Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zum isolieren und Kultur Osteoklasten in Vitro aus Maus Knochenmark und zur Untersuchung der Rolle von Säugetieren/mechanistischen Ziel von Rapamycin Komplex 1 in Osteoklasten-Formation.
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Methodenartikel
Ein RANKL-basierte Osteoklasten Kultur Assay der Maus Knochenmark zu untersuchen, die Rolle von mTORC1 in Osteoklasten Bildung
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Osteoklasten sind einzigartige Knochen-resorbierbarem Zellen, die von der Monocyte/Makrophagen-Linie des Knochenmarks zu unterscheiden. Dysfunktion von Osteoklasten kann eine Reihe von metabolischen Knochenerkrankungen wie Osteoporose führen. Um pharmazeutische Ziele für die Vermeidung von krankhaften Knochenschwund Masse zu entwickeln, müssen die Mechanismen, durch die Osteoklasten aus Vorstufen unterscheiden, verstanden werden. Die Fähigkeit zu isolieren und eine große Anzahl von Osteoklasten in-vitro- Kultur ist entscheidend, um die Rolle bestimmter Gene in Osteoklasten Differenzierung bestimmen. Inaktivierung von Säugetieren/mechanistischen Ziel von Rapamycin Komplex 1 (TORC1) in Osteoklasten kann Osteoklasten Anzahl verringern und Knochenmasse zu erhöhen; jedoch bedürfen die zugrunde liegenden Mechanismen weiterer Untersuchungen. In der vorliegenden Studie wird ein RANKL-basiertes Protokoll zu isolieren und Kultur Osteoklasten aus Maus Knochenmark und Untersuchung des Einflusses von mTORC1 Inaktivierung auf Osteoklasten Formation beschrieben. Dieses Protokoll führte erfolgreich eine große Anzahl von riesigen Osteoklasten in der Regel innerhalb einer Woche. Löschen von Raptor beeinträchtigt Osteoklasten Bildung und nahm die Aktivität des sekretorischen Tartrat-resistente saure Phosphatase, anzeigend, dass mTORC1 für Osteoklasten Bildung entscheidend.
Einleitung
Knochen ist ein ständig wechselnden Organ und wird von Osteoblasten und Osteoklasten zeitlebens umgebaut. Osteoklasten sind verantwortlich für mineralisierten Matrix Resorption und Osteoblasten zu synthetisieren und sezernieren neue Knochen Matrizen1. Die Balance zwischen Knochenabbau und Knochenaufbau ist entscheidend für die Knochengesundheit, einschließlich der Wartung der Knochen Masse und Reaktion auf Stimulation und Verletzungen. Wenn dieses Gleichgewicht gestört ist, kann eine Reihe von metabolischen Knochenerkrankungen wie Osteoporose und parodontale Erkrankungen auftreten. Bei diesen Erkrankungen übersteigt Knochen Masse Verlust infolg....
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Protokoll
Alle Verfahren in Bezug auf die Tiere wurden nach dem Protokoll von der Stanford-Verwaltungs-Panel auf Laboratory Animal Care (APLAC) genehmigt durchgeführt und wurden durch die Animal Care and Use Committee des Shanghai Institute für Biochemie und Zelle genehmigt Biologie.
1. Vorbereitung
- Generieren von Osteoklasten bestimmte Raptor Löschung Mäuse (Raptorfl/fl; Ctsk-Cre, jenseits CtskRap) bei der Paarung Raptorfl/fl -Mäuse mit Ctsk-Cre Mäuse. Verwenden Sie die Raptorfl/fl -Mäuse als WT-Kontrolle in dieser Studie.
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Ergebnisse
Mit Hilfe dieses Protokolls, wurden eine große Anzahl von riesigen Osteoklasten am 6. Tag gesehen; Wenn riesige Osteoklasten nicht gesehen werden, möglicherweise einen weiteren Tag der Osteoklasten Differenzierung benötigt (Abbildung 1). Erfolgreiche Osteoklasten Bildung bestätigte Falle Färbung (Abbildung 2A). Osteoklasten waren Wein rot/violett Riesenzellen mit mehr als 3 Kerne. Mehr als 250 Osteoklasten wurden in jede Vertiefu.......
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Diskussion
Die Osteoclastogenic-Assay ist die am weitesten verbreitete Methode zur Isolierung und Kultur Osteoklasten in-vitro-12,13. Während mehrere RANKL-basierte Osteoklasten Induktionen beschrieben13,14,15gewesen sein, beschrieben die vorliegende Studie ein Protokoll mit einigen Änderungen basierend auf den bisherigen Methoden.
In der vorang.......
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Offenlegungen
Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Die Autoren danken Dr. Minghan Tong und S. Kato für freundlicherweise die Reagenzien und Mäuse. Wir danken die Mitgliedern des Zou Lab für nützliche Diskussionen. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch Zuschüsse von 973-Programm aus dem chinesischen Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST) [2014CB964704 und 2015CB964503], klinische Forschungsprogramm des 9. Volks Krankenhaus, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Danke für die Hilfe von Core Facility für Zellbiologie und Core Facility für chemische Biologie, CAS Zentrum für Exzellenz in der molekularen Zelle Wissenschaft, Shanghai Institut für Biochemie und Zellbiologie, Chinese Academy ....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Raptorfl/fl | Mäuse Das Jackson Laboratory | 013188 | |
| Ctsk-cre Mäuse | ein Geschenk von S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| α-MEM | Corning | 10-022-CVR | |
| Glutamin | Gibico | 25030081 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibico | 15140122 | |
| Fötales Kälberserum | BioInd | 04-001-1A | |
| Rekombinantes Maus-M-CSF-Protein | R& D | Q3U4F9 | |
| Rekombinantes Maus-RANKL-Protein | F& D | Q3TWY5 | |
| Erythrozyten-Lysepuffer | Beyotime | C3702 | |
| Trypanblau | Sigma-Aldrich | 302643 | |
| Aceton | Shanghai Chemical Co., Ltd. | ||
| Citratlösung | Sigma-Aldrich | 915 | |
| Formaldehydlösung | Shanghai Chemical Co., Ltd. | ||
| Saure Phosphatase, Leukozyten (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | |
| Fast Garnet GBC Basislösung | Sigma-Aldrich | 3872 | |
| Natriumnitritlösung | Sigma-Aldrich | 914 | |
| Naphthol AS-BI Phosphatlösung | Sigma-Aldrich | 3871 | |
| Acetatlösung | Sigma-Aldrich | 3863 | |
| Tartratlösung | Sigma-Aldrich | 3873 | |
| Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Corning | 21-031-CVR | |
| L-Weinsäure | Sigma-Aldrich | 251380 | |
| Natriumtartrat zweibasische Dehydratisierung | Sigma-Aldrich | s4797 | |
| Glycin | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| MgCl2 | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| ZnCl2 | Shanghai Chemical Co., Ltd. | ||
| NaOH | Shanghai Chemical Co., Ltd. | ||
| Phosphatase-Substrat | Sigma-Aldrich | P4744 | |
| anti-Raptor | Cell Signaling Technology | 2280 | |
| anti-P-ribosomales Protein S6 (S235/236) | Cell Signaling Technology | 2317 | |
| anti-ribosomales Protein S6 | Cell Signaling Technology | 2211 | |
| anti-β-Aktin | Santa Cruz Biotechnologie | sc-130300 | |
| 37% Formaldehyd | Xilong wissenschaftliche | ||
| Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membran | Bio-Rad | ||
| Western Chemilumineszenz HRP Substrat (ECL) | Millipore | 00000367MSDS | |
| IX71 | Olympus | ||
| Envision | Perkin Elmer | ||
| 0,45-mm-Spritze | |||
| Schere | |||
| Mückenzange |
Referenzen
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics<....
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Nachdrucke und Genehmigungen
