Summary
En simpel metode til at opnå NK og T-celle kloner fra CAEBV patienter blev udviklet med høj effektivitet, en lille mængde af perifert blod og en lav-dosis af IL-2.
Abstract
En række metoder har været beskrevet at etablere NK/T cellelinjer fra patienter med lymfom eller Lymfoproliferative syndrom. Disse metoder ansat feeder celler, renset NK eller T celler med så meget som 10 mL blod eller en høj-dosis af IL-2. Denne undersøgelse præsenterer en ny metode med en kraftfuld og enkel strategi at etablere NK og T-celle linier ved dyrkning af perifert blod mononukleære celler (PBMC) med tilsætning af rekombinant humant IL-2 (rhIL-2), og bruger så lidt som 2 mL fuldblod. Cellerne kan formere sig hurtigt i to uger og opretholdes i mere end 3 måneder. Med denne metode, er der etableret 7 NK eller T-celle linier med en høj succesrate. Denne metode er simpel, pålidelig og gælder for oprettelse af cellelinjer fra flere tilfælde af CAEBV eller NK/T celle lymfom.
Introduction
Epstein - Barr virus (EBV) er allestedsnærværende og inficerer ikke kun B-celler, men også T og natural killer (NK) celler, der forårsager en række EBV-associerede NK/T Lymfoproliferative sygdomme (LPD) og lymfom/leukæmi, såsom EBV-associerede hemophagocytic lymphohistiocytosis, hydroa vacciniforme-lignende lymfom, extranodal T-NK-celle lymfom, nasal type og aggressive NK celle leukæmi1,2,3. Blandt disse er svær kronisk aktiv EBV (SCAEBV) sygdom, som er hændelse hovedsagelig i Østasien, og der nu betragtes som værende en LPD forårsaget af klonal ekspansion af EBV-inficerede T eller NK celler4,5,6, 7, men uden den tilsyneladende immundefekt præsentere i infektiøs mononukleose (IM)-som symptomer, herunder feber, hepatosplenomegaly, lymfadenopati og leverdysfunktion vedvarende eller regelmæssige vareleverancer, samt høj EBV-DNA belastning i den perifert blod8,9. Patienter med CAEBV har en dårlig prognose10,11, og dens patogenese og EBV rolle er uklart. Derfor, cellelinjer afledt af EBV-associerede NK/T Lymfoproliferative sygdomme og lymfomer er meget nyttige som cell modeller for afklaring mekanisme af EBV induceret NK eller T-celle spredning og sine forbindelser med høj forekomst af leukæmi eller lymfom.
Til dato har adskillige cellelinjer etableret med forskellige teknikker12,13,14,15,16. En menneskelig NK cellelinie, NK-YS, blev etableret fra NK celle lymfom/leukæmi, co dyrkning med en mus stromale cellelinie som feeder, og rhIL-2 i en koncentration på 20U pr. mL15. KAI3 var en anden NK cellelinie etableret fra patienter med en svær myg allergi eller SCAEBV med autolog lymphoblastoid cellelinje (LCL), B-celler forvandlet af EBV, som feeder cellerne og tilsætning af rhIL-2 på 100U/mL16. SNK6 og SNT8 var afledt af tumor væv af nasal NK/T celle lymfom patienter ved at tilføje højdosis rhIL-2 (700U/mL)12. Med lignende teknik var cellen SNK-1 fra CAEBV patienter, kulturperler fra PBMC ved fjernelse af T-celler og tilføje 700U/mL af rhIL-213,17. SNT13 og SNT15 blev etableret ved at fjerne CD4 + og CD8 + celler18. Hidtil, blev andre T-celle og NK cellelinjer fra EBV-NK/T LPD patienter alle udviklet med denne metode19.
Ulemperne ved de eksisterende metoder nævnt ovenfor omfatter beskæftigelse af feeder celler, kravet om en høj-dosis IL-2, udnyttelse af så meget som 10 mL fuldblod eller rensning af NK/T-celler, som er meget udfordrende i klinikken grund nødvendigheden af at kontrollere, hvilke typer af celle at EBV latent inficerer før begyndelsen til kultur. Som CAEBV primært opstår hos børn i Asien, er 10 mL blod ikke let at erhverve i alle regioner. I denne undersøgelse udviklede vi en ny enkel metode med en høj succesrate at etablere NK og/eller T-celle linier ved dyrkning PBMC fra CAEBV patienter ved hjælp af en lav-dosis af rhIL2 og en volumen på 2 mL fuldblod uden feeder celler. Resultaterne af denne metode har bevist sin høje effektivitet og tidsbesparende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Institut for Genetik og udviklingsmæssige biologi, kinesiske Academy of Sciences, og protokollen følger de institutionelle retningslinjer for menneskelig velfærd.
Bemærk: Se figur 1 for en skematisk af arbejdsprocessen.
1. isolering af PBMC fra CAEBV patienter
- Rense primære PBMC fra 2 mL fuldblod af CAEBV patienter af gradient (f.eks.Ficoll-plak) centrifugering efter fabrikantens anvisninger. Alternativt, tø befrugtede PBMC fra flydende kvælstof med RPMI 1640 medium.
- Tilføj 2 µL af trypan blå (0,4%) til 18 µL cellesuspension, venter på 3 min pletten celler, overføre suspension til celle counter plade og måle celler koncentration og levedygtighed med en automatiseret celle counter.
- Forberede cellesuspension med en tæthed på 2-3 × 106 celler/mL suppleret med komplet RPMI 1640 næringssubstratet indeholdende 20% humant serum (varme inaktiveres ved 56 ° C), 2 mM L-glutamin, og antibiotika (100 µg/mL streptomycin, 100 U/mL penicillin). Frø 1 mL af PBMC suspension pr. brønd i 24-godt celle kultur plader.
- Tilføj 150 U rhIL-2 pr. brønd.
- Placere kultur plader i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C.
- På dag 2, observere celle morfologi under et mikroskop (200 X forstørrelse); celler er i god stand, når de er lyse og runde.
2. udvidelse af celler og nummerering af levedygtige celler
- Observere celle morfologi under et mikroskop (200 X forstørrelse), og overvåge tilstanden af cellevækst af nummerering cellerne før du ændrer medium: tilføje 2 µL af trypan blå (0,4%) til 18 µL cellesuspension, og beregne celler koncentration (Se 1.2, Figur 2).
- Kassér 500 µL af medium i en 24-godt plade, og tilføje 500 µL frisk komplet kultur medium. Tilføj 150U rhIL-2 pr. brønd.
- Ændre medium to gange om ugen som i trin 2.2.
- Tegne celle vækstkurve (figur 3).
- Når de levedygtige celler koncentration overstiger 5 × 106/mL, opdele celler i nye brønde i en koncentration på 1-2 × 106 celler/mL i hver brønd. Denne proces tager 2-4 uger.
3. celle fænotyper ved flowcytometri
- Når cellerne har udvidet, indsamle 1 × 106 celler for at bestemme fænotyper af cellelinjer. Centrifugeres celler ved 240 x g i 5 min. ved stuetemperatur (NK/T-celler vil bundfald i bunden af røret).
- Supernatanten, vaske udfældning ved at tilføje 7 mL PBS. Der centrifugeres i 5 min ved 240 x g ved stuetemperatur. Gentag én gang.
- Tilføje 200 µL humant serum til hver tube, bland godt og inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur.
- Der centrifugeres celler ved 240 x g i 5 min ved stuetemperatur. Supernatanten og genopslæmmes celler på 1 × 106/mL med kolde PBSA (PBS+0.2%BSA). Opdele celler i 5 rør, hver tube indeholder 2 × 105 celler.
- Centrifuge celler ved 240 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten og genopslæmmes celler med PBSA buffer eller PBSA indeholdende 10 µL PE (eller PE-Cy7) og 10 µL FITC mærket antistoffer for at plette cellereceptorer af T eller NK celler på isen, som er angivet af figur 4. Celler suspenderet med PBSA buffer er brugt som en negativ kontrol.
- Inkuber celler med antistoffer for 20-30 min på is i mørke.
- Cellerne vaskes to gange med kolde PBSA, genopslæmmes celler med 300 µL koldt PBSA.
- Analysere celle fænotype med et flow Flowcytometret.
- Oprettet den flyde forskellige i "Oprette regneark" tilstand. Oprettet den eksperimentelle skabelon med en dot plot, der viser forward scatter (FSC) versus side scatter (SSC).
- Indlæse isotype kontrol røret for at optimere FSC og SSC spændinger, og optimere FSC tærskelværdien for at fjerne snavs uden at forstyrre den celle befolkning af interesse. Slet alle parametre, bortset fra FSC, VSK, FITC, PE og PE-Cy7.
- Udføre kompensation ved hjælp af kontrolelementet isotype og en enkelt positiv kontrol i hvert 2-farve analysegruppe.
- Indlæse prøver og oprette HLA-DR VS CD19, CD4 VS CD8, CD56 VS CD16 og CD3 VS CD16 dot parceller viser forskellige befolkning af celler.
Bemærk: PBMC blev brugt til at udføre kompensation ved hjælp af kontrolelementet negativ/isotype og enkelt positiv kontrol. 2-farve immunfluorescens med flow forskellige blev brugt rutinemæssigt at analysere udtryk for overflade markører. De følgende antistoffer er inkluderet: anti-HLA-DR, anti-CD4, anti-CD16 konjugeret med fluorescein isothiocyanat (FITC), anti-CD8, anti-CD56, CD3 konjugeret med phycoerythrin (PE), og anti-CD19 konjugeret med PE-Cy7.
4. udvidelse og kryopræservering af celler, NK/T
- Ændre medium, når celle fænotype analyse er afsluttet. Forsigtigt fjerne halvdelen af supernatanten og undgå at berøre cellerne i bunden af pladen. Tilføje den samme mængde frisk næringssubstratet indeholdende 300 U/mL rhIL-2 til celle-plader.
- Ændre halvdelen af medium hver 3 dage (som 2.2) indtil cellen klynger er klart synlige under mikroskop (figur 2). Typisk, denne proces tager 2-3 uger.
- Overføre cellerne fra 24-godt plader til T25 kultur kolber efter blanding forskellige wells af samme slægt. Dobbelte volumen af næringssubstratet udvides som det bliver gul indtil mængden af medium til 10-15 mL. Tilføj rhIL-2 med koncentrationen af 150 U/mL.
- Ændre medium 24 timer før frysning efter 2-3 uger vokser, når cellen masse kan ses med det blotte øje. Måle celle koncentration med en celle counter.
- Centrifugeres cellesuspension i 5 min ved 240 x g, og genopslæmmes celle pellet med en tæthed på 5-10 x 106 celler/mL med den frosne stamopløsning, som indeholder 90% føtal bovint serum og 10% dimethylsulfoxide (DMSO). Fryse på en rate på 1 ° C pr. min til-80 ° C og derefter overføre direkte til flydende kvælstof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter 3 dage kultur under etableringen af cellelinjer, begynder polymorfe cellerne at dukke (figur 2). Efter 7 dage vokse celler hurtigt, da både antal og levedygtighed af celler er øget med en høj hastighed (figur 3). Små klynger af celler er klart synlig efter 10-14 dage vokser, når celle koncentrationen kan overstige 3-6 × 106. I denne periode, bør celler udvides ved opdeling i to eller tre brønde i kultur-pladen. Om en måned senere, engang celle nummer når 3-5 × 107, Greven er høj nok til konservering.
Et andet vigtigt spørgsmål er at bestemme fænotyper, når cellerne har været kulturperler med succes. Vores resultater viser at Thomsen (L196) og NK (M296) celler kan være kulturperler ved metoden beskrevet ovenfor (figur 4), og cellelinjer kunne oprettes med denne teknik, som cellerne voksede mere end 3 måneder i god stand.
Figur 1: skematisk gengivelse af arbejdsprocessen. På den første dag, blev antikoagulerende blod indsamlet fra CAEBV patienter, så PBMC blev isoleret og kulturperler med 1640 medium indeholdende 20% human serum og 150U/mL af rhIL-2. NK/T-celler blev dyrket ved 37 ° C i 5% CO2. Efter 2-4 uger dyrkning, begyndte cellerne til at vokse hurtigt. Når koncentrationen overstiger 5 × 106 /mL, opdelt vi celler i 2-3 brønde ved koncentration af 2 × 106. Fortsætter kulturen for 2-3 uger, blev celler overført fra den 24-godt plade i T25 kolbe når celle klynger var klart synlige under mikroskop. Cryopreserve celler når cellen masse kan ses med det blotte øje. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: cellulære morfologiske ændringer ved at dyrkning. Celler er kulturperler og observeret for det angivne antal dage. Polymorfe celler (pile pegede) var synlige under mikroskop klart efter 3-7 dage, og cellerne begyndte at vokse hurtigt efter 7-14 dage kultur. Den oprindelige forstørrelse til lysmikroskopi var 200 X. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: vækstkurver af celledelingen. Efter 7 dage for dyrkning, begyndte cellerne til at vokse hurtigt (A) og med høj rentabilitet (B). Celler koncentration og levedygtighed blev målt ved en automatiseret celle counter med følgende fremgangsmåde: tilføje 2 µL af trypan blå (0,4%) til 18 µL af cellesuspension til farvning, vent 3 min, overføre suspension til celle counter plade og måle celler koncentration og cellernes levedygtighed med en automatiseret celle counter. Fejllinjer er standardafvigelser tre replikaer. L196, Z290, M296, L311 er navnene på fire cellelinjer. Den begyndende koncentration at måle vækstkurven er omkring 3 × 106. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative gating strategi for flow flowcytometri analyse af cellelinjer L196 og M296. PBMC blev brugt til at justere FSC og SSC spændinger. Klynge af levende og enkelt lymfocytter var gated for P1 i FSC og SSC plot. Isotype kontrol og enkelt positive kontroller blev brugt til at udføre kompensation. Fire par 2-farve immunofluorescens konjugeret antistoffarvning blev brugt til at analysere udtryk for overflade markører. Anti-HLA-DR og anti-CD19 blev brugt til at registrere B-celler, der henviser til, at anti-CD3, anti-CD4 og anti-CD8 blev brugt til at registrere T-celler. Anti-CD16 og anti-CD56 blev brugt til at definere NK-celler. (A) Fænotypen af L196 er CD19-HLA-DR + CD16-CD56 + CD3 + CD4 + CD8 +, den største celletype er CD8 +. (B) M296 er CD19-HLA-DR + CD16 + CD56 + CD3-CD4-CD8 +, den største celletype er CD16 + CD56 +. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol, er blevet udviklet en ny teknik til oprettelse af NK/T cellelinjer fra fuldblod af CAEBV patienter. Sammenlignet med de eksisterende metoder, er den største fordel ved denne metode dets enkelhed og sit krav om kun en lille mængde blod, mens det udviser en høj succesrate og gode betingelser for cellernes levedygtighed. NK/T cellelinjer kan desuden etableres ved dyrkning PBMC uden fastsættelse af celletyper EBV latent inficerede på forhånd som bestemmelse ville forbruge mere blod og tid før dyrkning. Alternativt, cellelinjer kan analyseres og forskellige fænotyper af celler kan renses med flowcytometri efter cellecenter linje. Desuden metoden bruger en lav dosis af rhIL-2 og brug ingen feeder celler. Med denne metode, har vi udviklet 7 cellelinjer fra 8 CAEBV patienter og cryopreserved dem inden for en måned. Der ikke har udviklet sig til en cellelinje kan opretholdes i live i mere end 5 måneder uden betydelig spredning, og årsagerne til dette har brug for yderligere udforskning.
Det er nødvendigt at bemærke, at cellevækst er strengt afhængig af tilstedeværelsen af rekombinant humant IL-2, som er i overensstemmelse med tidligere rapporter20,21; med ingen menneskelige IL-2 dør cellerne i 3 uger. Åbenbart, en høj kvalitet af IL-2 er afgørende for celledelingen, selv om de faktorer, der bestemmer proliferativ kapaciteten af celler in vitro- skal stadig afklares. Dosis af IL-2 kræves er variabel blandt forskellige cellelinjer, eksempelvis 50U/mL er tilfredsstillende at fastholde spredning af M296. Men, den mest økonomiske og pålidelige koncentration for oprettelse af NK/T cellelinjer ikke er blevet forelagt i undersøgelsen; faktisk, 150 U/mL er tilstrækkelig for succes.
I denne proces af celle dyrkning af de elementer, der påvirker cellevækst, er levedygtigheden af primære PBMC det vigtigste. For at sikre succes, bør PBMC være så frisk som muligt. Utvivlsomt, celle koncentration er en vigtig faktor, der påvirker vellykket dyrkning, derfor tærskelværdien bør ikke lavere end 105 pr. mL. Hvis cellen total antal isoleret fra prøven er mindre end 10 er6, ved hjælp af en mini godt celle plade til at opretholde en passende celle koncentration en alternativ valg i den oprindelige kultur. Derudover kunne NK og T-celle linje etableret med endnu en begrænset mængde af perifert blod, når du bruger den hæmolytiske reaktion til at berige PBMC som vi rapporterede tidligere22. Som beskrevet i protokollen, er den menneskelige serum en anden vigtig faktor for celle overlevelse i begyndelsen af kulturen. Vi spekulere, at nogle ukendt ingredienser findes i serum, der er fraværende eller forskellige i føtal bovint serum og er nødvendige for T/NK celledelingen.
Der er to begrænsninger i metoden. Først, der er flere ubesvarede spørgsmål om denne metode, såsom hvordan og hvorfor EBV inficerer NK eller T celler i vivo, mekanismer i NK/T celle vækst og spredning in vitro, og hvad typer af celle kan være etableret i cellelinjer i én patient. Selvom vi ikke kunne styre celletype og renhed, som ikke bestemmes af metoden, kan disse faktorer være afhængige af cellerne EBV inficerer patienter. Med denne protokol, kunne NK og T celler være etableret i cellelinjer, selvom denne metode ikke kunne fortrinsvis kultur én type. Der er dog en dominerende gruppe af disse celler. For det andet var der en rapport, som NK og T-celle kloner fra patienter med LPD eller NK/T lymfom kunne fastsættes til cellelinjer, mens andre kan bevares for flere måneder17. Celler fremstillet i nærværende undersøgelse kan formere sig langt over 3 måneder, men om de kunne formere sig på ubestemt tid skal valideres.
I Resumé, ved hjælp af denne metode kan flere cellelinjer fra CAEBV eller NK/T lymfomer opnås nemt med en begrænset mængde af blod og en lav-dosis af IL-2 uden feeder celler. Disse cellelinjer vil bidrage til undersøgelse af EBV persistensen i NK/T-celler og patogenese af EBV forbundet leukæmi eller lymfom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.Z., X.Z. og X.C. er co opfindere om verserende patentansøgninger, der dækker potentielle anvendelser af denne metode til fastlæggelse af NK/T cellelinjer og cellelinjer etableret i denne undersøgelse. D.Z., X.Z. og X.C. erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser i dette arbejde. De resterende Forfatterne erklærer, de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af nøglen projekter af kinesiske Academy of Sciences (KFZD-SW-205), strategiske biologiske ressourcer teknologi Support System af kinesiske Academy of Sciences (CZBZX-1 og ZSSB-004), og af tilskud fra National Science Foundation of China ( 81401640) og Shanghai naturvidenskab fond (14ZR1434800).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
References
- Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
- Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
- Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
- Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
- Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency? Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
- Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
- Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
- Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
- Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
- Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
- Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
- Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
- Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
- Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
- Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
- Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
- Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
- Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
- Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326 (2011).
- Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
- Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
- Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
- Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).
