1/2G 27 10 veces a hacer suspensión unicelular.
  2. Tomar 1 x 106 bacterias en 100 μL de PBS libre de endotoxinas e inmunizar a ratones C57BL/6 femeninos (-Ab, H - 2 Kb, 5-6 semana de edad) por vía subcutánea en el pescuezo del cuello.
    1. Inyectar a ratones control con 100 μL de PBS solo.
  3. Eutanasia a ratones inmunizados 20 días post-vacunación por CO2 inhalación seguida por dislocación cervical.
    1. Aislar el bazo y la transferencia en Medio RPMI.
  4. Puré del bazo a través de un tamiz celular de 70 μm con un émbolo de la jeringa de 5 mL.
    1. Lavar con 5 mL de RPMI. Centrífuga (800 x g, 3 min) para aislar una suspensión unicelular.
    2. Agotar los RBC con kit de selección positiva de biotina de ratón con células de biotina-Ter119/eritroides Ab.
    3. Centrifugar y resuspender las células en 10 mL de RPMI completo (10% FCS, 1% L-glutamina, 1% de penicilina, estreptomicina de 1% y 50 μM 2-ME).

10. I-Ab tetrámero de tinción para determinar las frecuencias de específica de antígeno CD4+ las células T y citoquinas intracelulares tinción para determinar frecuencias de específica de antígeno T las células liberando citoquinas en los animales inmunizados

  1. La tinción de tetrámero
    1. Esplenocitos de ratones inmunizados (~ 20 x 106 células) conjugado con PE-Aby control de la mancha-tetrámeros de323-339 de OVA (dilución 1/12,5) por 1 h a 37 º C en tampón de unión (PBS y 0,1% NaN32% FCS).
    2. Añadir AF647 CD4 Ab (1:25) y 7-AAD (para detectar las células muertas) de esplenocitos por 20 min a temperatura ambiente.
    3. Análisis de muestras por citometría de flujo.
    4. Adquirir 500.000 eventos en la región positiva de CD4 para determinar la frecuencia de eventos positivos tetrámero.
      Nota: Esplenocitos totales están definidos por lo blot dot SSC/FSC, células vivas por la exclusión de los eventos positivos 7-AAD y subconjuntos CD4 por bloquear eventos positivos AF647.
  2. Frecuencia de antígeno específicos citocinas intracelulares liberando las células T
    1. Transferencia de aproximadamente 1 × 107 esplenocitos en 4 mL de Medio RPMI completo en placas de seis pocillos con o sin OVA recombinante (10 μg/mL) e incúbelo durante 16 h.
    2. Tratar las células con Brefeldin A (1:1, 000) para un adicional 5 h.
    3. Lavar con PBS y del cytokine intracelular tinción como sigue:
      1. Tinción de muestras de células CD8 PE o PE-Cy7-CD4 Ab (1:50 en tampón de unión) en temperatura ambiente durante 30 minutos.
      2. Fijar en el 4% PFA a temperatura ambiente durante 20 minutos.
      3. Permeabilizar con solución de permeabilización, según las instrucciones del fabricante.
      4. Lavar las células y la etiqueta con conjugado AF647 IFN-γ Ab (1:50) por 20 min a temperatura ambiente.
      5. Lavar las células y sometidos a análisis de citometría de flujo como se describió anteriormente.

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Representative Results

Con los procedimientos generales descritos anteriormente, se examinó la viabilidad de Biotinilación superficial de BCG y la decoración con antígenos de sustituta OVA. La inmunogenicidad de la BCG modificada entonces fue probado in vivo. La superficie bacteriana fácilmente fue marcada con biotina para la visualización rápida de antígenos quiméricos avidina sin ningún cambio perceptible en fenotipos bacterianos. El BCG modificado resultante se ingiere eficientemente por las células de presentación de antígeno y puede inducir una respuesta inmune de óvulos específicos en ratones.

Generación de avidina monomérica fusión plásmidos y proteínas
Se generó un plásmido de expresión p17-Avi para que sea compatible con la metodología de Gateway que se utilizarán para producir proteínas de fusión de avidina monomérica. OVA fue clonado en p17-Avi y expresado en e. coli, purificado y replegado como se describe anteriormente (figura 1).

Biotina se conecta eficientemente a la superficie bacteriana y no afecta el crecimiento bacteriano o la supervivencia
Las bacterias fueron etiquetadas con diferentes concentraciones (0-1 mM) de biotina y teñidas para examinar la eficacia de Biotinilación superficial según protocolos anteriores. Análisis de citometría de flujo mostró un cambio total de histograma de fluorescencia en la bacteria que se marcado con biotina 0,5 mM (figura 2), y esta concentración se utilizó en este estudio para generar las bacterias biotinilado. A continuación, examinó el efecto de la modificación de la superficie bacteriana en fenotipo bacteriano y encontró que biotinilado y control sin tratan BCG muestra un perfil de crecimiento similar durante un período de 8 días (Figura 3A). Expresión de luciferasa (BCG-Luc)9 BCG fue utilizado para examinar la supervivencia bacteriana en macrófagos. Las señales de luminiscencia indicativo de viabilidad bacteriana se registraron más de 48 h. resultados obtenidos mostraron perfiles similares de disminución gradual de la viabilidad entre biotinilado y control de bacterias (figura 3B). En conclusión, estos datos indican claramente que Biotinilación superficial bacteriana no afecta crecimiento bacteriano o la supervivencia dentro de los macrófagos, que es importante ya que el aumento de la supervivencia en macrófagos podría significar un aumento en la virulencia bacteriana.

Eficacia de la decoración de la superficie bacteriana
Biotinilado bacterias estuvieron cubiertas con el péptido antígeno de OVA en fusión con avidina monomérica, según protocolos anteriores. Análisis de citometría de flujo mostró niveles mínimos de óvulos vinculantes a las bacterias no biotinilado (IMF = 8.31 ± 0,42, Figura 4A, panel superior) y niveles significativos de OVA enlace biotinilado bacterias (IMF = 54.67 ± 4.98) comparado con el control de bacterias (IMF = ± 5.92 Baja el 0,22, Figura 4A, panel).

Estabilidad de la decoración superficial de BCG
Puesto que las vacunas vivas convencionales de BCG son formuladas como polvos secos, una cuestión importante que se presentó durante este estudio fue la estabilidad del BCG modificada después de la liofilización, reconstitución y almacenamiento en refrigeraron o a temperatura ambiente. Por lo tanto, examinamos la visualización superficial de Avi-OVA en Avi de la BCG liofilizada-OVA (superficie decorada con Avi-OVA) y había decorado recién preparados bacterianos. Los resultados (Figura 4B) mostraron que niveles de Avi-huevos en la superficie bacteriana seguía siendo estable y perceptible un mes después de la liofilización y almacenamiento a temperatura ambiente en comparación con frescos preparados de BCG Avi-OVA, que demostraron que esta superficie método de decoración es adecuado para el desarrollo de una vacuna.

Fenotipo de macrófago no es afectada por la decoración de la superficie bacteriana
Para ver si esta metodología de decoración superficial interfiere con la entrada de bacteria en las células del huésped, utilizamos 264.7 células y DsRed bacterias9 para realizar un ensayo de fagocitosis se describe en el protocolo anterior. Figura 4 mostró el decorado de la superficie bacteriana BCG no tenía interferencia significativa con la entrada bacteriana (22,5 ± 1.57%) en comparación con el tipo de salvaje sin recubrimiento BCG (24.47 ± 1.18%) indica que la decoración de la superficie de BCG no tiene ningún efecto sobre los macrófagos fenotipo.

Proteínas de fusión de avidina viajan intracelular y localización conjuntamente con las moléculas de MHC
Para examinar el destino de Avi-OVA-decorado BCG dentro de los macrófagos, las células adherentes de crudo fueron infectadas y examinadas por microscopia de fluorescencia, tal como se describe en el protocolo anterior. Las imágenes obtenidas (figura 5A) mostraron que OVA Avi no sólo presentes en la superficie bacteriana, pero también individual y translocados al citoplasma distante a las bacterias. Para más verificar este resultado, realizamos un immunogold experimento la coloración y las imágenes obtenidas mostraron claramente que OVA Avi antígenos no sólo están presentes en la superficie de la BCG, pero también se pueden separar de la superficie de la BCG, cruzan la membrana phagosomal y viaje hacia el citosol (figura 5B). Para examinar más lejos si las bacterias Avi-OVA decoradas eran capaces de entregar su carga de proteína de la superficie de la vía de presentación de antígeno, los macrófagos fueron infectados con OVA Avi BCG, como se describe en el protocolo y sometidos a análisis confocales. Resultados (figura 6A) demostraron que existía colocalización de OVA Avi con moléculas-A, sugiriendo que la proteína de la fusión de avidina separado y trasladadas a compartimientos de presentación del antígeno donde fueron cargados en moléculas de MHC II. Resultados también mostraron que péptido OVA Avi localiza conjuntamente con clase I moléculas dentro de fagosomas BCG cuando mancharon para el H-2_kb (Figura 6B), que ha demostrado que hay potencial presentación de antígeno CD8 de OVA Avi+ T las células por la macrófago. Estos datos indican que una vez que adorna la superficie de las bacterias entrar en los macrófagos, los antígenos son capaces de tráfico hacia las vías de presentación de antígeno.

Superficie decorada son completamente inmunogénica
Examinar si BCG decorado superficial es capaz de inducir una respuesta inmune específica in vivo, C57BL/6 ratones fueron inmunizados con PBS solo (control), tipo BCG, OVA Avi BCG y BCG genéticamente transformadas con un plásmido para expresar una antígeno de OVA similar. Ratones inmunizados fueron sacrificados 20 días más tarde y las frecuencias de óvulos específicos CD4+ T las células y células T específicas de la OVA liberando citoquinas fueron detectadas, según el protocolo. Resultados (Figura 7A-B) mostraron una mayor proporción de óvulos específicos CD4+respuesta de los linfocitos T en animales inmunizados con BCG con Avi-OVA comparado con BCG WT. BCG genéticamente modificado para expresar OVA mostraron una respuesta inmune similar a BCG AVI-OVA (figura 7). Estos datos demostraron que el método de decoración de la superficie bacteriana es capaz de inducir una expansión significativa del antígeno específico CD4+ T las células y el grado de inducción de respuesta celular T es comparable a la BCG genéticamente modificado para expresar un OVA similar antígeno.

Desde intracelulares citoquinas también son indicadores importantes de las respuestas de células T específicas de antígeno, intracelulares citoquinas tinción (ICS) experimentos se llevaron a cabo para evaluar otras respuestas inmunes de la célula de T mediante la determinación de la expresión y las frecuencias de citoquinas efectoras en animales inmunizados con decorado de óvulos bacterias y bacterias genéticamente transformadas con un plásmido de expresión los huevos. Se examinaron los niveles de liberación de IFN-γ, que es un conocido indicador de respuesta protectora contra bacterias intracelulares11. Hemos demostrado que éramos capaces de detectar niveles de IFN-γ óvulos específicos similares liberando CD4+ de las células en animales inmunizados con superficie las bacterias decorado con ovas (BCG-Avi-OVA y BCG-p19-Avi-OVA) en comparación con los animales inmunizados con bacterias genéticamente expresando OVA (BCG-p19-OVA) (figura 8A). Lo importante, también fueron capaces de detectar frecuencias significativamente mayores de IFN-γ produce CD8 células+ T en animales inmunizados con BCG-Avi-OVA en comparación a los animales inmunizados con BCG genéticamente expresando OVA (figura 8B-C) que demuestra que la biotina-avidina mediada por superficie pantalla de metodología de antígeno puede substituir con eficacia transformación de BCG con ácidos nucleicos.

Figure 1
Figura 1: construcción de una recombinación clonación plásmido para la producción de proteínas de fusión avidina. (A) un segmento del gene codificación para monomérica avidina fue sintetizado con sitios de restricción NdeI y NotI y subcloned en pDEST17 entre la histidina 6 x y el cassette de entrada para generar plásmidos p17-Avi. OVA péptido252-345 DNA secuencias con attB sitios fueron clonadas en pDONR221. Después de eso, los genes OVA fueron subcloned en p17-Avi. Imagen editado y reproducido con permiso de PLOS ONE12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: eficacia de la BCG Biotinilación. BCG fue biotinilado con diferentes concentración de NHS-SS-biotina durante 30 min a temperatura ambiente, luego marcado con FITC-estreptavidina y analizadas por citometría de flujo. Los resultados se presentan como histogramas de intensidad de la fluorescencia verde y el insertar gráfico representa la media ± SEM de intensidades de fluorescencia media (IFM) de 3 experimentos independientes. * P < 0.05; ** P < 0.01; P < 0.001. Imagen editado y reproducido con permiso de PLOS ONE12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Biotinilación de superficie de BCG no afectó su crecimiento o su supervivencia en el macrófago. (A) Biot-BCG y control sin etiqueta tipo BCG fueron cultivadas en total 7 H 9 medios de comunicación y replicación fue supervisada durante un período de 8 días. Los resultados se expresan como las curvas de crecimiento, es decir, significan la absorbancia a 600 nm en función del tiempo ± SEM de 3 experimentos independientes. (B) los macrófagos fueron infectados con Biot-BCG-Luc o BCG-Luc sin etiqueta de control para los períodos indicados y luego celulares lisados fueron preparados y repetir el ensayo de bioluminiscencia detectar bacterias viables. Los resultados se expresan como promedio unidades relativas de luz (RLU) ± SEM de 3 experimentos independientes. Imagen editado y reproducido con permiso de PLOS ONE12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: OVA Avi a Biot-BCG y su estabilidad. (A) Biot-dsRed-BCG (bacterias expresando fluorescencia roja,9ha descrito anteriormente) y control no biotinilado dsRed-BCG se mezclaban con Avi-los huevos a temperatura ambiente durante 1 h y el alcance de la OVA vinculante se evaluó por tinción superficial con anticuerpos anti-avidina y FITC-cabra anti-conejo IgG (FL1). Las muestras fueron lavadas y analizadas por citometría de flujo. Los resultados se presentan como histogramas de intensidad de la fluorescencia verde, y los valores son promedio ± SEM de MFI de Biot-BCG-AviOVA enlace de tres experimentos independientes. (B) Biot-BCG liofilizado cubierto con Avi-OVA y recién hecho Avi-OVA-Biot-BCG fueron etiquetadas y analizadas por citometría de flujo como se describe en A. Datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes, y los valores son promedio ± SEM de MFI de Avi-OVA-Biot-BCG vinculantes obtenidos de tres experimentos independientes. (C) macrófagos RAW fueron infectados con DsRed BCG-Avi-OOVA o BCG DsRed por 24 h a 37 ° C. Muestras fueron luego lavadas, tratadas con tripsina, fijo y analizadas por FACS. Resultados se expresan como histogramas de fluorescencia roja, que reflejan el grado de fagocitosis. Los valores indican porcentaje promedio ± SEM de células ingieren BCG Obtenido de tres experimentos independientes. Imagen editado y reproducido con permiso de PLOS ONE12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: OVA Avi separada de la superficie de BCG y cruza la membrana phagosomal hacia el citosol. (A) adherente crudo células sobre cubreobjetos fueron infectadas con huevos decorados dsRed-BCG durante 24 h a 37 ° C y luego fijo/permeabilized y teñidas con anticuerpos anti-avidina y IgG de anti-conejo FITC-cabra. Las muestras fueron montadas en portaobjetos de microscopio y analizadas por microscopia confocal de la digital. Las señales rojas indican la posición de BCG y señales verdes reflejan la localización de Avi-OVA. La línea punteada indica el límite de la célula macrófago y la parte inferior derecha es de panel de 4 aumentos del inserto se muestra en el panel de la izquierda. (B) secciones finas de células RAW BCG-AviOVA infectado fueron fijadas con paraformaldehido e incubadas secuencialmente con anticuerpo anti-avidina y conjugados con oro de cabra anti-conejo IgG visualizar OVA Avi y examina con un microscopio electrónico. Ampliación de 12.000 X se muestra. Las puntas de flecha indican OVA Avi disociado de la superficie de BCG y exportada más allá de la membrana del fagosoma. Las imágenes mostradas son representantes de dos experimentos independientes. Imagen editado y reproducido con permiso de PLOS ONE12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: antígeno de avidina-fusión localizado conjuntamente con MHC clase II y moléculas de clase I. Las células adherentes de BMA3.1A7, una línea de celular de macrófagos de ratón, estaban infectadas con OVA decoradas GFP-BCG (expresando verde fluorescente, previamente descritos9) durante 4 h y luego estimuladas con IFN-γ para 24 h. células luego fijo/permeabilized y teñidas con anticuerpos anti-avidina, Alexa 594 anti-conejo IgG y Alexa 647 rata ratón anti-A (A) o Alexa 647 rat anti-mouse H-2_kb (B). Las muestras fueron montadas en portaobjetos de microscopio y analizadas por microscopia confocal de la digital. Señales verdes que indican la posición de BCG-GFP y señales rojo reflejan la localización de Avi-OVA. Las señales azules indican la posición del MHC de clase II o clase I moléculas. La línea punteada indica el área de interés. Puntas de flecha indican colocalization OVA Avi con las moléculas de MHC. Imágenes que se muestran son representantes de dos experimentos independientes. Imagen editado y reproducido con permiso de PLOS ONE12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: En vivo CD4+ respuesta de la célula de T a BCG huevos decorados. Ratones C57BL/6 fueron inyectados por vía subcutánea con BCG superficie decorada con BCG no modificado tipo salvaje, PBS (control), OVA, BCG transformados genéticamente para expresar OVA (BCG-p19-OVA) o transformados con control plásmido y superficie decoración con (Avi-OVA BCG-p19-AviOVA). Después de un período de 20 días, esplenocitos fueron preparados a partir de los bazos de eutanasia animales y manchados con conjugado con PE-Ab-tetrámeros de323-339 OVA (A) seguido por anticuerpo CD4 AF647 y 7-AAD. Las muestras entonces se analizaron por citometría de flujo. Los resultados se expresan como diagramas de punto de dos parámetros que muestran las frecuencias promedio ± SEM de tetrámero sucesos positivos en el CD4+ población de dos animales/grupo. Datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes (un total de seis ratones fueron examinados con muestras de células de cada ratón se evaluó por triplicado). Los datos en gráficos (B) se expresan como media ± SEM de valor de la cifra absoluta (en un total de 500.000 eventos) de tetrámero OVA CD4 específicas de las células en+ de grupo de animales de dos y de tres experimentos independientes. * P < 0.05; ** P < 0.01; P < 0.001. Imagen editado y reproducido con permiso de PLOS ONE12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: frecuencia de células T liberando citoquinas en respuesta a OVA Avi revestido vacunación antituberculosa. Esplenocitos de ratones inmunizados con PBS, BCG tipo, superficie de BCG WT decorado con ovas Avi, BCG-p19-OVA y BCG-p19-AviOVA fueron estimuladas con la proteína recombinante de la OVA 16 h seguido por un tratamiento período de h 5 con Brefeldin A. Cells eran entonces lavadas y manchado primero con Cy7 PE anti-CD4 (A) o (B) del anticuerpo del anti-CD8 PE entonces AF647 del anticuerpo anti-IFN-γ. Las células entonces lavadas y analizadas por citometría de flujo. Los resultados se expresan como punto dos parámetros parcelas para mostrar las frecuencias promedio ± SEM de subconjuntos de células productoras de IFN-γ en CD4+ y CD8+ las poblaciones de dos animales/grupo. Datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes (un total de seis ratones fueron examinados con muestras de células de cada ratón se evaluó por triplicado). Los datos en gráficos (C) se expresan como la media de absoluta número ± SEM de IFN-γ liberando CD4+ T las células (gráfico izquierdo) o IFN-γ liberando CD8+ T de las células (gráfico derecho) del grupo de animales de dos y tres experimentos independientes. * P < 0.05; ** P < 0.01; P < 0.001. Imagen editado y reproducido con permiso de PLOS ONE12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Reportamos en este estudio un enfoque no genéticos para la visualización rápida y eficaz de proteínas exógenas en superficie de BCG para añadir antígenos específicos o propiedades funcionales específicas previstos mejorar eficientemente la inmunogenicidad de la bacteria. Hemos demostrado que la superficie de la célula de BCG podría ser fácilmente biotinilado para decoración instantánea de la superficie con proteínas de fusión de la avidina. El procedimiento total puede realizarse dentro de 2 h, mientras que la transformación genética y selección de clones positivos requiere 2 a 3 meses de retraso. Modificación superficial no afecta a la supervivencia y el crecimiento bacteriano. Las bacterias decoración con antígenos de sustituta OVA fueron capaces de entregar el antígeno en la vía de presentación de antígeno e inducida por la respuesta inmune específica in vivo, que fue evaluada por ensayos de citometría de flujo, incluyendo la tinción de tetrámero de MHC y citoquinas intracelulares tinción (ICS). Lo más importante, en vivo los estudios demostraron claramente que adorna la superficie de las bacterias eran capaces de inducir niveles similares de respuesta inmune frente a BCG genéticamente modificado a los antígenos expresan similares.

Avidina biotina interacción es la interacción no-covalentes más fuerte conocida en la naturaleza con una Kd 10−15 M13. No es sólo una herramienta útil utilizada en la investigación biológica14, pero también ha demostrado ser aplicable en cáncer terapia15,16. En este estudio, se aplicó una triple mutación (N54A, W110K y N17I) a tipo avidina convertir tetramérica avidina en forma monomérica avidina que ha reducido significativamente la afinidad de la avidina-biotina (Kd= 10−7 M) y se une reversible a la biotina. Este avidina monomérica se utilizó para desarrollar un plásmido p17-Avi que es compatible con la recombinación de puerta de enlace de la reproducción (Invitrogen) para una expresión rápida de un solo paso de una proteína de interés. Esta nueva versión de avidina monomérica tiene varias ventajas incluyendo la prevención de la gran masa bacteriana agregación transitoria y reversible bacteriana superficial de mostrar y de proteínas de interés. Por lo tanto, una vez ingeridos por la célula huésped, proteínas de fusión Avi pueden separar de la superficie de las bacterias biotinilado y el tráfico intracelular. Por último, las mutaciones convierten avidina forma no glicosilada que podría ser aplicable en levaduras o plantas transgénicas17,18 para la producción de grandes cantidades de proteínas de fusión de avidina en sistemas eucarióticos. Esta forma de avidina monomérico fue elegida en lugar de una versión de estreptavidina monomérica (mSA)19, que tiene secuencias de estreptavidina y rhizavidin y tenía una mayor afinidad de unión (Kd 10−9 M) Comparado con mAvidin. Con pruebas preliminares, proteína quimera de mSA tenía una eficiencia mucho menor enlace biotinilado bacterias en comparación con la proteína quimera mAvidin. Este estudio, por lo tanto, se basa en mAvidin, pero estreptavidina monomérica u otras formas de avidina/estreptavidina también sería una posibilidad para otras aplicaciones.

Exitosa implementación de los protocolos descritos depende de la calidad de la proteína de fusión generada y la eficiencia de la Biotinilación superficial bacteriana. Proteínas eluídas Avi-la etiqueta deben ser la salada y buffer intercambiados en PBS con el concentrador de proteínas de peso molecular adecuado. Precipitación puede ocurrir en factores de alta concentración de algunas proteínas, por lo tanto, factor de concentración debe ser probado y determina con pequeñas cantidades de proteínas eluídas en primer lugar, por ejemplo, 0,5 a 1 mL de cuerpos de inclusión solubilizados diluido en 20 mL de PBS y entonces concentrado. También es importante mantener la temperatura de la proteína alrededor de 4 ° C durante todo el proceso para evitar la precipitación.

Para mejorar la eficiencia de Biotinilación superficial bacteriana, biotina Sulfo-NHS SS debe almacenarse en su envase original en la oscuridad a 4 ° C. El reactivo es muy humedad sensible; por lo tanto, deben equilibrarse frascos el reactivo a temperatura ambiente antes de abrirlos. También, solución stock de biotina (10 mM) debe ser hecha inmediatamente antes de su uso como hidroliza la molécula de éster de NHS y muy rápidamente a ser no reactiva. Solución madre de biotina no puede ser almacenado y reutilizado; un nuevo vial de biotin es necesario para cada experimento de Biotinilación. Para mejores resultados, se recomiendan cultivos frescos de BCG, medios frescos, así como tampones frescos. Como se menciona en el protocolo, biotinilado y revestido BCG podrían liofilizado y conservados al menos durante 30 días sin afectar la calidad de la capa superficial. Esto es particularmente útil al enviar o transferir las muestras de un lugar a otro o cuando se realizan experimentos de curso largo.

Este método de decoración de la superficie de BCG también ofrece otras interesantes posibilidades para analizar y evaluar la inmunogenicidad de candidatos vacuna recientemente desarrollada de una manera rápida y precisa. El objetivo principal de novela vacunas TB es inducir a las células de tipo TH1 como CD4+ y CD8+ T células que jugar papeles importantes en la protección contra la tuberculosis. El sistema avidina-biotina desarrollado en este estudio ofrece una herramienta muy útil para evaluar las respuestas de estas células T. Esta novedosa tecnología de mostrar rápidamente antígenos de proteínas recombinantes en superficie de BCG representa una gran herramienta para evaluar rápidamente y con precisión la eficacia protectora de muchas proteínas inmunogénicas (p. ej., segregada específica m. las proteínas) y así puede traducirse en el desarrollo de vacunas eficientes.

Ajustando y variando la concentración de proteínas de Avi-fusión en la superficie bacteriana, podría ser otra de las ventajas de este método mostrar simultáneamente diversos antígenos de interés en la superficie bacteriana para maximizar la efectividad de la vacuna. Puesto que los estudios han demostrado que la BCG interfiere con funciones de macrófagos importantes como fagosoma maduración20,21 y antígeno presentación21, una posibilidad para mejorar la BCG podría decorar superficie de BCG con una combinación de factores conocidos para acelerar la maduración del fagosoma junto con antígenos de interés.

Algunas limitaciones de esta tecnología incluyen el requisito de la producción a gran escala de proteínas recombinantes, que podrían ser difíciles y costosos en áreas de bajos ingresos. Además, producir mucho para purificar proteínas requeriría optimización y solución de problemas. Sin embargo, estas limitaciones pueden eludirse con el mejoramiento de tecnologías de producción de proteína recombinante. Otra limitación incluye la posibilidad de que naturalmente que ocurren contra avidina anticuerpos comunes en animales y seres humanos de laboratorio22 podrían dificultar el uso de avidina con fines terapéuticos. Sin embargo, otros laboratorios han probado la seguridad y eficacia de la terapia de la avidina y han demostrado que de avidina seguridad y eficacia no fueron significativamente afectadas por su inmunogenicidad23. Curiosamente, convirtiendo la avidina tetramérica de tipo salvaje en una forma monomérica significativamente había disminuido su inmunogenicidad24.

Para resumir, esta novedosa tecnología utiliza un sistema avidina-biotina para mejorar la inmunogenicidad de la BCG a través de una rápido y reproducible no-bacteriana superficial modificación genética con las proteínas de interés puede sustituir con éxito a transformación tradicional de BCG con plásmidos que codifican el antígeno. Además, este novedoso método puede facilitar no sólo la mejora de la actual vacuna BCG, pero también puede proporcionar una nueva plataforma para la evaluación rápida de prácticamente cualquier antígeno o proteínas normalmente difíciles de expresar genéticamente en BCG, con amplia aplicaciones en el desarrollo de una vacuna TB.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Dr. R Stokes para la cepa BCG Pasteur y Talal A. para soporte técnico. También agradecemos GenScript ayuda con síntesis del gene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endotoxin-free RPMI 1640 StemCell Technologies  36750
Sulfo-NHS SS biotin Thermo Fisher  21328
FITC-conjugated streptavidin Sigma-Aldrich S3762
Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer  MBL International  TS-M710-1
7-AAD BD Pharmingen 559925
TALON polyhistidine-Tag purification resin  Clontech 635501
Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
AF647 rat anti-mouse IFN-g BD Bioscience  557735
AF647 rat anti-mouse I-A/I-E BD Bioscience  562367
PeCy7 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  552775
PE rat anti-mouse CD8 Ab BD Bioscience  561095
AF 647 rat anti-mouse H-2kb BD Bioscience 562832
FITC-conjugated goat anti rabbit antibody Thermo Fisher 31635
AF 647 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG Electron Microscopy Sciences 25100
Middlebrook 7H9 broth BD Diagnostic Systems 271310
OADC BD Diagnostic Systems B11886
Tween 80 Sigma-Aldrich P1379
RAW 264.7 murine macrophage cell lines American Type Culture Collection
pDEST17 plasmid  Invitrogen 11803012
pUC57-OVA plasmid  GenScript SD1176
BP clonase  Invitrogen 11789020
LR clonase  Invitrogen 11791043
pDONR221 plasmid Invitrogen 12536017
Ni-NTA columns  Qiagen 31014
Pierce protein concentrators  Thermo Fisher  88527
Flurosave Calbiochem-Novabiochem 345789
Axioplan II epifluorescence microscope Carl Zeiss Inc
CCD digital camera  Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV electron microscope  FEI Company G2 200Kv 
70μm Falcon cell strainer  Thermo Fisher  87712
EasyStep mouse biotin positive selection kit  StemCell 18556
biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody BioLegend 116203
Brefeldin A BD Pharmingen 555029
Cytofix/Cytoperm kit  BD Pharmingen 554714
Bright-Glo Luciferase assay system Promega e2620
Turner Biosystem luminometer  Promega TD-20/20
Leica EM UC6 microtome  Leica Microsystems UC6
Novalyphe NL 500 freeze dryer Savant Instruments  NL 50
Wheaton boroscilicate glass vials Wheaton  VWR 66011-675

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References

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Inmunología número 131 Mycobacterium tuberculosis los macrófagos respuesta inmune proteínas recombinantes las células T antígenos biotina avidina-biotina
Expresión de antígenos exógenos en la vacuna de BCG de <em>Mycobacterium bovis</em> por genética no decoración de superficie con el sistema avidina-biotina
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