En este protocolo, describimos las técnicas para la adecuada disección de flores de Arabidopsis y silicuas, algunas técnicas de compensación básica y seleccionado procedimientos de observaciones del conjunto de montaje de estructuras reproductivas de tinción.
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Artículo de método
Whole-mount y coloración de silicuas y órganos flor de Arabidopsis
En este artículo
Resumen
Resumen
Debido a sus formidables herramientas para los estudios genéticos moleculares, thaliana de Arabidopsis es una de las especies más destacadas del modelo en biología de plantas y, especialmente, en la biología reproductiva de plantas. Sin embargo, planta anatómica, morfológica y análisis ultraestructurales implican tradicionalmente lentos incrustar y seccionamiento procedimientos para campo brillante, análisis y microscopia electrónica. Recientes avances en la microscopía de fluorescencia confocal 3D asistido por ordenador microscópicos análisis de estado de la técnica y el refinamiento continuo de técnicas moleculares para ser utilizado en muestras mínimamente procesadas, todo Monte, ha llevado a una mayor demanda de desarrollo de técnicas de procesamiento de muestra eficiente y mínimo. En este protocolo, describen técnicas para disecar correctamente flores de Arabidopsis y silicuas, claro técnicas básicas y algunos procedimientos de tinción para montaje todo observaciones de estructuras reproductivas.
Introducción
Flores están definiendo entre los más importantes órganos de las angiospermas. Plantas con flores aparecieron hace unos 90 millones años1y tan rápido que su aparición rápida fue descrito como un "misterio abominable" por Charles Darwin2. El interés de los investigadores de planta en el desarrollo de la flor son diverso. Algunas investigaciones se ha centrado en comprender el origen evolutivo de la flor como un todo, o la evolución de características anatómicas, estructurales y funcionales de flores3,4,5,
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Protocolo
1. flor y fijación de silicua
- Flores de la cosecha y silicuas de plantas sincronizan en la inauguración de la primera flor.
Nota: Bajo las condiciones experimentales utilizadas aquí, plantas Inicio floración aproximadamente 21 días después del trasplante de las placas de Murashige y Skoog (MS) al suelo. Semillas estratificadas durante 3 – 4 días a 4 ° C y germinado/cultivadas en placas de MS de 22 ° C/16 h luz y 18 ° C/8 h oscurezca durante 8 a 10 días, antes de transplantar las plántulas en suelo rico en nutrientes en macetas bajo las mismas condiciones (figura 1). El número de repeticiones depende del objetivo específico de....
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Resultados
Arabidopsis pertenece a la familia Brassicacea, teniendo las inflorescencias con flores bisexuales dispuestas en un corimbo (figura 1). Cada flor tiene 4 sépalos, cuatro pétalos, seis estambres (cuatro largos y dos cortos) y un Gineceo sincárpico de dos congénitamente carpelos (Figura 1F-H) dispuestos en cuatro verticilos concéntricos25,26. A.......
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Discusión
La existencia de muchos brotes de flor en una inflorescencia simple de Arabidopsis, que abarca todas las etapas del desarrollo flor, ofrece una oportunidad única para estudios tendientes a caracterizar un efecto de un tratamiento o una característica del desarrollo al mismo tiempo a través de las diferentes etapas de desarrollo de la flor. Un punto de referencia entre diferentes plantas individuales es la apertura de la primera flor de la inflorescencia principal. Las plantas son tratadas de tal manera que se si.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Universidad de Zurich, un IEF Marie Curie Grant (grant no. TransEpigen-254797 a A.H.), una beca avanzada del Consejo Europeo de investigación (no de la concesión. Medea-250358 a U.G.) y un proyecto de investigación y desarrollo tecnológico (grant MecanX a U.G.) de SystemsX.ch, la iniciativa Suiza en biología de sistemas.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivos y materiales | |||
| Etanol | Scharlau | ET00102500 | |
| Ácido Acético | Applichem | A3686,2500 | 100% Grado de biología molecular |
| Ácido acético glacial | Sigma-Aldrich 320099 | Grado de biología molecular | |
| Metanol | Scharlau | ME03062500 | |
| Solución de formaldehído | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Ácido propiónico | Sigma-Aldrich | 81910-250 ml | |
| Hidrato de cloral | Sigma-Aldrich | 15307 | |
| Glicerol | Roth | 3783.1 | |
| Goma arábiga | Fluka | 51198 | |
| Ácido láctico | Fluka | 69773 | |
| Fenol | Sigma-Aldrich | 77607-250ML | Utilizamos fenol líquido (use la densidad para encontrar el volumen requerido para su solución) |
| Aceite de clavo | Sigma-Aldrich | C8392-100ML | |
| Xileno | Roth | 4436.1 | |
| Yodo | Fluka | 57665 | |
| Yoduro de potasio | Merck | 5043 | |
| Malaquita | Verde Fluka | 63160 | |
| Ácido fucsina | Fluka | 84600 | |
| Naranja G | Sigma | 7252 | |
| Dodecil Sulfato de Sodio | Sigma-Aldrich | L3771 | Grado de Biología Molecular |
| Hidróxido de sodio | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Di-Hidrógeno Fosfato de Sodio | Applichem | A1047,1000 | |
| Fosfato de Sodio Dibásico | Sigma-Aldrich | S9763-1KG | |
| Fosfato de potasio | Sigma-Aldrich | 04347 | |
| EDTA | Applichem | A2937,1000 | |
| Calcofluor | Sigma | F6259 | Abrillantador fluorescente 28 |
| Auramine | Chroma | 10120 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | tóxico |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | |
| Azul anilina | Merck | 1275 | |
| MS medium | Carolina | 19-57030 | |
| Sustrato rico en nutrientes | Einheitserde | ED73 | |
| Vidrio | Sin marca específica | ||
| Tubos de centrífuga falcon de 15 ml VWR | 62406-200 | ||
| Pinzas Dumond | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| Pinza | DUMONT BIOLOGY | 0108-5 | |
| Jeringa | BD | BD Plastipak 300013 | 1 ml |
| Aguja de preparación | BD | BD Microlance 304000 | |
| Portaobjetos de microscopio | Thermo Scientific | 10143562CE | cortados |
| Cubreobjetos | Thermo Scientific | DV40008 | |
| Caja | Una caja de plástico con toalla de papel húmeda y soportes deslizantes en el interior | ||
| Name | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| Solutions> | |||
| Fijadores | |||
| de Carnoy (Farmer) | Etanol absoluto : ácido acético glacial, 3:1 (ml:ml) | ||
| Metanol/ácido | 50 % (v/v) metanol, 10 % (v/v) ácido acético glacial en agua desionizada | ||
| Fijador | Formalina, ácido propiónico, etanol al 50%; 5:5:90 (ml:ml:ml) | ||
| Soluciones de aclarado | |||
| Hidrato de cloral/glicerol | Hidrato de cloral : glicerol : agua, 8:1:2 (g:ml:ml). Se puede utilizar para todas las etapas de desarrollo de las flores y para el desarrollo de silicio con microscopía DIC. El mejor fijador es la goma arábiga a base de formalina FPA50 | ||
| Modified Hoyer | 7,5 g, hidrato de cloral 100 g, glicerol 5 ml, agua 30 ml. Se puede utilizar para todas las etapas de desarrollo de las flores y para el desarrollo de silicio con microscopía DIC. El mejor fijador es el fluido | ||
| Herr's 4½ | ácido láctico, hidrato de cloral, cristales de fenol, aceite de clavo, xileno; 2:2:2:2:1, en peso. Se puede utilizar para todas las etapas de desarrollo de las flores (especialmente para el desarrollo de los estambres) y para el desarrollo de la silícula con microscopía DIC. El mejor fijador es la | ||
| SDS/NaOH | : Mezclar-diluir la SDS y la solución madre de NaOH a 1% SDS / 0,2 N NaOH (dilución 10x). Para todas las etapas de desarrollo de la flor y la silicona. El mejor fijador es el fijador de ácido metano/acético; También se pueden utilizar los otros dos fijadores. Se puede combinar con calcofluor, auramina, DAPI y solución de tinción con azul de anilina. | ||
| madre SDS | 10 % (p/v) de dodecil sulfato de sodio. Disuelva 10 g de dodecil sulfato de sodio en 80 ml de agua desionizada y haga hasta 100 ml con agua desionizada. | ||
| madre de NaOH | 2 N Solución de NaOH: disolver 4 g de NaOH en 40 ml de agua desionizada y enrasar hasta 100 ml con agua desionizada | ||
| Soluciones combinadas de limpieza y tinción | |||
| Herr's IKI-4½ | A un estándar 4½ (9 g en total) añadir: 100 mg de yodo, 500 mg de yoduro de potasio. Esta solución de limpieza se puede utilizar para todas las etapas de desarrollo de las flores y para el desarrollo de la silicona, ya sea para aumentar el contraste o para caracterizar la dinámica del almidón. Utilice FPA50 para el análisis estructural y el fijador de Carnoy para el análisis cuantitativo del almidón. | ||
| Etanol de tinción | 95% 10 ml, verde de malaquita (1 % en EtOH al 95 %) 1 ml, ácido fucsina (1 % en ddH2O) 5 ml, naranja G (1% en ddH2O) 0,5 ml, fenol 5 g, hidrato de cloral 5 g, ácido acético glacial 2 ml, glicerol 25 ml . Este aclarado/tinción solo o en combinación con el 4½ de Herr; La solución se puede utilizar para evaluar el aborto del polen en flores con granos de polen maduros y tricelulares. Se utiliza en material no fijo recién cortado. | ||
| tinción fuertes | |||
| calcofluor | fuerte Calcofluor 0,007% en agua (g:ml). Originalmente se utilizaba como blanqueador óptico. Se puede utilizar para teñir celulosa, polisacáridos carboxilados y calosa en las paredes celulares. Se utiliza con frecuencia para teñir la tina del grano de polen. Los tres fijadores se pueden utilizar con esta solución. | ||
| Solución de | auramina Auramina 0,01% en agua (g:ml). Este tinte fluorescente lipofílico se puede utilizar para teñir cutículas, cutina y exina, entre otros. Los tres fijadores se pueden utilizar con esta solución | ||
| de calcofluor y auramina | Solución de auramina : Solución de calcofluor, 3:1. Se puede utilizar para una tinción combinada con ambas soluciones. Se pueden ensayar otras proporciones manteniendo una menor proporción de calcofluor con respecto a la auramina. | ||
| Solución | DAPI DAPI 0,4 ug/ml, tampón de fosfato sódico 0,1 M (pH 7), Triton-X-100 al 0,1%, EDTA al 1 mM. Esta solución se puede utilizar para teñir las diseminaciones de los cromosomas durante la meiosis masculina y femenina, y los núcleos celulares de cualquier tejido. Se utiliza con frecuencia para estudiar el desarrollo del grano de polen. El Carnoy y el metanol/ácido acético son los mejores fijadores para esta solución. Los fijadores a base de formaldehído, como FPA50, pueden interferir con la tinción. Excitación en el UV y emisión máxima alrededor de 461 nm. | ||
| Tampón de fosfato de sodio (0,1 M) | Receptor de protones: 0,2 M Na2HPO4, donante de protones: 0,2 M NaH2PO4, relación donante de protones / receptor de protones: 1,364 ( para un pH 7) | ||
| azul de anilina | 0,1% (p/v) azul de anilina, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glicerol. Esta solución se puede utilizar para teñir calosa y celulosa de muchas etapas de desarrollo (por ejemplo, deposición de calosa en teradas macho y hembra, tapones de calosa en tubos polínicos). Excitación en el UV y emisión máxima alrededor de 455. También se puede excitar a 514 nm con emisión en rojo para la tinción del contenido celular. |
Referencias
- Crane, P. R., Friis, E. M., Pedersen, K. R. The origin and early diversification of angiosperms. Nature. 374 (6517), 27-33 (1995).
- Friedman, W. E. The meaning of Darwin's 'abominable mystery'. Am J Bot. 96 (1), 5-21 (2009).
- Sun, G., Dilcher, D. L., Zheng, S., Zhou, Z.
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Reimpresiones y permisos
