Este protocolo describe cómo estimular las células con péptidos derivados de mitocondrial y evaluar la cascada de señalización y localización de fosfo-proteínas.
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Artículo de método
Fraccionamiento subcelular para la activación de ERK a péptidos derivados de mitocondrial tratamiento
En este artículo
Resumen
Resumen
Péptidos de origen mitocondrial (MDPs) son una nueva clase de péptidos que son codificadas por Marcos de lectura abiertos pequeños dentro de otros genes conocidos del genoma mitocondrial. MDPs con una amplia variedad de efectos biológicos tales como proteger a las neuronas de la apoptosis, la mejora de marcadores metabólicos y protegiendo las células de la quimioterapia. Humanin fue el primer MDP por descubrir y es el péptido más estudiado entre la familia MDP. Los receptores de membrana y vías de señalización corriente abajo de humanin se han caracterizado cuidadosamente. MDPs adicionales como MOTS-c y SHLP1-6 han sido descubiertos más recientemente y los mecanismos de señalización tienen todavía ser aclarada. Aquí describimos un método basado en la cultura de célula para determinar la función de estos péptidos. En particular, técnicas de fraccionamiento celular en combinación con western blot permiten la determinación cuantitativa de la activación y translocación de la molécula de señalización importante. Mientras que hay otros métodos de fraccionamiento celular, descrito aquí es un método fácil y sencillo. Estos métodos pueden utilizarse para aclarar más lejos el mecanismo de acción de estos péptidos y otros agentes terapéuticos.
Introducción
Emergentes los estudios demuestran que los péptidos derivados de mitocondrial (MDPs) desempeñan papeles importantes en citoprotección y metabolismo1,2,3. Comprensión de la vía de transducción de señal en presencia de MDPs nos da información sobre el mecanismo por el cual MDPs modulan varias funciones. El primer identificado MDP, humanin, se ha demostrado para aumentar la quinasa regulada por señal extracelular 1/2 (ERK1/2) fosforilación a través de su receptor binding4,5. Sin embargo, el efecto aguas abajo de la activ....
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Protocolo
1. tratamiento de péptidos a las células
- placa 2 millones SH-SY5Y o células HEK293 (2 x 10 6) en 10 cm plato y cultivan durante 2 días
- (opcional) el siguiente día, lavar las células con el suero Dulbecco ' s modificado Águila media media (DMEM) una vez y se incuba con suero DMEM libre toda la noche si el tratamiento debe hacerse en medios libres de suero.
- El día 3, disolver humanin S14G péptidos en 0.2 μm filtrada, agua destilada y reconstituir como solución madre de 1mM.
Nota: Los péptidos deben ser disuelto en el disolvente apropiado, que puede ser determinado por las características de la secuencia del péptido (
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Resultados
Utilizando el procedimiento presentado aquí, tratamos las células HEK293 y SH-SY5Y con 1 μM y 100 μM S14G-humanin, un análogo humanin potente21, respectivamente, en completar los medios de comunicación durante los períodos de tiempo indicado (figura 1 y figura 1 B). a continuación examinamos la forma fosforilada y total de ERK1/2 en Thr202/Tyr204 de .......
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Discusión
Aquí, demostramos que humanin mediada por el péptido de la activación de ERK1/2 se presenta en dos diferentes tipos de células, y la localización subcelular de activados ERK1/2 puede ser diferente dependiendo de las condiciones (p. ej., dosis de péptido, punto del tiempo y de la célula tipo). Se ha demostrado que humanin señales a través de dos diversos receptores22,23, que puede explicar las diferencias en la señalización entre las dos variedades de cél.......
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Divulgaciones
Pinchas Cohen es un accionista y consultor de CohBar, Inc. Kelvin Yen ha servido como consultor para CohBar, Inc.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por una Beca Postdoctoral de Ellison/lejos en el programa de investigación envejecimiento a Santa Justa Klan, y un premio de la Fundación de Glenn y NIH concede a PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Todos los autores aparecen en la película.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| p44/42 MAPK (ERK1/2) | Señalización celular | 9102 | Dilución 1:1.000 |
| phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204) | Señalización celular | 4370 | Dilución 1:1.000 |
| Lamin B1 | Señalización celular | 12586 | Marcador nuclear, dilución 1:1.000 |
| GAPDH | Señalización celular | 5174 | Marcador citoplasmático, dilución 1:2.000 |
| Tom20 | Santa cruz | SC-17764 Marcador de | mitocondrias, Dilución 1:2.000 |
| anti-Rabbit-HRP conjugado | Señalización celular | 7074 | Dilución 1:30.000 |
| Tampón de lisis y extracción RIPA | ThermoFisher SCIENTIFIC | 89900 | |
| 100 mm Plato de cultivo | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12556002 | |
| péptido HNG | Genescript | ||
| 25mm filtro de silinga | ThermoFisher SCIENTIFIC | 09-719A | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP151-100 | |
| EDTA | Sigma | 3609 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Sacarosa | Sigma | S7903 | |
| Tris-base | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP152-1 | |
| HCL | Sigma | H1758 | |
| PBS | Lonza | 17-512F | |
| Rascador de celdas | FALCON | 353085 | |
| Halt™ Cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa (100X) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 78440 | |
| Thomas Mortle Conjuntos de trituradoras de tejidos con morteros lisos | Thomas Scientific | 3432S90 | |
| Tween-20 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP337-500 | |
| BSA | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP1600-100 | |
| 8-16% Mini-PROTEAN TGX Geles de | proteínas prefabricadosBIO RAD | 4561104 | |
| Mini Módulo Trans-Blot BIO | RAD | 1658030 | |
| Sistema de Transferencia Trans-Blot Turbo | BIO RAD | 1704150 | |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini Kit de Transferencia de PVDF | RAD | 1704272 | |
| Clarity Western ECL Sustratos de transferencia | BIO RAD | 1705060 | |
| Restore Western blot | ThermoFisher SCIENTIFIC | 21059 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11965-092 | |
| Sonicator, Medel: FB120 | ThermoFisher SCIENTIFIC | 695320-07-12 |
Referencias
- Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance. J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).
- Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. Humanin: a novel central regulator of peripheral ins....
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Reimpresiones y permisos
