Summary
En enkel metode for å få NK og T-celle kloner fra CAEBV pasienter ble utviklet med høy effektivitet, en liten mengde perifert blod og en lav dose av IL-2.
Abstract
En rekke metoder har blitt beskrevet å etablere NK/T cellelinjer fra pasienter med lymphoma eller lymphoproliferative syndrom. Disse metodene ansatt mater celler, renset NK eller T celler med så mye som 10 mL blod eller en høy dose av IL-2. Denne studien presenterer en ny metode med en kraftig og enkel å etablere NK og T-celle linjer av dyrking tilleggsutstyret blod mononukleære celler (PBMC) med tillegg av rekombinant menneskelige IL-2 (rhIL-2), og bruker så lite som 2 mL fullblod. Cellene kan spre seg raskt i to uker og opprettholdes i mer enn 3 måneder. Med denne metoden ble 7 NK eller T celle linjer opprettet med en høy suksessrate. Denne metoden er enkel, pålitelig og relevant å etablere linjer fra flere tilfeller av CAEBV eller NK/T celle lymfom.
Introduction
Epstein - Barr virus (EBV) er allestedsnærværende og infiserer ikke bare B celler, men også T og naturlig killer (NK) celler, som forårsaker en rekke EBV-assosiert NK/T lymphoproliferative sykdommer (LPD) og lymfom/leukemi, som EBV-assosiert hemophagocytic lymphohistiocytosis, hydroa vacciniforme-lignende lymfom, extranodal NK/T-celle lymfom, nasal type og aggressiv NK celle leukemi1,2,3. Blant disse er alvorlige kroniske aktive EBV (SCAEBV) sykdom, som er hendelsen i Sørøst-Asia, og som er nå regnet som en LPD skyldes klonal ekspansjon EBV-infiserte T eller NK celler4,5,6, 7, men uten den tilsynelatende immunsvikt presentere i mononukleose (IM)-som symptomer som feber, hepatosplenomegaly, lymfadenopati og leveren dysfunksjon vedvarende eller recurrently, i tillegg til høy EBV-DNA laste den perifert blod8,9. Pasienter med CAEBV har en dårlig prognose10,11og sin patogenese og rollen til EBV er uklart. Derfor cellelinjer avledet fra EBV-assosiert NK/T lymphoproliferative sykdommer og lymfomer er svært nyttig som cellen modeller for avklare mekanismen av EBV indusert NK eller T celle spredning og sitt forhold med høy forekomst av leukemi eller lymfom.
Hittil har ble flere linjer opprettet med ulike teknikker,12,,13,,14,,15,,16. En menneskelig NK cellen linje, NK-YS, ble etablert av NK celle lymfom/leukemi, av co dyrking med en musen stromal cell linje som mater, og i nærvær av rhIL-2 på en konsentrasjon av 20U per mL15. KAI3 var en annen NK cellen linje opprettet fra pasienter med en alvorlige mygg allergi eller SCAEBV med autologous lymphoblastoid celle linje (LCL), B-celler forvandlet ved EBV, som mater celler og tillegg av rhIL-2 på 100U/mL16. SNK6 og SNT8 var avledet fra tumor vev av nese NK/T celle lymfom pasienter ved å legge høydose rhIL-2 (700U/mL)12. Med lignende teknikk var SNK-1 cellen fra CAEBV pasienter, kultivert fra PBMC ved å fjerne T celler og legge til 700U/mL av rhIL-213,17. SNT13 og SNT15 ble etablert ved å fjerne CD4 + og CD8 + celler18. Så langt, ble andre T-celler og NK linjer fra EBV-NK/T LPD pasienter alle utviklet med denne metoden19.
Ulempene av eksisterende metoder nevnt ovenfor inkluderer ansettelse av materen celler, kravet til en høy dose av IL-2, utnyttelsen av så mye som 10 mL fullblod eller rensing av NK/T celler, som er svært utfordrende i klinikken grunn nødvendigheten av å kontrollere hvilke typer celle som EBV latently infiserer før du begynner å kultur. CAEBV forekommer hovedsakelig i barn i Asia, er 10 mL blod ikke lett å skaffe seg i alle regioner. I denne studien utviklet vi en ny enkel metode med høy suksessrate å etablere NK og/eller T celle linjer ved dyrking PBMC fra CAEBV pasienter med en lav dose av rhIL2 og en mengde 2 mL fullblod uten mater celler. Resultatene av denne metoden har vist sin høye effektivitet og tidsbesparende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av den etiske komiteen av Institutt for genetikk og utviklingsbiologi, kinesiske vitenskapsakademi, og protokollen følger institusjonelle retningslinjene for menneskelig velferd.
Merk: Se figur 1 for en skjematisk av arbeidsflyten.
1. isolering av PBMC fra CAEBV pasienter
- Rense primære PBMC fra 2 mL fullblod CAEBV pasienter ved gradering (f.eksFicoll-plakk) sentrifugering følge instruksjonene fra produsenten. Alternativt tine cryopreserved PBMC fra flytende nitrogen med RPMI 1640 medium.
- Legg 2 µL av trypan blå (0,4%) til 18 µL celle suspensjon, vente på 3 min flekken celler, overføre suspensjon av cellen counter platen og måle cellenes konsentrasjon og viability med en automatisert celle teller.
- Forberede celle suspensjon på en tetthet av 2-3 × 106 celler/mL supplert med komplett RPMI 1640 kultur medium med 20% humant serum (varme inaktivert ved 56 ° C), 2 mM L-glutamin, og antibiotika (100 µg/mL streptomycin, penicillin for 100 U/mL). Ætt 1 mL av PBMC suspensjon per brønn i 24-vel celle kultur platene.
- Legge til 150 U rhIL-2 per brønn.
- Plass kultur platene i en 5% CO2 inkubator på 37 ° C.
- På dag 2, observere cellen morfologi under et mikroskop (200 X forstørrelse); cellene er i god stand når de er lyse og runde.
2. utvidelse av celler og nummerering levedyktig cellene
- Observere cellen morfologi under et mikroskop (200 X forstørrelse) og overvåke tilstanden til cellevekst av nummerering cellene før du endrer medium: Legg 2 µL av trypan blå (0,4%) til 18 µL celle suspensjon, og beregne cellenes konsentrasjon (se 1.2, Figur 2).
- Forkaste 500 µL av mediet i en 24-vel plate, og Legg til 500 µL frisk fullstendig kultur medium. Legge til 150U rhIL-2 per brønn.
- Endre mediet to ganger i uken som i trinn 2.2.
- Tegne cellen vekstkurve (Figur 3).
- Når levedyktig cellene konsentrasjon overstiger 5 × 106/mL, dele celler i nye brønner i en konsentrasjon av 1-2 × 106 celler/mL i hver brønn. Prosessen tar 2-4 uker.
3. celle Phenotyping av flowcytometri
- Når celler har utvidet, samle 1 × 106 celler for å finne ut av fenotyper cellen linjer. Sentrifuge celler 240 x g i 5 minutter ved romtemperatur (NK/T celler vil utløse nederst på røret).
- Forkaste nedbryting, vask nedbør ved å legge til 7 mL PBS. Sentrifuger i 5 min 240 x g ved romtemperatur. Gjentas én gang.
- Legge til 200 µL humant serum hver rør, bland godt og ruge i 10 min ved romtemperatur.
- Sentrifuge celler 240 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Forkast nedbryting og å suspendere cellene på 1 × 106/mL med kaldt PBSA (PBS+0.2%BSA). Dele cellene i 5 rør, hver rør som inneholder 2 × 105 celler.
- Sentrifuger celler 240 x g i 5 min på 4 ° C. Forkaste nedbryting og å suspendere cellene med PBSA buffer eller PBSA som inneholder 10 µL PE (eller PE-Cy7) og 10 µL FITC merket antistoffer til stain celle reseptorer av T eller NK celler på is som er angitt av Figur 4. Celler suspendert med PBSA buffer brukes som en negativ kontroll.
- Inkuber cellene med antistoffer i 20-30 minutter på isen i mørket.
- Vask cellene to ganger med kaldt PBSA, å suspendere cellene med 300 µL kaldt PBSA.
- Analysere celle fenotypen med en flyt cytometer.
- Definere Flow Cytometer i "Opprette regneark" tilstand. Definere med eksperimentell malen med en prikk tomten som viser frem xy (FSC) versus siden xy (SSC).
- Isotype kontroll røret for å optimalisere FSC og SSC spenninger, og optimalisere FSC terskelverdien for å eliminere rusk uten å forstyrre celle befolkningen av interesse. Slett alle parametere unntatt FSC, SSC, FITC, PE og PE-Cy7.
- Utføre kompensasjon bruke isotype kontrollen og én positiv kontroll i hver 2-fargers analyse-gruppen.
- Last prøver og opprette HLA-DR VS CD19, CD4 VS CD8, CD56 VS CD16 og CD3 VS CD16 dot tomter viser forskjellige populasjon av celler.
Merk: PBMC ble brukt til å utføre kompensasjon kontrollen negative/isotype og én positiv kontrollen. 2-fargers immunofluorescence med flyt cytometer ble brukt rutinemessig analysere uttrykk for overflate markører. Følgende antistoffer er inkludert: anti-HLA-DR, anti-CD4, anti-CD16 konjugert med fluorescein isothiocyanate (FITC), anti-CD8, anti-CD56, CD3 konjugert med phycoerythrin (PE) og anti-CD19 konjugert med PE-Cy7.
4. ekspansjon og kryonisk bevaring av NK/T-celler
- Endre mediet når cellen fenotypen analysen er fullført. Forsiktig ta halvparten av nedbryting og unngå å berøre cellene nederst på platen. Legge til samme volum av fersk kultur medium med 300 U/mL rhIL-2 til celle platene.
- Endre halvparten av mediet hver 3 dager (som 2.2) til cellen klynger er tydelig under mikroskopet (figur 2). Vanligvis tar prosessen 2-3 uker.
- Overføre cellene fra 24-vel plater til T25 kultur flasker etter blande forskjellige brønner av den samme linjen. Doble volumet av kultur medium utvides som viser det gule til volumet av mediet til 10-15 mL. Legge til rhIL-2 med konsentrasjonen av 150 U/mL.
- Endre middels 24 timer før frysing etter 2-3 uker vokser, når cellen masse kan observeres med det blotte øye. Måle celle konsentrasjonen med en celle teller.
- Sentrifuge celle suspensjon i 5 min 240 x g, og å suspendere celle pellet på en tetthet av 5-10 x 106 celler/mL med frosne lager løsning som inneholder 90% fosterets bovin serum og 10% dimethylsulfoxide (DMSO). Fryse med en hastighet på 1 ° C per min-80 ° c, og deretter overføre direkte i flytende nitrogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter 3 dager kultur under etableringen av linjer, begynner polymorfe cellene skal vises (figur 2). Etter 7 dager vokse cellene raskt, som både antall og levedyktigheten til celler er økt til en høy rente (Figur 3). Klaser celler er tydelig etter 10-14 dager vokser, når cellen konsentrasjonen kan overstige 3-6 × 106. I denne perioden, skal cellene utvides ved arbeidsdeling i to eller tre brønner kultur plate. Om en måned senere, når de celle nummer delene 3-5 × 107, greven er høy nok for bevaring.
En annen viktig sak er å avgjøre av fenotyper når celler har blitt kultivert vellykket. Våre resultater viser at T (L196) og celler NK (M296) kan kultivert av metoden beskrevet ovenfor (Figur 4), og linjer kan opprettes med denne teknikken, som cellene vokste mer enn 3 måneder i god stand.
Figur 1: skjematisk fremstilling av arbeidsflyten. På den første dagen, var antikoagulerende blod samlet fra CAEBV pasienter, da PBMC ble isolert og kultivert med 1640 medium som inneholder 20% humant serum og 150U/mL av rhIL-2. De NK/T cellene ble dyrket på 37 ° C i nærvær av 5% CO2. Etter 2-4 uker dyrking, begynte cellene å vokse raskt. Når konsentrasjonen overskredet 5 × 106 /mL, delt vi celler i 2-3 brønner på konsentrasjon av 2 × 106. Fortsetter kulturen i 2-3 uker, ble celler overført fra 24-vel platen i T25 kolbe når cellen klynger var tydelig under mikroskopet. Cryopreserve celler når cellen masse kan observeres med det blotte øye. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Cellular morfologiske endringer under dyrking. Celler er kultivert og observert for angitt antall dager. Sammensatte celler (pilene peker) var synlig under mikroskopet klart etter 3-7 dager, og cellene begynte å vokse raskt etter 7-14 dager kultur. Den opprinnelige visningsstørrelsen for * lys var 200 X. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: vekst kurvene i celle spredning. Etter 7 dager med dyrking, celler begynte å vokse raskt (A) og med høy levedyktighet (B). Cellene konsentrasjon og levedyktighet ble målt ved en automatisert celle teller med følgende: legge til 2 µL av trypan blå (0,4%) i 18 µL av cellen suspensjon til farging, vente 3 min, overføre suspensjon av cellen counter platen og måle cellene konsentrasjon og celle levedyktigheten med en automatisert celle teller. Feilfeltene er på standardavvikene tre replikaer. L196, Z290, M296, L311 er navnet på fire linjer. Start konsentrasjonen måle vekstkurve er ca 3 × 106. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representant gating strategi for flyt cytometri analyse av cellelinjer L196 og M296. PBMC ble brukt for å justere FSC og SSC spenninger. Klyngen av live og enkelt lymfocytter var gated for P1 i FSC og SSC plottet. Isotype kontroll og enkel positive kontroller ble brukt til å utføre kompensasjon. Fire par med 2-fargers immunofluorescence konjugerte antistoffer farging ble brukt til å analysere uttrykk for overflate markører. Anti-HLA-DR og anti-CD19 ble brukt til å oppdage B celler, mens anti-CD3, anti-CD4 og anti-CD8 ble brukt til å oppdage T celler. Anti-CD16 og anti-CD56 ble brukt til å definere NK celler. (A) fenotypen av L196 er CD19-HLA-DR + CD16-CD56 + CD3 + CD4 + CD8 +, den viktigste celle typen er CD8 +. (B) M296 er CD19-HLA-DR + CD16 + CD56 + CD3-CD4-CD8 +, viktigste cellen er CD16 + CD56 +. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen, har en ny teknikk for å etablere NK/T cellelinjer fra fullblod CAEBV pasienter blitt utviklet. Sammenlignet med de eksisterende metodene, er Hovedfordelen med denne metoden dens enkelhet og sitt krav av bare en liten mengde blod, mens det høy suksessrate og gode forhold av cellen levedyktighet. Videre kan NK/T linjer etableres ved dyrking PBMC uten å bestemme celletyper EBV latently infiserte på forhånd, som bestemmelse ville forbruke mer blod og tid før dyrking. Alternativt cellelinjer kan analyseres og Norge celler kan bli renset med flowcytometri etter celle linje etablering. Dessuten metoden bruker en lav dose av rhIL-2, og trenger ingen mater celler. Med denne metoden, har vi utviklet 7 linjer fra 8 CAEBV pasienter og cryopreserved dem innen en måned. Som ikke har blitt utviklet til en celle linje kan opprettholdes i live i mer enn 5 måneder uten betydelig spredning, og årsakene bak dette trenger videre utforskning.
Det er nødvendig å merke seg at cellevekst er strengt avhengig tilstedeværelsen av rekombinant menneskelige IL-2, som samsvarer med tidligere rapporter20,21; med ingen menneskelig IL-2 dør cellene i 3 uker. Tydeligvis, høy kvalitet IL-2 er viktig for celle spredning, skjønt faktorene som bestemmer proliferativ kapasiteten på celler i vitro fremdeles nød å bli avklart. Dosen av IL-2 kreves er variabel blant annet linjer, for eksempel 50U/mL er tilfredsstillende å opprettholde spredning av M296. Men har den mest økonomiske og pålitelig konsentrasjonen for å etablere NK/T cellelinjer ikke blitt presentert i studien; faktisk er 150 U/mL tilstrekkelig for suksess.
I denne prosessen av cellen dyrking, elementene påvirker cellevekst, er levedyktigheten til primære PBMC det viktigste. For å sikre suksess, skal PBMC så frisk som mulig. Utvilsomt, celle konsentrasjon er en viktig faktor som påvirker vellykket dyrking, derfor terskelverdien skal ikke lavere enn 105 per mL. Hvis totalt-cellen tallet isolert fra prøven er mindre enn 10 er6, bruke en mini godt celle plate for å opprettholde en tilstrekkelig celle konsentrasjon et alternativ valg i første kultur. Videre kan NK og T-celle linje etableres med enda en begrenset mengde perifert blod ved Hemolytisk reaksjonen for å berike PBMC som vi rapporterte tidligere22. Som beskrevet i protokollen, er humant serum en annen viktig faktor for cellen overlevelsen i begynnelsen av kulturen. Vi spekulere at noen ukjente ingredienser finnes i serum som fraværende eller annerledes i fosterets bovin serum og er nødvendig for T/NK celle spredning.
Det er to begrensninger av metoden. Først, det er flere ubesvarte spørsmål om denne metoden, som hvordan og hvorfor EBV infiserer NK eller T celler i vivomekanismer for NK/T celle vekst og spredning vitroog hva typer celler kan være etablert i cellelinjer i en pasient. Men vi ikke kan kontrollere celle type og renhet, som ikke er bestemt av metoden, kan det hende at disse faktorene avhengige celler EBV infiserer hos pasienter. Med denne protokollen, kan NK og T celler etableres i linjer, men denne metoden ikke kan fortrinnsvis kultur én type. Likevel er det en dominerende gruppe av disse cellene. Det andre var det en rapport som NK og T-celle kloner fra pasienter med LPD eller kan etableres NK/T lymfom cellelinjer, mens andre kan opprettholdes for flere måneder17. Celler innhentet i denne studien kan spre over tre måneder, men om de kunne spre på ubestemt tid må valideres.
I sammendraget, bruker denne metoden, oppnås flere linjer fra CAEBV eller NK/T lymfomer enkelt med en begrenset mengde blod og en lav-dose av IL-2 uten mater celler. Disse linjer vil bidra til studiet av EBV utholdenhet i NK/T celler og patogenesen ved EBV tilhørende leukemi eller lymfom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.Z., X.Z. og X.C. er co-oppfinnere på patentsøknader dekker potensielle bruker av denne metoden for å etablere NK/T cellelinjer og cellelinjer i denne studien. D.Z., X.Z. og X.C. erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser i dette arbeidet. Gjenværende forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet ved nøkkel prosjekter av kinesiske Academy of Sciences (KFZD-SW-205), strategiske biologiske ressurser teknologi støtte systemet av kinesiske vitenskapsakademi (CZBZX-1 og ZSSB-004) og tilskudd fra National Science Foundation i Kina ( 81401640) og Shanghai naturvitenskap Fund (14ZR1434800).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
References
- Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
- Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
- Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
- Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
- Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency? Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
- Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
- Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
- Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
- Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
- Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
- Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
- Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
- Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
- Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
- Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
- Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
- Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
- Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
- Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326 (2011).
- Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
- Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
- Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
- Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).
