Se describe un protocolo para generar la proliferación y fibroblastos dérmicos humanos primarios quietos, seguimiento las tasas de decaimiento de transcripción y la identificación de genes diferencialmente decadentes.
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Artículo de método
Determinar tasas de decaimiento de transcripción del genoma en quietos y proliferación de fibroblastos humanos
En este artículo
Resumen
Resumen
Quietud es un estado temporal, reversible en el que las células han dejado de división celular, pero conservan la capacidad de proliferar. Varios estudios, incluido el nuestro, han demostrado que la quietud se asocia con cambios generalizados en la expresión génica. Algunos de estos cambios se producen a través de cambios en el nivel o la actividad asociada a la proliferación de factores de transcripción, como E2F y MYC. Hemos demostrado que el decaimiento del mRNA también puede contribuir a cambios en la expresión génica entre células proliferantes y quietas. En este protocolo, se describe el procedimiento para el establecimiento de culturas quietas y proliferación de fibroblastos humanos de prepucio cutáneo. A continuación describimos los procedimientos para inhibir la nueva transcripción en las células proliferantes y quietas con actinomicina D (ActD). ActD tratamiento representa un enfoque sencillo y reproducible a disociar la nueva transcripción de la descomposición de la transcripción. Una desventaja del ActD tratamiento es que el curso del tiempo debe ser limitado a un corto plazo porque ActD afecta la viabilidad celular. Niveles de transcripción son monitoreados en el tiempo para determinar las tasas de decaimiento de transcripción. Este procedimiento permite la identificación de genes y de isoformas que exhiben decaimiento diferencial en proliferación contra fibroblastos quiescentes.
Introducción
Niveles de estado estacionario de transcripciones reflejan la contribución de síntesis transcripción y decaimiento de la transcripción. Regulado y coordinado de la transcripción es un importante mecanismo de control de procesos biológicos1,2,3,4. Por ejemplo, tasas de decaimiento de transcripción han demostrado para contribuir a la serie temporal de acontecimientos después de la activación por el factor de necrosis tumoral citoquinas inflamatorias del5.
Previamente hemos demostrado que la t....
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Protocolo
Todos los experimentos descritos fueron aprobados por comités de revisión institucional en la Universidad de Princeton y la Universidad de California, Los Ángeles.
1. preparar los fibroblastos proliferantes y contacto-inhibido para ActD tiempo curso
Nota: Este protocolo usa una timecourse con cuatro puntos de tiempo. Pueden recogerse tres muestras biológicamente independientes por punto por la recogida de las placas de cultivo de tejidos diferentes en un experimento, o el experimento puede repetirse varias veces con diferentes culturas de las células. En nuestra experiencia, un plato de cultivo de tejidos de 10 cm ....
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Resultados
Hemos divulgado previamente los resultados de análisis de microarray de las tasas de decaimiento de transcripción en fibroblastos humanos primarios proliferación e inhibida por el contacto durante un tiempo de 8 horas curso12. Se proporciona una lista de genes con un cambio significativo en la estabilidad de la transcripción comparación de fibroblastos proliferantes y contacto-inhibida en la tabla adicional 1. Se proporcionan las intensidades de fl.......
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Discusión
Quietud puede ser inducida por señales externas, incluyendo retiro de mitógenos o suero, falta de adhesión celular y la inhibición de contacto. Inhibición de contacto, uno de varios posibles métodos para inducir la quietud, es un proceso altamente evolutionarily conservado en el que las células de salida ciclo celular proliferativo en respuesta a contacto de célula a célula. Nos centramos aquí en inhibición de contacto como un ejemplo de un método para inducir la quietud. Estudios previos han reportado que contacto célul.......
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Divulgaciones
Los autores tienen intereses que compiten a revelar.
Agradecimientos
HAC fue la Milton E. Cassel de la Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Este trabajo fue financiado por subvenciones para HAC (P.I. David Botstein), Instituto Nacional de Ciencias de Medicina General del centro de la beca de excelencia P50 GM071508 PhRMA Foundation grant 2007RSGl9572, ciencia nacional Fundación beca OCI-1047879 David agosto, Nacional Institute of General Medical Ciencias R01 GM081686, Instituto Nacional de ciencias médicas General R01 GM0866465, Eli & Edythe Broad Center de medicina regenerativa & investigación con células madre, centro de salud/UCLA CTSI NIH de la mujer Iris Cantor Grant UL1TR000124 y la sociedad de la l....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Centrífugas para tubos de microcentrífuga capaces de alcanzar 12.000 x g y 4&°; C | |||
| Equipos para la circulación de geles de | |||
| Placas de cultivo de tejidos estériles y tubos | |||
| Eagle Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Suero fetal bovino | VWR | 35-010-CV | |
| Pipetas serológicas estériles, pipetas y puntas de pipeta para el cultivo de tejidos | |||
| Pipetas, puntas de pipeta y tubos desechables sin ARNasa envueltos individualmente para el aislamiento y el análisis | |||
| Guantes desechables para usar cuando se manipulan reactivos y muestras | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | Para descontaminar superficies de trabajo de RNasa Tubos |
| Eppendorf de 2,0 ml | |||
| Tripsina-EDTA Solución 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Estéril PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomicina D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibe la transcripción |
| DMSO estéril | Fisher Scientific | 31-761-00ML | disolvente para actinomicina D |
| Cloroformo | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc |
| producto Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | grado de biología molecular |
| Etanol | Fisher Scientific | BP28184 grado de biología molecular | |
| Glucógeno libre de ARNasa (solución acuosa de 20 mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | portador para precipitación de ARN |
| Kit sin ADN TURBO | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | elimina el ADN con DNasa y, a continuación, en un paso posterior, inactiva el ADN y elimina los cationes divalentes |
| Agarosa | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc |
| producto Colorante de carga para gel de ARN | Thermo Fisher Scientific | R0641 | adecuado incluso para la electroforesis desnaturalizante |
| Marcadores de ARN del | milenioEscalera | ARN | Thermo Fisher Scientific AM7150 |
| Kit de espiga de ARN de un solo color | Agilent Technology | 5188-5282 | Ejemplo de control de picos para el análisis de microarrays Agient |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 grado de | biología molecular, para tampón TAE |
| Ácido acético glacial | Fisher Scientific | A38-500 | para tampón TAE |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 grado de | electroforesis, para geles |
| Bromuro de etidio | Millipore Sigma | E7637 | para biología molecular |
| Controles externos de ARN Consorcio Mezcla de ARN con picos Thermo | Fisher Scientific | 4456740 Control de picos para RNA Seq | |
| TruSeq Biblioteca de ARNm trenzado TruSeq Kit de preparación A (48 muestras, 12 índices) | Illumina | RS-122-2101 | para RNA Seq |
| Placa de PCR de 0,3 ml de 96 pocillos | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | para qPCR en tiempo real |
| Sellos adhesivos Microseal B | Bio-Rad | MSB1001 | para qPCR en tiempo real |
| Depósitos de reactivos sin RNASA/Dnasa | VWR | 89094-662 | para qPCR en tiempo real |
| Sin RNASA/Dnasa Ocho tiras de tubo y tapones Thermo | Fisher Scientific | AM12230 | para qPCR |
| en tiempo realSuperScript Transcriptasa inversa | Invitrogen | 18090010 | para qPCR en tiempo real |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | para qPCR en tiempo real |
Referencias
- Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
- Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R.
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Reimpresiones y permisos
