Summary
Nos ilustran un método directo para derivar macrófagos murinos primarios de células de médula ósea y conjuga un método sencillo para preparar ácidos grasos BSA. Entonces demostramos que ácidos grasos saturados puede inducir la muerte celular de macrófago, y tal muerte celular está positivamente asociada con la acumulación celular de los niveles de ceramida.
Abstract
Los macrófagos expresan muy epidérmica proteína de unión a ácidos grasos y la proteína de unión a ácidos grasos adiposa. Se activa la absorción saturada y ácidos grasos insaturados, que podría desempeñar un papel crítico en la regulación de sus funciones inmunes. Numerosos estudios han demostrado que diversos ácidos grasos, saturados o insaturados, poseen diferentes efectos sobre el crecimiento celular y la función. Sin embargo, varían los enfoques utilizados para la preparación de ácido graso que puede conducir a resultados no fisiológicos. Albúmina sérica, un portador natural de ácidos grasos en sangre periférica de mamífero, se recomienda para la formación de un conjugado complejo con la sal de sodio de los ácidos grasos para estudiar la función del ácido graso en células de mamífero, minimizando la toxicidad del jabón de ácido graso. Así, una sencilla, relativamente rápida de la calefacción y sonicando método es desarrollada y presentada aquí para la formación del conjugado ácida grasos BSA. Se describe un protocolo de uso de ácidos grasos saturados, especialmente el esteárico ácidos para inducir muerte celular severa en macrófagos derivado de médula ósea de ratón. Demostramos más que la muerte celular inducida por ácidos grasos saturados está positivamente asociada con los niveles de ceramida celulares acumulados. Este método se puede extender para los estudios del impacto de los ácidos grasos en las células de otros mamíferos.
Introduction
Los ácidos grasos juegan un papel crítico en el metabolismo energético y en la síntesis de fosfolípidos de membrana en diferentes tipos de células. Los ácidos grasos tienen una solubilidad acuosa baja. Preparación apropiada de ácidos grasos es de vital importancia para el estudio de las funciones biológicas de los ácidos grasos en las células mamíferas. Cuando los ácidos grasos se preparan con etanol, muchos ácidos grasos pueden mostrar su efecto tóxico jabón (detergente) en la membrana celular, incluso en concentraciones relativamente bajas de1. Como un natural, importante transportador de ácidos grasos libres en el suero, la albúmina sérica se considera un buen portador para ácido graso entrega en vitro para ácidos grasos función ensayos2,3,4. Sin embargo, los detalles de la preparación de ácidos grasos y albúmina de suero conjugado generalmente no están disponibles aunque se han publicado numerosos trabajos de investigación utilizando ácidos grasos.
Los macrófagos expresan muy epidérmica proteína de unión a ácidos grasos y adiposo proteína de unión a ácidos grasos5,6,de7,8. Se activa la absorción saturada y ácidos grasos insaturados que puede regular sus funciones inmunitarias. Para estudiar el impacto de los ácidos grasos en los macrófagos y otras células, diferentes métodos de preparación de ácidos grasos fueron aplicados1,7,9. Utilizando apropiadamente preparado, suero, ácidos grasos conjugados de albúmina para investigar el impacto de los ácidos grasos sobre la función de macrófagos es de vital importancia en la obtención de datos biológicamente significativos. Estudios sobre el impacto de los ácidos grasos sobre la función del macrófago pueden proporcionar conocimientos básicos y potenciales dianas terapéuticas relacionadas con el metabolismo de ácidos grasos en enfermedades implicadas macrófagos.
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Protocol
el protocolo fue aprobado por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Louisville.
1. macrófagos de derivados de la médula ósea de ratón (BMDMs)
- Euthanize un ratón de tipo salvaje de 6 a 8 semanas de edad, sano con CO 2. Perno hasta un tablero de la espuma y spray con etanol al 70% hasta que se haya empapado. Quitar los huesos tibia/fémur con pinzas y tijeras. Ponerlos en una placa Petri con 5 mL 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS). Realizar todos los procedimientos bajo condiciones estériles.
- Corte ambos extremos del hueso fémur tibia con una tijera en una campana de cultivo estériles para tejidos. Al ras del hueso con una aguja de 25 G con PBS + 2% de suero bovino fetal (FBS) en un tubo de 15 mL.
- Centrifugar las células de médula ósea a 500 x g, 4 ° C por 5 min
- Resuspender el precipitado de células en tampón de lisis de glóbulos rojos de 1 mL a lyse células de sangre rojas (RBC) de menos de 1min diluir inmediatamente con 9 mL 1 x PBS. Centrifugar nuevamente como en el paso 1.3. Decantar el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado de células en 10 mL 1 x PBS, filtrar la suspensión de células a través de una malla de nylon estéril 40 μm en otro tubo de 15 mL para eliminar células residuos/grupos. Centrifugar nuevamente como en 1.3. Decantar el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado de células en el Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con el 5% medio FBS de 15 mL y 10 μg/mL gentamicina, placa que las células en una placa de cultivo de tejido de 100 mm a 37 o C incubadora para 60 minutos agitar suavemente el plato, sacan el flotante las células y contarlas.
- Placa de 6 x 10 6 células en un plato de 100 mm con macrófagos 12 mL diferenciar los medios de comunicación (RPMI 1640 con 5% FBS y gentamicina 10 μg/mL, mezclado con 30% elución de L929 acondicionado media 10) con macrófagos de ratón recombinante de 10 ng/mL factor estimulante de colonias (M-CSF) durante 2 días.
- Después de cultivo durante 2 días en una incubadora de 37 ° C con 5% CO 2, alimentación cada plato con macrófagos fresco 6 mL diferenciar los medios de comunicación con el M-CSF de 10 ng/mL.
- El día 5, 8 mL de los viejos medios a sin molestar a las células y añadir macrófago fresco 10 mL diferenciar los medios de comunicación con el M-CSF de 10 ng/mL.
- En el día 7, de la cosecha los macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) usando un levantador celular.
Nota: Adjunto los macrófagos también pueden ser disociados con 5 mL de 1 mM de EDTA en PBS 1 x durante 5 a 10 minutos después de quitar las células de flotación y lavado de la placa dos veces con 5 mL 1 x PBS. Centrifugar las células como en el paso 1.3. resuspender en macrófago fresco diferenciar los medios de comunicación y contar con un hemocitómetro.- Confirmar las BMDMs ' fenotipo mediante citometría de flujo como describe en 5. Preparar el ratón derivado macrófagos en cierta concentración para los estudios siguientes.
2. BSA-grasos ácido conjugado preparación
- Prepare 2 mM BSA en PBS estéril. Por ejemplo, pesar 6,65 g BSA, Añadir 30 mL 1 x PBS para disolver, luego agregar más PBS hasta 50 mL, escalamiento componentes para hacer 2 mM BSA en PBS 1 x.
- Prepare 5 mM individuales sodio sal de ácidos grasos en 2 mM BSA. Calentar a 37 ° C o superior, si es necesario y someter a ultrasonidos la mezcla de 2 mM BSA y sal de sodio de los ácidos grasos hasta obtener una solución clara.
Nota: En comparación con ácidos grasos insaturados, ácidos grasos saturados necesitan una temperatura más alta y más tiempo de sonicación para la disolución de. - Filtro de la solución de grasos ácido de BSA a través de un 0.22 μm filtro, alícuota en microcentrífuga estéril 1.5 mL los tubos y almacenarlos a 4 ° C para uso a corto plazo o a-20 ° C para almacenamiento a largo plazo. Ninguna precipitación debe observarse después de almacenamiento a 4 ° C en el refrigerador.
3. Saturado ácidos grasos inducen celular muerte de ratón médula ósea macrófagos derivados de
- placa BMDMs en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos con 0.4 x 10 6/ml en macrófago diferenciar los medios de comunicación.
- Tratar las células con los 0.4m m de ácido palmítico y ácido esteárico por 16 a 24 h a una incubadora de 37 ° C con 5% CO 2. Utilizar BSA como control negativo.
- Las células con un levantador de células después del tratamiento de la cosecha y desactivación de las células a 500 x g, 4 ° C por 5 min.
- Mancha las células con anexina V-Alexa 488 y aminoactinomycin 7 D (7-AAD) en 100 μL de anexina tampón de Unión V durante 15 min a temperatura ambiente.
- Diluir la muestra con 200 μL de tampón de Unión anexina, mezclar suavemente, y luego guardar las muestras en hielo después de la incubación.
- Analizar las células tan pronto como sea posible por citometría de flujo 5. Annexin V-Alexa 488 se detecta en canal FITC y 7-AAD es en canal PerCP/PerCP-Cy5.5.
4. Tinción intracelular de ceramida
- después del tratamiento de ácido graso, cosechar las células como en el paso 3.3. Luego fijar las células en paraformaldehído al 4% durante 30 minutos
- Lavar la muestra con 1 mL 1 x PBS, girar hacia abajo como en el 3.3 y decantar el sobrenadante.
- Teñir las células con el anticuerpo primario anti-ceramida (dilución 1: 200) en buffer de permeabilización de 1 x μL 100 durante 30 minutos
- Lavado y exprimido por las células otra vez como en el paso 4.2.
- Teñir las células con el anticuerpo secundario de anti-ratón IgM (dilución 1: 500) en buffer de permeabilización de 1 x μL 100 durante 30 minutos
- Lavado y centrifugado hacia las células otra vez como en el paso 4.2. Añadir 250 μL 1 x PBS y analizar las células mediante citometría de flujo 5.
Nota: Vea la lista detallada de reactivos en la tabla de equipos y reactivos.
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Representative Results
La obesidad aumenta las concentraciones de ácidos grasos libres en suero. Como fagocitos profesionales, macrófagos activamente toman ácidos grasos para mantener la homeostasis de host. Durante estos procesos, sobrecarga de lípidos pueden inducir muerte celular de macrófago. Para ello, cultiva BMDMs en vitro con obesos niveles de ácidos grasos dietéticos y muerte de las células macrófagos medido utilizando tinción de citometría de flujo. En comparación con el control de la BSA, ácidos grasos saturados, en particular ácidos esteárico, indujo muerte celular importante de BMDMs las células muertas se mostraban como doble poblaciones positivas teñidas por anexina V y 7-AAD (Figura 1a-b). De nota, ácidos grasos insaturados no indujo importantes macrófago célula muerte5. Los datos sugieren el efecto tóxico de los niveles elevados de ácidos grasos saturados libres en vivo.
De manera similar, usando una línea celular de macrófagos cuya viabilidad fue susceptible al tratamiento de los ácidos Palmítico o esteárico ácidos5, encontramos que la susceptibilidad de los macrófagos a la muerte celular inducida por el ácido palmítico fue también afectada por el número de células en la cultura (Figura 2a). En pocas palabras, en las mismas condiciones culturales, los más macrófagos en los pozos, al menos la muerte celular inducida por los ácidos grasos. Por otra parte, la muerte celular inducida por el ácido palmítico fue positivamente asociada a los niveles acumulados de ceramidas celular (figura 2b). Cuando los macrófagos fueron cultivados en condiciones de alta densidad, nutrientes medio se agotan más rápido para el metabolismo energético, estas células fueron menos susceptibles a la muerte celular inducida por el ácido palmítico comparada con macrófagos cultivados en condiciones de baja densidad. Por el contrario, cuando las células se exponen a una condición de enriquecimiento de nutrientes (p. ej., obesidad), exceso de ácidos grasos puede ser metabolizado para producir tóxicos ceramidas, lo lleva a la muerte celular inducida por ácidos grasos. Así, las condiciones culturales de la célula pueden traer variación de los resultados de la muerte celular inducida por ácidos grasos saturados.
Figura 1: alta concentración de ácidos grasos, especialmente los ácidos esteárico, inducen muerte celular de macrófago. BMDMs (día 7) fueron plateadas como 0.4 x 106/ml en macrófago fresco diferenciar los medios de comunicación. Después de accesorio de la célula de 0.5-1 h, BMDMs fueron tratados con la concentración designada de cada ácido graso para 24 h. medios solos y BSA fueron utilizados como controles negativos. Después del tratamiento, las células se levantó cosecha y girar hacia abajo a 500 g durante 5 min a 4 ° C. Las células se tiñeron con 7-AAD y anexina V Alexa 488 en buffer de annexin-enlace de 100 μL durante 15 min. Añadimos otro buffer de annexin-obligatorio 200 μL de cada muestra antes del análisis de citometría de flujo. (A) demostración de datos de citometría de flujo de células inducidas por ácidos grasos. (B) Resumen de la muerte celular inducida por los ácidos grasos. Barra de error representa muestra SD La muerte celular inducida por el ácido palmítico (PA) y particularmente el ácido esteárico (SA) es estadísticamente significativo en comparación con el control de BSA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: la disponibilidad de la susceptibilidad de los macrófagos del impacto de los medios nutrientes a ácido palmítico indujo la muerte celular. (A) estado de nutrición de la célula afecta su tolerancia a estrés inducido por el ácido graso saturado. (B) la susceptibilidad de la célula a la muerte celular inducida de saturado ácidos grasos está muy relacionada con niveles celulares acumulados de ceramida. El gradiente de nutrientes de los medios de comunicación fue alcanzado por el cultivo de la línea de celular de macrófagos de tipo salvaje a 1M, 2M, 4M y 8M (M = 1 x 106) en cajas Petri de 6 mm con 6 mL de RPMI 1640 con 5% FBS y 10 μg/mL gentamicina durante 18 h. El color de los medios de comunicación es más amarillo debido al agotamiento de nutrientes más cuando un mayor número de células se cultiva en los platos. Más del 90% de las células siguen siendo altamente viable. El adjuntadas células viables fueron levantadas mediante pipeteo después de estar sentado en PBS durante 5 minutos y volver a cultivadas inmediatamente en 0.2x106/ml en medios frescos en placas de 24 pocillos. Las células fueron tratadas inmediatamente con ácido palmítico de 0,4 mM por 18 h utilizando BSA como control para cada fuente (gradiente de nutrientes) de las células. Entonces todas las células tratadas fueron cosechadas y con 7-AAD para muerte celular lacadas o con ceramidas intracelular. Muerte celular espontánea (7-AAD +) porcentajes fueron menos de 8.6%. Muerte de células específicas de tratamiento se calculó como la diferencia de % de 7-AAD + entre el tratamiento y su BSA de control (a). El nivel de tratamiento específico de la ceramida se estimó como la diferencia de intensidad (MFI) de fluorescencia media entre el tratamiento y su propio control de BSA (b). Este experimento fue repetido, y se presentan datos representativos. Barra de error representa muestra SD. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La preparación adecuada de solución de ácido graso es de vital importancia para el estudio de la función biológica de los ácidos grasos. La neutralización de los ácidos grasos aumenta su solubilidad en la solución acuosa. Sin embargo, sales de sodio de ácidos grasos, especialmente los ácidos grasos saturados, son todavía de baja solubilidad en agua o PBS como observado. Un método es utilizar el etanol del 95-100% para ayudar a disolver ácidos grasos1. Usando este método, mayor toxicidad para las células puede observarse incluso en concentraciones más bajas de ácidos grasos no saturados menos tóxicos. Otra forma de preparar la solución de ácido graso es utilizar metil-β-ciclodextrina como un sistema para que los ácidos grasos tienen óptimas condiciones, permanecen en solución en su forma monomérica9,11. Ácidos grasos preparados con este método parecen tener una función normal, pero llevando a cabo el método es complicado. El impacto de la metil-β-ciclodextrina en crecimiento de la célula es que alta concentración podría conducir a la célula la muerte12. Para ácidos saturados palmíticos y esteárico, una temperatura alta (60 oC) se utiliza para ayudar con la solubilización9.
Puesto que la albúmina sérica es una proteína de unión a ácidos grasos importante en líquido extracelular, que ayuda en el transporte de ácidos grasos en los sistemas linfáticos y vasculares, se ve favorecida como el portador natural para el estudio funcional de los ácidos grasos. Para evitar la baja solubilidad del ácido graso sal en solución acuosa, sonicación facilita enormemente la conjugación de ácidos grasos con BSA, así ayudando en la solubilización de los ácidos grasos. Tarda mucho más tiempo (horas) para solubilizar los ácidos grasos saturados que los ácidos grasos insaturados (30 min) con la misma cantidad de volumen y concentración. Aunque calefacción y sonicación son esenciales para la conjugación del ácido graso de la BSA, una alta temperatura (menos de 50 oC) se sugiere para obtener clara BSA-PA, soluciones conjugadas BSA-SA y una temperatura baja se recomienda para la solubilización del ácidos grasos insaturados debido a su susceptibilidad a la oxidación a alta temperatura. La fracción molar de 5:2 de ácido graso a BSA se considera buena en comparación con el 3:1 o 6:1 proporción molar que fue publicado7. Esto puede asegurar menos ácidos grasos totalmente libre en la solución para evitar la toxicidad de jabón de ácido graso. Ácidos grasos BSA preparados de esta manera parecen ser soluciones estables (sin precipitaciones, al menos) a 4 ° C durante al menos 3 meses como se muestra en su funcionalidad en la muerte de las células macrófagos. Sello de la tapa del tubo si los ácidos grasos no es debe ser utilizado durante un largo periodo de tiempo.
Cuando se obtiene una solución de ácido graso de BSA en PBS, resultados del tratamiento con ácidos grasos más probablemente están garantizados. Sin embargo, hambrientos y bien alimentados los macrófagos responden absolutamente diferentemente al tratamiento de ácido graso, especialmente ácidos grasos saturados. Macrófagos con exceso de nutrientes son más susceptibles a la muerte celular inducida por ácidos grasos saturados que de hambre o hambre unos porque hambre células metabólicamente pueden desintoxicar los ácidos grasos saturados debido a su petición de supervivencia y crecimiento. Tal muerte celular es altamente asociado con los niveles de ceramida celular acumulados. De nota, toxicidad de la ceramida ocurre sólo cuando los niveles intracelulares ceramida alcancen un determinado umbral. Para asegurar resultados consistentes de macrófagos grasos ácido tratado o cualquier otro tipo de células, las células se deben cultivar con medios frescos con abundantes nutrientes. Las condiciones de cultivo celular óptimo pueden resultar en datos óptimos.
En general, estos protocolos proporcionan información necesaria para estudiar el impacto de los ácidos grasos en los macrófagos por otros laboratorios. En comparación con otros métodos, este acercamiento directo genera conjugados ácidos grasos BSA sin utilizar un extra solvente como etanol. El paso más difícil es preparar precisa, estable solución ácido grasos BSA porque sonicación genera calor y es difícil controlar la temperatura. Afortunadamente, los ácidos grasos insaturados son fáciles de preparar en poco tiempo y permanecen estables, mientras que ácidos grasos saturados aparecen a temperaturas relativamente altas porque están saturados y resistente a la oxidación en tal condición. Hasta ahora, no hemos observado que ningún problema o limitación con conjugados de ácido grasos BSA preparado de esta manera. Modificación de nuestro protocolo sería necesario si se necesitan experimentos más sensibles.
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Disclosures
Los autores declaran no hay conflictos de intereses financieros.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado parcialmente por los fondos de puesta en marcha de la Universidad de Louisville y el Instituto Nacional del cáncer (Bethesda, MD) concede a R01CA177679, R01CA180986.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPX Ultrasonic Bath | Bransonic | Model 2800 | |
| Sodium palmitate (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Sodium stearate (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF) | Cell Signaling Technology, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate | Sigma | AP128F | |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | |
| Permeabilization buffer | Ebioscience | 4307693 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Cell Lifter | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Note: M.W. is for molecular weight. |
References
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