线粒体衍生肽处理后用于ERK激活的亚细胞组分分离

摘要

本方案描述了如何使用线粒体来源的肽段刺激细胞，并评估磷酸化蛋白的信号级联反应及其定位。

摘要

线粒体衍生肽（Mitochondrial-derived peptides, MDPs）是一类新型肽，由线粒体基因组中已知基因内的小型开放阅读框编码。MDPs 具有多种生物学效应，例如保护神经元免于凋亡、改善代谢指标以及保护细胞免受化疗损伤。Humanin 是首个被发现的 MDP，也是 MDP 家族中研究最为深入的肽。Humanin 的膜受体及下游信号通路已得到系统表征。近年来新发现的其他 MDPs，如 MOTS-c 和 SHLP1-6，其信号传导机制仍有待阐明。本文介绍一种基于细胞培养的方法，用于确定这些肽的功能。特别是，细胞分馏技术结合蛋白质印迹法（western blotting），可实现对关键信号分子激活状态和转位过程的定量分析。尽管存在其他细胞分馏方法，但本文所述方法简便且直接。这些方法可用于进一步阐明此类肽及其他治疗剂的作用机制。

引言

新兴研究表明，线粒体衍生肽（mitochondrial-derived peptides, MDPs）在细胞保护和代谢过程中发挥着重要作用^1,2,3。了解在MDPs存在条件下信号转导通路的变化，有助于揭示MDPs调控多种功能的作用机制。首个被发现的MDP——humanin，已被证实可通过与其受体结合，促进细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2）的磷酸化^4,5。然而，ERK1/2激活后的下游效应仍尚未被充分研究。

ERK1/2级联反应是多种细胞过程的关键介导因子，包括增殖、细胞迁移、细胞代谢、存活以及凋亡^6,7,8。为了协调这些不同的细胞过程，ERK1/2的活性和亚细胞定位受到磷酸酶和支架蛋白的严格调控^9,

方案

1. 肽处理细胞

1. 接种两百万个SH-SY5Y或HEK293细胞（2 × 10⁶）⁶) 转入10 cm培养皿中，培养2天
2. （可选）次日，用无血清的DMEM培养基洗涤细胞一次，若处理需在无血清培养基中进行，则加入无血清DMEM培养基过夜孵育。
3. 第3天，将S14G-humanin肽溶解于经0.2 µm滤膜过滤的蒸馏水中，重悬配制成1 mM的储存液。
   注意：肽应溶解于适当的溶剂中，具体溶剂可根据肽的序列特性确定例如，总电荷）如果肽段为商业产品，制造商可能会提供相关信息。例如，S14G-humanin、SHLP2、SHLP6 和 MOTS-c 可溶于水。将肽段分装为适当的体积（例如，50 μL）以避免反复冻融。解冻后请勿再次使用。
4. 将预热的含血清或无血清培养基分装至50 mL锥形管中，并加入室温保存的1 mM储备液，使其达到工作浓度（例如，1 µM，10 µM。
5. 更换为6 mL步骤1.4中制备的肽溶液，孵育细胞适当时间。
   注意：根据您激活 ERK 的实验条件选择孵育时间。

2. 细胞质与细胞核的亚细胞组分分离

1. 用 10 mL 冰冷的 PBS 洗涤细胞两次，加入 5 mL 冰冷的 PBS 刮下细胞，并将细胞悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中。....

结果

采用本文所述方法，我们在完全培养基中分别用1 μM和100 μM的S14G-humanin（一种强效的humanin类似物²¹）处理HEK293和SH-SY5Y细胞，处理时间为指定时长（图1A和图1B）。随后，我们检测了总蛋白提取物中ERK1/2在Thr²⁰²/Tyr²⁰⁴位点的总形式及其磷酸化形式。结果显示，S14G-humanin处理可增加ERK1/2在其调控位点Thr²⁰²/Tyr²⁰⁴的磷酸化水平。ERK1/2的亚细胞定位在其信号转导功能中起重要作用，尤其影响其作用特异性。为了明确S14G-humanin介导的ERK1/2激活的作用靶点，我们分析了S14G-humanin处理后总ERK1/2及其磷酸化形式的亚细胞分布。在HEK293细胞中，磷酸化.......

讨论

在此，我们证明了人源素肽介导的ERK1/2激活可在两种不同的细胞类型中发生，并且活化ERK1/2的亚细胞定位可能因条件不同而有所差异（例如，肽的剂量、时间点和细胞类型）。已有研究表明，人源素通过两种不同的受体传递信号^22,23，这或许可以解释两种细胞系之间信号传导的差异，以及对人源素不同剂量的需求。这一现象的生理学意义尚未得到充分研究，但可能提示了一种HN在不同组织中产生依赖性反应的潜在机制。

ERK1/2 的磷酸化在 ERK1/2 信号通路中起着关键作用，且 ERK1/2 的磷酸化状态呈现动态变化。优化实验条件以确定在特定条件或刺激下 ERK1/2 磷酸化的时间点至关重要。为此，可尝试不同的刺激条件（例如，刺激剂量和培养基），并进行时间进程实验，以确定磷酸化水平达到最高的时间点。大多数研究仅关注全细胞裂解液中的 ERK1/2 磷酸化情况。然而，由于 ERK1/2 可在特定亚细胞区域与不同靶分子相互作用，并调控不同的下游级联反应，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
p44/42 MAPK (ERK1/2)	细胞信号传导	9102	稀释比例 1:1,000
磷酸化-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)	细胞信号传导	4370	稀释比例 1:1,000
Lamin B1	细胞信号传导	12586	核标记物，稀释比例 1:1,000
GAPDH	细胞信号传导	5174	胞质标记物，稀释比例 1:2,000
Tom20	Santa Cruz	SC-17764	线粒体标记物，稀释比例 1:2,000
抗兔-HRP 偶联抗体	Cell Signaling	7074	稀释比例 1:30,000
RIPA 裂解与提取缓冲液	ThermoFisher SCIENTIFIC	89900
100 mm 培养皿	ThermoFisher SCIENTIFIC	12556002
HNG 肽	Genescript
25 mm 注射器滤器	ThermoFisher SCIENTIFIC	09-719A
HEPES	Sigma	H3375
MgCl₂	Sigma	M8266
KCl	Sigma	P9333
甘油	Sigma	G9012
Triton X-100	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP151-100
EDTA	Sigma	3609
MOPS	Sigma	M1254
EGTA	Sigma	E3889
蔗糖	Sigma	S7903
Tris-base	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP152-1
HCl	Sigma	H1758
PBS	Lonza	17-512F
细胞刮刀	FALCON	353085
Halt™ 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液 (100X)	ThermoFisher SCIENTIFIC	78440
Thomas 光滑杵组织研磨器组件	Thomas Scientific	3432S90
Tween-20	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP337-500
BSA	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP1600-100
8-16% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶	BIO RAD	4561104
Mini Trans-Blot 转膜模块	BIO RAD	1658030
Trans-Blot Turbo 快速转膜系统	BIO RAD	1704150
Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF 转膜试剂盒	BIO RAD	1704272
Clarity Western ECL 化学发光底物	BIO RAD	1705060
Restore Western blot 剥脱缓冲液	ThermoFisher SCIENTIFIC	21059
DMEM 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）	ThermoFisher SCIENTIFIC	11965-092
超声破碎仪，型号：FB120	ThermoFisher SCIENTIFIC	695320-07-12