Summary
Un método simple para la obtención de clones de células T y NK de pacientes CAEBV fue desarrollado con eficacia alta, una pequeña cantidad de sangre periférica y una baja dosis de IL-2.
Abstract
Un número de métodos se ha descrito para establecer líneas de células NK/T de pacientes con linfoma o linfoproliferativo síndrome. Estos métodos emplean células de alimentador, células NK o T purificadas con tanto como 10 mL de sangre o una dosis alta de IL-2. Este estudio presenta un nuevo método con una estrategia potente y simple para establecer líneas de células T y NK por cultivo periférico de la sangre las células mononucleares (PBMC) con la adición de IL-2 humana recombinante (rhIL-2) y utiliza tan poco como 2 mL de sangre entera. Las células pueden proliferar rápidamente en dos semanas y se mantuvo por más de 3 meses. Con este método, se han establecido 7 líneas NK o células T con una alta tasa de éxito. Este método es simple, confiable y aplicable para el establecimiento de líneas celulares de más casos de linfoma CAEBV o NK/T.
Introduction
Virus de Epstein - Barr (EBV) es ubicuo y se infecta no sólo las células de B, pero también T y células naturales del asesinas (NK), que causa un número de enfermedades linfoproliferativas NK/T EBV-asociado (LPD) y linfoma, leucemia, como hemophagocytic EBV-asociado lymphohistiocytosis, Hidroa vacciniforme-como el linfoma, el linfoma de células NK/T extranodal, tipo nasal y NK agresiva de la célula leucemia1,2,3. Entre éstos es severa active EBV (SCAEBV) enfermedad crónica, que es incidente principalmente en Asia oriental, y que ahora se considera un LPD causada por la expansión clonal de EBV-infectadas T o NK células4,5,6, 7, pero sin la aparente inmunodeficiencia presentes en mononucleosis infecciosa (IM)-como síntomas incluyendo fiebre, hepatoesplenomegalia, linfadenopatía y disfunción del hígado persistente o recurrente, así como alta DNA del VEB de la carga en el sangre periférica de8,9. Los pacientes con CAEBV tienen un pronóstico pobre10,11y su patogénesis y desconoce el papel de la EBV. Por lo tanto, la célula líneas derivadas de las enfermedades lymphoproliferative EBV-asociado NK/T y los linfomas son muy útiles como modelos celulares para clarificar el mecanismo de la EBV indujo proliferación NK o células T y su relación con alta incidencia de leucemia o linfoma.
Hasta la fecha, se han establecido varias líneas celulares con diferentes técnicas12,13,14,15,16. Una línea humana de la célula NK, NK-YS, fue establecida de leucemia/linfoma de células NK, por co-cultivo con una línea de células estromales de ratón como alimentador y en presencia de rhIL-2 en una concentración de 20U por mL15. KAI3 fue otra línea de células NK establecido de pacientes con alergia severa de mosquito o SCAEBV con línea de células limfoblastoides autólogas (LCL), células B transformadas por EBV, como células de alimentador y adición de rhIL-2 100U/mL16. SNK6 y SNT8 se derivan de los tejidos tumorales de pacientes de linfoma de la célula NK/T nasales mediante la adición de altas dosis de rhIL-2 (700U/mL)12. Con técnica similar, la célula de SNK-1 era de pacientes CAEBV, cultivados de PBMC quitando las células de T y adición de 700U/mL de rhIL-213,17. SNT13 y SNT15 fueron establecidos mediante la eliminación de CD4 + y CD8 + células18. Hasta ahora, otras líneas celulares de células T y NK de pacientes LPD EBV-NK/T fueron todos desarrollados con este método19.
Las desventajas de los métodos existentes antes mencionados incluyen el empleo de células de alimentador, el requisito de una alta dosis de IL-2, la utilización de tanto como 10 mL de sangre entera o la purificación de las células NK/T, que es muy difícil en la clínica debido a la necesidad de verificar que tipos de celular latente EBV infecta antes de empezar a la cultura. Como CAEBV ocurre principalmente en niños en Asia, 10 mL de sangre no es fácil de adquirir en todas las regiones. En este estudio, hemos desarrollado un nuevo método simple con un alto índice de éxito para establecer líneas NK y célula de T por cultivo PBMC de pacientes CAEBV usando una dosis baja de rhIL2 y un volumen de 2 mL de sangre sin células de alimentador. Los resultados de este método han demostrado su alta eficiencia y ahorro de tiempo.
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Protocol
Este estudio fue aprobado por el Comité de ética del Instituto de genética y Biología del desarrollo, Academia China de Ciencias, y el protocolo sigue los lineamientos institucionales para el bienestar humano.
Nota: Vea la figura 1 para un diagrama esquemático del flujo de trabajo.
1. aislamiento de PBMC de CAEBV pacientes
- Purificar primaria PBMC de 2 mL de sangre total de pacientes CAEBV por gradiente (p. ej., placa de Ficoll) centrifugación siguiendo las instrucciones del fabricante. Por otra parte, deshielo cryopreserved PBMC de nitrógeno líquido con Medio RPMI 1640.
- Añadir 2 μl de azul tripán (0,4%) a 18 μL célula suspensión, espere 3 minutos para teñir las células, transferir la suspensión a la placa del contador de célula y medir la concentración y viabilidad con un contador de células automatizado de las células.
- Preparar la suspensión celular con una densidad de 2-3 x 106 células/mL con medio de cultivo RPMI 1640 completo que contiene 20% de suero humano (inactivado a 56 ° C por calor), 2 mM L-glutamina y antibióticos (estreptomicina 100 de μg/mL, 100 U/mL de penicilina). Sembrar 1 mL de la suspensión PBMC por pozo en placas de cultivo celular de 24 pozos.
- Añadir 150 U rhIL-2 por pocillo.
- Colocar las placas en una 5% CO2 incubadora a 37 ° C.
- En el día 2, observar la morfología de la célula bajo el microscopio (200 aumentos); las células están en buenas condiciones cuando son brillantes y redondos.
2. expansión de las células y las células viables de numeración
- Observar la morfología de la célula bajo el microscopio (200 aumentos) y vigilar la condición del crecimiento celular numerando las células antes de cambiar de medio: Añadir 2 μl de azul tripán (0,4%) a 18 μL célula suspensión y calcular la concentración de las células (ver 1.2, Figura 2).
- Deseche 500 μl del medio en una placa de 24 pocillos y agregar 500 μl completa cultura medio fresco. Añadir 150U rhIL-2 por pocillo.
- Cambiar el medio dos veces a la semana como en el paso 2.2.
- Dibujar la curva de crecimiento de la célula (figura 3).
- Cuando excede la concentración de células viables/ml6de 5 × 10, se dividen las células en nuevos pozos a una concentración de 1-2 × 106 células/mL en cada pozo. Este proceso toma de 2-4 semanas.
3. célula Phenotyping por citometría de flujo
- Cuando las células se han ampliado, recoger 1 × 106 células para determinar los fenotipos de líneas celulares. Centrifugar las células a 240 x g durante 5 min a temperatura ambiente (células de NK/T precipitará en el fondo del tubo).
- Eliminar el sobrenadante, lavar la precipitación añadiendo 7 mL de PBS. Centrifugar durante 5 min a 240 x g a temperatura ambiente. Repetir una vez.
- Añadir suero humano de 200 μL en cada tubo, mezclar bien e incubar 10 min a temperatura ambiente.
- Centrifugar las células a 240 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en el 1 × 106/mL con PBSA frío (PBS+0.2%BSA). Se dividen las células en 5 tubos, cada tubo contiene 2 × 105 células.
- Centrifugar las células a 240 x g durante 5 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender las células con buffer PBSA o PBSA que contienen 10 μl PE (PE-Cy7) y 10 μl FITC anticuerpos para receptores de las células de las células T o NK en el hielo la mancha como indica la figura 4. Las células suspendidas con tampón PBSA se utilizan como un control negativo.
- Incubar las células con anticuerpos para 20-30 min en hielo en la oscuridad.
- Lavan las células dos veces con frío PBSA, resuspender las células con 300 μL PBSA frío.
- Analizar el fenotipo de la célula con un citómetro de flujo.
- Configurar el citómetro de flujo en condiciones de "Crear hoja de trabajo". Configurar la plantilla experimental con una trama de puntos que muestra forward scatter (FSC) versus dispersión lateral (SSC).
- Cargar el tubo de control de isotipo para optimizar las tensiones de FSC y SSC y optimizar el valor de umbral FSC para eliminar residuos sin interferir con la población de la célula de interés. Borrar todos los parámetros excepto el FSC y SSC, FITC, PE, PE-Cy7.
- Realizar compensación usando el control de isotipo y un solo control positivo en cada grupo de análisis de color de 2.
- Cargar las muestras y crear HLA-DR VS CD19, CD4 VS CD8, CD56 VS CD16 y CD3 VS CD16 parcelas punto mostrando diferentes poblaciones de células.
Nota: PBMC fueron utilizados para realizar la indemnización mediante el control de isotipo de negativo y control positivo solo. inmunofluorescencia de 2 colores con citómetro de flujo se utilizó rutinariamente para analizar la expresión de marcadores de superficie. Se incluyen los siguientes anticuerpos: anti-HLA-DR, anti-CD4, anti-CD16 conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC), anti-CD8 anti-CD56, conjugados con ficoeritrina (PE) CD3 y anti-CD19 conjugado con PE-Cy7.
4. expansión y criopreservación de células NK/T
- Cambiar el medio una vez terminado el análisis del fenotipo de la célula. Retirar la mitad del sobrenadante cuidadosamente y evite tocar las células en la parte inferior de la placa. Añadir el mismo volumen de medio de cultivo fresco que contenga 300 U/mL rhIL-2 a las placas de la celda.
- Cambiar la mitad del medio cada 3 días (2.2) hasta la celda racimos son claramente visibles bajo el microscopio (figura 2). Por lo general, este proceso tarda 2-3 semanas.
- Transferencia de las células de las placas de 24 pocillos para frascos de cultivo T25 después de mezclar diferentes pozos del mismo linaje. Doble del volumen de medio de cultivo resulta amarillo hasta que el volumen del medio se amplía a 10-15 mL. Añadir rhIL-2 con la concentración de 150 U/mL.
- Cambio medio 24 h antes de congelar después de 2-3 semanas de crecimiento, cuando la célula masa puede observarse a simple vista. Medir la concentración de células con un contador de células.
- Centrifugar la suspensión celular por 5 min a 240 g de x y Resuspenda el sedimento celulares a una densidad de 5-10 x 106 células/mL con la solución congelada que contiene 90% de suero fetal bovino y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Congelación a una velocidad de 1 ° C por minuto hasta-80 ° C y luego se transfieren directamente en nitrógeno líquido.
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Representative Results
Después de 3 días de la cultura durante el establecimiento de líneas celulares, las células polimórficas comienzan a aparecer (figura 2). Después de 7 días, las células crecen rápidamente, mientras que el número y viabilidad de las células se aumentan a una velocidad alta (figura 3). Pequeños grupos de células son claramente visibles después de 10-14 días de crecimiento, cuando la concentración de células puede superar los 3-6 × 106. En este período, las células deben ampliarse por la división en dos o tres pocillos de la placa de cultivo. Un mes más tarde, una vez el celular número alcanza 3-5 × 107, la cuenta es lo suficientemente alto como para la preservación.
Otra cuestión importante es determinar los fenotipos cuando las células han sido cultivadas con éxito. Nuestros resultados indican que T (L196) y las células NK (M296) pueden ser cultivadas por el método descrito anteriormente (figura 4), y con esta técnica, se pudieran establecer líneas celulares como las células crecieron más de 3 meses en buen estado.
Figura 1: representación esquemática del flujo de trabajo. El primer día, sangre anticoagulante se recogió de CAEBV pacientes, entonces PBMC fueron aisladas y cultivadas con medio 1640 con 20% de suero humano y 150U/mL de rhIL-2. Las células NK/T se cultivaron a 37 ° C en presencia de 5% CO2. Después de 2-4 semanas de cultivo, las células comenzaron a crecer rápidamente. Cuando la concentración supera 5 × 106 /mL, dividimos las células en 2-3 pozos a una concentración de 2 × 106. Continuando con la cultura durante 2-3 semanas, las células fueron transferidas de la placa de 24 pocillos en T25 matraz cuando los racimos de célula eran claramente visibles bajo el microscopio. Criopreservar las células cuando la célula masa puede observarse a simple vista. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: cambios morfológicos celulares el proceso de cultivo. Las células son cultivadas y observadas por el indicado número de días. Células polimórficas (las flechas puntiagudas) eran visibles bajo el microscopio claramente después de 3-7 días, y las células comenzaron a crecer rápidamente después de la cultura 7-14 días. La magnificación original para microscopía de luz fue 200 X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: las curvas de crecimiento de la proliferación celular. Después de 7 días de cultivo, las células comenzaron a crecer rápidamente (A) y con alta viabilidad (B). Concentración y viabilidad de las células fueron medidas por un contador de células automatizado con el siguiente procedimiento: Añadir 2 μl de azul tripán (0,4%) a 18 μL de suspensión celular para la tinción, esperar 3 minutos, transferir la suspensión a la placa del contador de célula y medir las células la concentración y la viabilidad de las células con un contador de células automatizado. Las barras de error son las desviaciones estándar de las tres réplicas. L196, L311 Z290, M296, son los nombres de cuatro líneas celulares. La concentración inicial para medir la curva de crecimiento es de unos 3 × 106. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Representante gating estrategia para el análisis de citometría de flujo de líneas celulares L196 y M296. PBMC fueron utilizados para el ajuste de tensiones de FSC y SSC. El cúmulo de linfocitos vivo y solo fue cerrado para P1 en la trama de FSC y SSC. El control de isotipo y controles positivos solo se utilizaron para realizar la compensación. Cuatro pares de tinción de anticuerpos de inmunofluorescencia 2 colores conjugada fueron utilizados para analizar la expresión de marcadores de superficie. Anti-HLA-DR y anti-CD19 se utilizan para detectar las células de B, mientras que anti-CD3, anti-CD4 y anti CD8 fueron utilizados para detectar las células de T. Anti-CD16 y CD56 anti fueron utilizados para definir las células NK. (A) el fenotipo de L196 es CD19-HLA-DR + CD16-CD56 + CD3 + CD4 + CD8 +, el tipo de célula principal es CD8 +. (B) M296 es CD19-HLA-DR + CD16 + CD56 + CD3-CD4-CD8 +, el tipo de célula principal es CD16 + CD56 +. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este protocolo, se ha desarrollado una nueva técnica para el establecimiento de líneas de células NK/T de la sangre de los pacientes CAEBV. En comparación con los métodos existentes, la gran ventaja de este método es su simplicidad y su exigencia de sólo un pequeño volumen de sangre, mientras que exhibe un alto índice de éxito y buenas condiciones de la viabilidad celular. Además, las líneas de la célula NK/T pueden establecerse mediante cultivo PBMC sin determinar los tipos de células EBV latente infectado por adelantado, como la determinación consumiría más tiempo antes de cultivo y sangre. Alternativamente, las líneas celulares pueden ser analizadas y diferentes fenotipos de células pueden ser purificados con citometría de flujo después del establecimiento de línea de celular. Además, el método utiliza una dosis baja de rhIL-2 y necesita ningunas células de alimentador. Con este método, hemos desarrollado líneas de celulares 7 de 8 pacientes CAEBV y congelados dentro de un mes. Que no se ha convertido en una línea celular puede mantenerse vivo durante más de 5 meses sin proliferación significativa, y las razones detrás de esto necesitan mayor exploración.
Es necesario tener en cuenta que el crecimiento de la célula es estrictamente dependiente de la presencia de recombinante humano IL-2, que es consistente con anteriores informes de20,21; con sin IL-2 humana, las células morirán en 3 semanas. Evidentemente, una alta calidad de IL-2 es esencial para la proliferación celular, aunque los factores que determinan la capacidad proliferativa de las células en vitro aún necesitan ser aclarados. La dosis de IL-2 requerido es variable entre diferentes líneas celulares, por ejemplo, es satisfactorio para mantener la proliferación de M296 50U/mL. Sin embargo, la concentración más económica y confiable para el establecimiento de líneas de células NK/T no se ha presentado en el estudio; de hecho, 150 U/mL es suficiente para el éxito.
En este proceso de cultivo celular, de los elementos que afectan el crecimiento celular, la viabilidad de PBMC primario es el más importante. Para asegurar el éxito, la PBMC debe estar tan fresco como sea posible. Sin duda, concentración de células es un factor importante que afecta el cultivo exitoso, por lo tanto el valor de umbral debe ser no menos de 105 / mL. Si el número de celular total de la muestra es menos de 106, usando una placa de células mini-bien para mantener una concentración adecuada de la célula es una alternativa en la cultura inicial. Además, se pudo establecer línea NK y células T con una cantidad limitada de sangre periférica cuando se usa la reacción hemolítica para enriquecer PBMC como ya informamos anteriormente22. Como se describe en el protocolo, el suero humano es otro factor clave para la supervivencia de la célula al principio de la cultura. Especulamos que algunos ingredientes desconocidos existen en el suero que está ausente o es diferente en suero bovino fetal y son necesarios para la proliferación de células T/NK.
Hay dos limitaciones del método. En primer lugar, hay varias preguntas sin respuesta acerca de este método, tales como cómo y por qué EBV infecta el NK o T las células en vivo, los mecanismos de la NK/T célula crecimiento y proliferación en vitro, y qué tipos de células pueden ser establecido en líneas celulares de un paciente. Aunque no podemos controlar el tipo de la célula y la pureza, que no están determinados por el método, estos factores podrían ser dependientes de las células que EBV infecta en pacientes. Con este protocolo, las células NK y T podrían establecerse en líneas celulares, aunque este método podría no preferencial de la cultura un tipo. Sin embargo, existe un grupo dominante de estas células. En segundo lugar, hubo un informe que los clones NK y células T de pacientes con LPD o linfoma NK/T se podría establecer a líneas celulares, mientras que otros podrían mantenerse durante varios meses17. Las células obtenidas en el presente estudio pueden proliferar más de 3 meses, sin embargo si podrían proliferar indefinidamente necesita ser validado.
En Resumen, con este método, más líneas celulares de linfomas CAEBV o NK/T se pueden obtener fácilmente con una cantidad limitada de sangre y una baja dosis de IL-2 sin células de alimentador. Estas líneas celulares contribuirá al estudio de la persistencia de EBV en las células de NK/T y patogenia del VEB asociado leucemia o linfoma.
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Disclosures
D.Z., X.Z. y XC son inventores Co en solicitudes de patentes pendientes que cubren posibles usos de este método para el establecimiento de líneas de células NK/T y las líneas celulares establecidas en el presente estudio. D.Z., X.Z. y XC no declaran a intereses financieros que compiten en este trabajo. Los restantes autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los proyectos clave de la Academia China de Ciencias (KFZD-SW-205), estratégica biológica recursos tecnología sistema de apoyo de la Academia China de Ciencias (CZBZX-1 y ZSSB-004) y por donaciones de la Fundación Nacional de Ciencias de China ( 81401640) y fondo de Ciencias naturales (14ZR1434800) de Shanghai.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
References
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