Summary
Quantitative Analyse des Zelleninhalts innerhalb der murinen Ischiasnerv wird erschwert durch die Knappheit des Gewebes. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die Gewebe-Verdauung und Vorbereitung, die genügende Zellen für Flow-Zytometrie Analyse Immunzelle Populationen von Nerven der einzelnen Mäusen versorgt.
Abstract
Nerv-Resident Immunzellen in das periphere Nervensystem (PNS) sind wesentlich für neuronale Integrität in einen gesunden Nerv. Die Immunzellen des PNS betroffen sind Verletzungen und Erkrankungen, beeinträchtigen die Funktion der Nerven und die Fähigkeit zur Regeneration. Neuronale Zellen werden häufig durch Immunfluoreszenz (IF) analysiert. Während wenn ist wichtig für die Bestimmung des Orts der Immunzellen in den Nerv, wenn nur semi-quantitativen und die Methode beschränkt sich auf die Anzahl der Markierungen, die gleichzeitig analysiert werden können und der Grad der Oberflächenexpression. In dieser Studie wurde die Durchflusszytometrie für Quantitative Analyse der Leukozyten-Infiltration in Ischias Nerven oder Dorsal Root Ganglien (DRGs) von einzelnen Mäusen verwendet. Einzelne Zelle Analyse erfolgte mittels DAPI und mehrere Proteine gleichzeitig für die Oberfläche oder intrazelluläre Expression analysiert wurden. Beide Ischias Nerven von einer Maus, die nach diesem Protokoll behandelt wurden generiert ≥ 30.000 kernhaltigen Einzelveranstaltungen. Der Anteil der Leukozyten in den Ischias Nerven, bestimmt durch Expression von CD45, betrug etwa 5 % der gesamten Zellinhalt in den Ischiasnerv und etwa 5-10 % in der DRG. Obwohl dieses Protokoll konzentriert sich in erster Linie auf die Immunzelle Bevölkerung innerhalb der PNS, bedeutet die Flexibilität der Durchflusszytometrie, eine Reihe von Markierungen gleichzeitig messen, dass die anderen Zellen Populationen innerhalb der Nerven, wie Schwann-Zellen, Perizyten vorhanden , Fibroblasten und Endothelzellen, auch analysiert werden können mit dieser Methode. Diese Methode bietet daher ein neues Mittel für das Studium systemischer Wirkungen auf die PNS wie Neurotoxicology und genetische Modelle der Neuropathie oder bei chronischen Krankheiten wie Diabetes.
Introduction
Immunzellen, die aus dem Kreislauf der PNS eingeben helfen definiert durch den Ausdruck von CD45 und CD11b, um die Integrität des Nerven und eine Rolle sowohl in der Regeneration und Degeneration1. Makrophagen (definiert durch ihren Ausdruck des CD68 Maus) können zu einer entzündlichen Phänotyp, mit dem Ausdruck mehr MHC verzerrt werden der Klasse II und CD86 auf ihrer Oberfläche (M1), oder gegen eine entzündungshemmende Phänotyp auszudrücken mehr intrazelluläre CD206 (M2)2 . Schiefstellung des Phänotyps Makrophagen ist ein dynamischer Prozess durch Akt3-Signalisierung, reflektieren die verschiedenen Aufgaben der Makrophagen in der Abwehr von Krankheitserregern (M1) und die Rolle bei der Geweberegeneration (M2) geregelt. Regeneration von einem verletzten Nerven erfordert zunächst Phagozytose von Myelin Schutt durch Makrophagen in den Nerv4,5, und entzündungshemmend (CD68+CD206+) M2-Makrophagen haben gezeigt, dass Axon Auswuchs in fördern die PNS-6. Reduzierte Rekrutierung oder Makrophagen an den PNS oder eingeschränkter Fähigkeit zur Phagozytose beeinträchtigt Regeneration und Pflege der Nerv Integrität führen kann. Entzündliche M1 Makrophagen, mit dem Ausdruck MHC Klasse II, sind weniger fähig als M2-Makrophagen Phagozytose und neuronaler Entzündung in der Pathogenese der verschiedenen neurodegenerativen Krankheiten7verwickelt ist.
Die Änderungen, die an den Nerv resident Immunsystem als Folge von Schäden auftreten können quantitative, Verlust von CD45 manifestiert werden+ Leukozyten (oder Infiltration von CD45 erhöht+ Leukozyten im Fall Entzündungen), oder qualitative, wie z.B. Ändern von Makrophagen Phänotyp von M2, M1 Phänotyp. Die Immunzellen des PNS wurden traditionell durch IF, mit Gefrierschnitte oder Paraffin-eingebetteten materiellen8analysiert. IF ist für die Bestimmung der Lokalisierung der Zellen des Interesses erforderlich. Allerdings stützt sich Quantifizierung zu verwenden, wenn häufig auf zählen eine relativ kleine Anzahl von Zellen in einem schmalen Bereich des Gewebes, Quantifizierung unzuverlässig und Vorwählervorspannung anfällig machen. Für die Identifizierung von bestimmten Teilmengen von Immunzellen ist die simultane Detektion von extrazellulären und intrazellulären Markierungen erforderlich, während Bestimmung des Phänotyps Makrophagen mindestens mindestens zwei Markierungen, insbesondere CD206 und MHC erfordert Klasse II. Am häufigsten verfügbaren Mikroskope sind begrenzt auf mindestens zwei-Farben-Kanäle, wie Fluorescein erfolgt (FITC) und Phycoerythrin (PE), läßt die Charakterisierung der spezifischen Teilmengen von Immunzellen durch IF restriktiv und unvollständig, erfordern sich die Notwendigkeit, mehrere Folien, abgeleitet aus der gleichen Gegend von Interesse, die befleckt und parallel analysiert. Dieser zeitaufwändige Aspekt ist daher nicht notwendig, eignet sich zur Analyse der großen Sample-Sets. Da die meisten der Marker des Interesses extrazelluläre kann der Nachweis im Gewebe, die entweder in Paraffin oder kryokonservierten eingebettet worden, problematisch wegen der Störung der Membran Integrität und die Maskierung von Epitopen sowie den Verlust von werden die Antigene des Interesses durch die Verwendung von Lösungsmitteln wie Aceton und Methanol9.
Im Gegensatz dazu flow Cytometry, welche optische Maßnahmen und Fluoreszenz Eigenschaften einzelner Zellen in Suspension als Durchgang durch einen Lichtstrahl, bietet praktische und umfassende Analyse der Zell-Populationen. Durchflusszytometrie, anstatt zu produzieren ein digitales Bild des Gewebes, bietet eine automatisierte Quantifizierung der eingestellten Parameter, die relative Größe und reflektierende Index, genannt der forward Scatter (FSC), Granularität/interne Komplexität der Zelle enthalten oder Seite-Streuung (SSC) und relativen Fluoreszenzintensität, vorausgesetzt, dass die Zelle mit einer entsprechenden Fluorophor wie ein konjugierten Antikörper gekennzeichnet hat. Eine typische Durchflusszytometer besteht aus zwei, luftgekühlte Laser; ein Argonlaser erzeugt Blaulicht bei 488 nm und einem Helium-Neon-Laser erzeugt Licht bei 633 nm. Diese Kombination ermöglicht die Erkennung und Messung, gleichzeitig mindestens fünf Ziele auf der Oberfläche oder in den intrazellulären Raum. Erweiterte fließen Cytometers besteht aus mehreren Lasern, die für die Erkennung von bis zu acht verschiedene Fluorochromes auf einmal erlauben, dass Emissionen Spitzenwellenlängen von ausgewählten Fluorochromes nicht erheblich überschneiden.
Für die Analyse von Durchflusszytometrie, muss das Gewebe von Interesse zuerst enzymatisch, in der Regel mit Kollagenase, eine einzellige Suspension erzeugen verdaut werden. Die Analyse der murinen Ischias Nerven war bisher schwierig aufgrund der geringen Menge des Gewebes aus jeder Maus gewonnen. Darüber hinaus der hohe Fettgehalt von Myelin um die Axone behindert Zelle Erholung und produziert große Mengen von Schutt. Für die Vorbereitung der Ischiasnerv und Verdauung hierin beschriebene Methode wurde von Schwann-Zellen isoliert Protokoll der Spange Et al. 7, und zielt darauf ab, genügend Zellen von Nerven der einzelnen Mäuse für Flow-Zytometrie-Analyse, zu isolieren, um Unterschiede zwischen den Mäusen zu reduzieren. Mit DAPI für die Identifizierung von einzelnen Zellen in der rohen Gewebe Digest umgeht die Notwendigkeit, Axon Schmutz, die häufig zum Verlust der Zelle führt. Waschen, mehrmals mit einer Waschmittel-reiche Puffer Aids in der Freisetzung von Zellen gefangen in fetthaltigen Schmutz, dadurch Erhöhung der Ausbeute. Verdauung der beiden Full-length Ischias Nerven von einem einzigen Mausklick nach diesem Protokoll generiert ≥30, 000 kernhaltigen Einzelveranstaltungen und mindestens 3 mal so viele von der DRG abgerufen wurde. Der Anteil der CD45+ Leukozyten lag bei ca. 5 % der gesamten Zellinhalt in der Ischiasnerv Digest und etwa von 5-10 % in der DRG-Digest. Der Großteil der CD45+ Zellen in den Ischiasnerv drückte die Makrophagen Marker, CD68 und CD206.
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Protocol
Wildtyp C57BL/6 Mäusen (Männchen; 10-12 Wochen) wurden in standard 12 h hell/dunkel-Zyklus gehalten und wurden standard Chow Ernährung und Wasser kostenfrei zur Verfügung gestellt. Alle Tierversuche wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den einschlägigen Leitlinien der lokalen Animal Care und Einsatz hat und durch die lokalen Animal Care and Use Committee bei der regionalen Behörde in Karlsruhe, Deutschland (G216/10) genehmigt.
(1) Perfusion der Maus
- Opfer der Maus (C57BL/6; Männchen; 10-12weeks) mit CO2 oder gemäß den örtlichen Vorschriften.
Hinweis: Retro-Orbital Blutungen kann durchgeführt werden um Kontrolle Leukozyten, mit 1,5 mL EDTA-beschichtete Rohre zu erhalten. Diese Methode der Blutung ist sofort nach dem Opfer nur effizient. Weitere, peritoneal Hohlraum Lavage (PCL) kann durchgeführt werden, um zu erhalten Kontrolle Makrophagen, mit vorgewärmten PBS bei 37 ° C zu kalt Agglutination des Blutes, vermeiden die Durchblutung behindern kann. - Desinfizieren Sie die Maus durch Besprühen das Fell auf dem Bauch großzügig mit 70 % V/V Ethanol und immer wieder abwischen mit einem Tuch mit Baumwolle Gaze. Mit einer stumpfen Schere, schneiden Sie die Bauchhaut durch eine longitudinale Inzision.
- Setzen Sie den pleuralen Raum von ersten macht einen Schnitt in das Zwerchfell mit gebogenen, stumpfe Scheren und dann Ausweitung des Schnittes über die gesamte Länge des Brustkorbes. Machen Sie einen ähnlichen Schnitt auf der kontralateralen Seite, bis das Brustbein entfernt vorsichtig gehoben werden kann.
- Mit einem klaren Blick des Herzens und der großen Gefäße einfügen ein Schmetterlings 23¾ gauge Nadel, verbunden mit einer 50 mL-Spritze mit eiskaltem PBS in die linke Kammer des Herzens gefüllt.
- Einen Einschnitt in den rechten Vorhof des Herzens mit Iris-Schere so groß von einer Steckdose wie möglich zu erstellen, ohne Beschädigung der absteigenden Aorta, und dann drücken Sie vorsichtig die Spritze ca. durchsetzen 30 mL PBS. Das Exsudat sollte klar ausgeführt werden. Die Rodung von Leber und/oder Nieren kann als Indikator für eine gute Durchblutung verwendet werden.
2. Präparation des n. ischiadicus und DRG
Hinweis: Für die Zerlegung des Ischias-Nerven positioniert die Haut über den Gluteus Maximus entfernt wird und die Maus ist Bauchseite nach unten während aus den unteren Extremitäten ausdehnen.
- Bilateral sezieren Sie die ganze Ischias Nerven durch die Trennung des Muskelgewebes vom dorsalen Oberschenkel, und verfolgen Sie den Nerv entlang der Wirbelsäule. Schneiden Sie die Nerven, wo es aus der Wirbelsäule und unmittelbar oberhalb des Knies am anderen Ende austritt.
Hinweis: Vermeiden Sie übermäßige Handhabung des Nervs z. B. zerkleinern oder mit der Pinzette ziehen. - Mit Pinzette, übertragen Sie die ausgeschnittenen Nerve(s), ca. 2 cm pro Nerv zu einer 1,5 mL Röhrchen mit 1 mL eiskaltem PBS und Shop auf Eis.
Hinweis: Die Nerven kann über Nacht auf Eis gespeichert werden.
Hinweis: Für die DRG-Dissektion mit Pinzette und Skalpell, lösen Sie die Haut von der darunter liegenden Weichteile durch sanft abziehen die verbliebene hintere Haut um den zervikalen, thorakalen und lumbalen Wirbelsäulen Regionen verfügbar zu machen. Entfernen Sie den Kopf durch Schneiden an der Basis des Schädels mit einer stumpfen Schere. - Schneiden Sie die Rippen parallel mit und in der Nähe der Wirbelsäule auf beiden Seiten, bevor trennen die Eingeweide an der vorderen Seite der Wirbelsäule verbunden. Schneiden der Oberschenkelknochen und die Wirbelsäule durch eine quer geschnitten auf der Ebene der Oberschenkelknochen entfernen. Mit Iris-Schere, schneiden Sie alle Muskel-, Fett- und andere Weichteile von der Wirbelsäule.
- Legen Sie die Wirbelsäule mit der dorsalen Seite nach oben und öffnen Sie sie, beginnend am kaudalen Ende, indem Sie schieben ein Tipp der Schere in den Wirbelkanal auf 03:00-Position und den Knochen Schnitt. Wiederholen Sie den Vorgang an die 09:00-Position.
Hinweis: Es ist wichtig, genau in der Mitte um eine Beschädigung der DRG zu schneiden. - Wiederholen Sie das Schneiden von einer Seite zur anderen, bis das rostral Ende erreicht wird und das Rückenmark vollständig ausgesetzt. Eine Dissektion Mikroskop, entfernen Sie das Rückenmark, die Spinalnerven aussetzen, die verwendet werden können, um die DRGs innerhalb der Wirbelsäule zu suchen.
- Entfernen Sie die Lendenwirbelsäule DRGs durch sanft zerrte an der Rückenflosse Wurzel ziehen die DRG in der vertebralen Kanäle, dann übersteuert die Nerven und Bindegewebe mit Iris-Schere, der DRGs zu entfernen.
Hinweis: Es ist möglich, die Auflistung der L4-L6-DRG zu beschränken, die tragen an den Ischiasnerv. - Mit Pinzette, der DRGs auf einem 1,5 mL Röhrchen mit etwa 1 mL eiskaltem PBS übertragen und speichern auf Eis.
Hinweis: Die Nerven kann über Nacht auf Eis gespeichert werden.
(3) Verdauung der Ischiasnerv und DRG
- Bereiten Sie die Verdauung Medien (DMEM, 10 mM HEPES, 5 mg/mL BSA, 1,6 mg/mL Kollagenase Typ 4) ergänzt mit 100 µg/mL Deoxyribonuclease und Shop auf Eis.
Hinweis: Die Höhe der Verdauung Medium erforderlich per Mausklick (Ischias Nerven + DRGs) beträgt 1 mL. Nachdem vorbereitet, speicherbar Aliquote der Verdauung Medien bei-20 ° C. - Übertragen der Ischias Nerven und DRGs aus einem einzigen Mausklick in separate 1,5 mL Röhrchen mit 500 µL der Verdauung Medien. Für den Ischias Nerven das Material in 15-20 Stücke schneiden mit einer Schere Frühling und inkubieren Sie die Gewebe-Suspensionen in einem schütteln Inkubator bei 37 ° C für 20 min mit sanften Agitation (≤ 450 u/min).
- Immer wieder genannte die Zellsuspension durch 1.000 µL Pipettenspitze unvollständig verdaute Gewebe mechanisch zu trennen.
Hinweis: Wenn die Federung schwer zu titrieren, dann schneiden Sie die Pipettenspitze mit einer Schere, eine stumpfe Ende zu schaffen. Inkubieren Sie die Gewebe-Aussetzung bei 37 ° C für 20 min mit sanften Agitation (≤ 450 u/min). - Wiederholen Sie die Verreibung durch eine 1.000 µL Pipettenspitze und inkubieren Sie für weitere 10 min bei 37 ° C mit sanften Agitation (≤ 450 u/min).
- Vorbereiten den FACS-Puffer (PBS mit 10 % FCS und 1 mM EDTA ergänzt) und speichern Sie auf dem Eis. Spülen Sie und genießen Sie einen Edelstahl-Bildschirm mit einer Maschenweite von 140 µm mit FACS Puffer 60 x 15 mm Petrischale auf Eis.
Hinweis: Nylon Screen Filter sollte vermieden werden, denn sie zu einem erheblichen Verlust der Ausbeute von kernhaltigen Zellen führt. - Immer wieder durchlaufen Sie die Gewebe-Suspensionen 140 µm Gaze-Filter, wie es in der Petrischale mit stumpfen Pinzette auf Eis gehalten wird. Kassiere die Zellsuspension in der Petrischale und überträgt es auf eine neue 1,5 mL Tube auf Eis gelagert.
- Drücken Sie alle unvollständig verdaute Gewebe, das auf dem Filter durch wiederholte Verreibung mit einer Pipettenspitze 1.000 µL bleibt. Spülen Sie den Siebfilter zweimal mit 500 µL Puffer FACS und sammeln Sie die daraus resultierenden Zellsuspension in der Petrischale mit der Zellsuspension aus Schritt 3.6 zu kombinieren.
Hinweis: Wenn das Durchflusszytometer verwendet für Schmutz empfindlich ist, kann die Zellsuspension aus Schritt 3.7 durch eine 70 µm Gaze-Filter übergeben werden; Allerdings kann dies zu einem Verlust der Ausbeute von kernhaltigen Zellen führen. - Zentrifugieren der Zellsuspensionen 300 X g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL der FACS-Puffer. Wiederholen Sie waschen einmal.
- Aufschwemmen der Zelle Pellet in 150-350 µL FACS Puffer, je nach Anzahl der Färbung, die erforderlichen (150 µL FACS Puffer pro Färbung Panel).
(4) Färbung des Ischias-Nervs und DRG mit Gewebekulturen beschriftete Antikörper für die Durchflusszytometrie
- Übertragen Sie 100 µL der Ischiasnerv oder DRG Zellsuspension auf Eis in eine V-Form gut in eine 96-Well-Platte.
Hinweis: Single-gefärbten Zellen sind notwendig für alle Antikörper verwendet, da sie die notwendigen Kontrollen vorsehen, Einrichten der Durchflusszytometrie in Bezug auf Photomultiplier Röhre (PMT) Spannung Gewinne und Entschädigung sowie von spezifischen unterscheiden zu helfen unspezifische Bindung. Aufgrund des begrenzten Materials der Ischiasnerv und DRGs, Blut Leukozyten und Makrophagen aus der PCL (Schritte 1.1-1.2) können verwendet werden, wie die Single-gefärbten Steuerelemente, die Färbung für die parallel mit der Färbung von den Ischias durchgeführt werden sollte Nerven- und DRGs. - Pool der restlichen Zellen Suspensionen (etwa 50 µL pro Probe) aus den Ischias Nerven oder DRG Proben, als einem ungefärbten Kontrolle dienen.
- Zentrifugieren Sie die Platte 400 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den Überstand durch Umdrehen der Plattenrandes über einem Mülleimer und eine scharfe Bewegung aus dem Handgelenk zu, und klopfen Sie leicht auf Küchenpapier trocken.
- Aufschwemmen Sie für Oberflächen beflecken jeder Zelle-Pellets in 20 µL FACS-Puffer mit den Antikörpern von Interesse (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5 und MHC-Klasse II-Biotin) und inkubieren Sie, geschützt vor Licht, für 30 min auf Eis.
Hinweis: (1) die optimale Antikörper Verdünnung sollten entschlossen vor dem Gebrauch durch Ausführen einer Verdünnungsreihe nach Produktinformationen des Herstellers; (2) eine unspezifische Färbungen können durch Inkubation mit Fc-Block in diesem Schritt nach den Anweisungen des Herstellers reduziert werden; und (3) Isotype Kontrolle Färbungen sind in der Regel nicht erforderlich, wenn mit primären Antikörper konjugiert direkt mit einem Fluorophor und/oder wenn die Antigene von Interesse unterschiedliche Bevölkerungen produzieren. - Jedes gut 130 µL FACS Puffer hinzu und Zentrifugieren der Platte 400 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den Überstand, wie zuvor beschrieben (Schritt 4.3) und die Zelle Pellets zweimal mit 150 µL des FACS-Puffers zu waschen.
Hinweis: Bei Verwendung einer unconjugated Primärantikörper oder einer primären Antikörper konjugiert, Biotin, dann eine geeignete sekundären Reagenz, konjugiert zu einem Fluorophor kann an dieser Stelle hinzugefügt werden und Schritte 4,4-4,5 werden wiederholt. Im Falle dieses Protokoll wurde Streptavidin-PE/Cy7 oder Streptavidin-PerCP zur MHC Klasse II in Kombination mit CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5 oder in Kombination mit CD68-APC und F4/80-PE/Cy7, bzw. zu erkennen. - Zur Fixierung, nach dem letzten Waschschritt Aufschwemmen der Zelle Pellets in 100 µL 4 % Paraformaldehyd mit PBS-Puffer (pH 7,4). Brüten die Platte für 10 min auf Eis und anschließend Zentrifugieren bei 400 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen des Überstands als zuvor beschrieben (Schritt 4.3) und waschen Sie die Zelle Pellets einmal mit 150 µL des FACS-Puffers.
Achtung: Paraformaldehyd ist giftig; tragen Sie geeignete Schutzmaßnahmen wie Handschuhe und Brille, etc..
Hinweis: Aufschwemmen der Zelle Pellets in 150 µL FACS-Puffer und lagern Sie lichtgeschützt bei 4° C für bis zu zwei Tage. Keine intrazelluläre Färbung erforderlich ist, dann gehen Sie zu Schritt 4.11 nach dem Zentrifugieren der Platte 400 X g für 5 min bei 4 ° C. - Intrazelluläre Färbung, Aufschwemmen Sie der Zelle Pellets in 150 µL FACS buffer+0.5% Waschmittel und bei Raumtemperatur, lichtgeschützt für 15 min. Zentrifugieren der Platte 400 X g für 5 min bei 4 ° c inkubieren Verwerfen Sie den Überstand zu, wie zuvor beschrieben (Schritt 4.3) und waschen Sie der Zelle Pellet einmal mit 150 µL FACS Puffer + 0,5 % Waschmittel zu. Aufschwemmen der Zelle-Pellets in 20 µL FACS buffer+0.5% Waschmittel, enthält die Antikörper von Interesse (CD68-APC, CD206-PE) und inkubieren, lichtgeschützt bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
- Jedes gut 130 µL FACS buffer+0.5% Spülmittel hinzu und Zentrifugieren der Platte 400 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den Überstand, wie zuvor beschrieben (Schritt 4.3) und die Zelle Pellets zweimal mit 150 µL FACS Puffer + 0,5 % Waschmittel zu waschen.
Hinweis: Bei Verwendung einer unconjugated Primärantikörper oder einer primären Antikörper konjugiert, Biotin, dann eine geeignete sekundären Reagenz, konjugiert zu einem Fluorophor hinzugefügt werden an dieser Stelle und 4,9-4.10 Schritte wiederholt. - Aufschwemmen der Zelle Pellets in 150 µL FACS Puffer + 0,5 % Waschmittel und Store, lichtgeschützt bei 4 ° C für bis zu zwei Tage.
- Aufschwemmen Sie die Zelle Pellets mit 150 µL FACS Puffer + 0,5 % Waschmittel ergänzt mit 5 µg/mL DAPI und inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. Zentrifugieren Sie die Platte 400 X g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand, wie zuvor beschrieben (Schritt 4.3) zu verwerfen.
- Die Zelle-Pellets in 150 µL PBS und Übertragung auf einen entsprechend gekennzeichneten FACs-Schlauch aufzuwirbeln. Lagerung bei Raumtemperatur, lichtgeschützt, bis bereit für die Analyse.
Hinweis: Nach Wiederfreisetzung mit PBS-Puffer, sollten die Zellen innerhalb von Stunden, analysiert werden, da das DAPI wird langsam von der DNA, was zu einem Verlust im Signal zu distanzieren.
5. Setup der Durchflusszytometrie und Ausführung von Proben
- Sicherstellen Sie, dass das Durchflusszytometer über die geeignete Laser verfügt und/oder Filter setzt auf um die Fluorophore verwendet, um die Zellen färben zu messen. Dies kann unter Cytometer Standardkonfiguration auf dem System ermittelt werden. Bei diesem Protokoll wurden Zellen mit einem Durchflusszytometer, ausgestattet mit drei Lasern analysiert (405 nm, 488 nm und 633 nm) ermöglicht die Erkennung von ≤ 5 Fluorophore.
- Wählen Sie die entsprechenden Kanäle für die Erkennung von Fluorophore von Interesse. Alle fluoreszierenden Signale werden am besten mit logarithmischen Verstärkung entdeckt.
- Wählen Sie eine entsprechende Volumenstrom für die Proben. Dieser Parameter kann variieren, abhängig von dem System verwendet und sollte empirisch ermittelt werden. Im Falle dieses Protokoll wurde ein Durchfluss von MED-HI (35-60 µL/min) verwendet, um zu verhindern Verstopfung der Nadel.
- Wählen Sie die Gesamtzahl der Veranstaltungen/Zellen pro Probe gesammelt werden. Die minimale Anzahl von Ereignissen sollte 1.000.000.
- Erstellen von Streudiagrammen unter einem globalen Arbeitsblatt der SSC-A im Vergleich zu FSC-A, sowie für jede Fluorophor des Interesses gegen FCS-A. Erstellen Sie eine statistische Ansicht, die die Anzahl der Ereignisse und die mittlere Fluoreszenz Intensität (MFI) für die ausgewählten Fluorophore angezeigt wird.
- Stellen Sie die Spannung der FSC-A und SSC-A Kanäle, so dass die kleinsten Zellen in der unteren linken 10 % das Streudiagramm passen. Bestimmen Sie die Hintergrundfluoreszenz und minimale Probe Fluoreszenz von ungefärbten Steuerelemente aus den Ischias Nerven oder DRGs. bestimmen Sie die Streuung der übergeordneten (P1) Tor Grundlage aus DAPI-nur Plotten Färbung Kontrollen.
Hinweis: Dies ist keine Sammlung Tor aufgrund zum Teil auf die Heterogenität der Bevölkerung DAPI + in der PNS. - Mit dem FSC Scatter Grundstücke für jeden der das Fluorophore von Interesse, die Spannungen so einstellen, dass die Zellen des ungefärbten Steuerelements in das untere Viertel ihrer jeweiligen Streudiagrammen fallen. Tore entstehen dann über diese Region für diese Zellen zu definieren, die für jede der jeweiligen Marker/Fluorophore positiv sind. Die Platzierung eines Tores wird durch die Ausführung der einzelnen gebeizt Steuerung (Schritt 4.1) bestätigt.
Hinweis: Entschädigung für überlappende Emissionsspektren kann an dieser Stelle durchgeführt oder rückwirkend mit der entsprechenden Analysesoftware. - Sobald das Durchflusszytometer eingerichtet, hat wie beschrieben, können die Beispiele ausgeführt werden.
- Nach dem Lauf der verbleibenden Probenmaterial kann weggeworfen werden und zur weiteren Analyse der FCS-Dateien exportiert werden können.
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Representative Results
Zellsuspensionen von Full-length Ischias Nerven und allen wichtigen DRG waren vorbereitet, nach dem Protokoll von sechs gesunde C57BL/6 Mäusen und unterteilt in drei gleiche Aliquote zum Färben. Zähler mit DAPI, die DNA zu Flecken, beflecken erlaubt die Erkennung einer einzelnen Zelle Bevölkerung (Abbildung 1A–B, obere Leiste). Auswaschen DAPI, vor der Analyse von Durchflusszytometrie, sank in einem Ausmaß die fluoreszierende Intensität der-kernhaltige Trümmer, die für die Auswahl einer diskreten Bevölkerung über die FSC-Achse von Single-kernhaltige Ereignissen oder Unterhemden ermöglicht. Keine Sammlung Tor wird angewendet, sobald die Unterhemden von PNS über eine große Palette von FSC und SSC (Abbildung 1) verteilt sind. Das Material am oberen Ende der FSC-Achse, die unvollständig enthält Gewebe verdaut, muss bei der Auswahl der Singulett-Bevölkerung (Abbildung 1A–B) ausgeschlossen werden. Mit einer Dichte Handlung (untere Leiste) zur Anzeige der Ergebnisse kann der Ausschluss des großen Trümmer (untere Leiste) erleichtern. Insgesamt 30.000 Unterhemden ≥ erhalten Sie regelmäßig aus zwei vollen Ischias Nerven und ≥200, 000 Unterhemden von DRGs (Abbildung 1) erreicht werden. Von den Ischias Nerven ausgedrückt etwa 5 % der Unterhemden CD45 auf ihrer Oberfläche, während etwa 5-10 % fanden sich in der DRGs, damit diese Zellen als Leukozyten hämatopoetischen Ursprungs (Abbildung 2A) zu definieren.
Ein Großteil der CD45+ Unterhemden ausgedrückt auch MHC Klasse II, in gewissem Sinne schrittweise (Abb. 2 b). In der DRGs CD11b einsetzbar, Mikroglia-wie Zellen zu erkennen (CD45Dimmen, ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG+ und CD11b+) (Abb. 2 b, obere Leiste). Allerdings fehlt dieser Mikroglia Population von den Ischias-Nerven (Abb. 2 b, unten). Ein Großteil der Unterhemden mit dem Ausdruck CD45 in der PNS sind CD68+ Makrophagen. In den Ischiasnerv und DRG, 2-5 % von den Unterhemden ausgedrückt CD68 (Abb. 3A). Alle Zellen, die mit dem Ausdruck CD68 ausgedrückt CD45 (Daten nicht gezeigt). In der DRGs, die CD68+ Makrophagen wurden heterogener in ihrem Ausdruck der beiden MHC Klasse II und CD206, ein Marker für die M2-Makrophagen, als in den Ischias-Nerven (Abb. 3 b–D). In den Ischias Nerven die meisten Makrophagen Co exprimierten MHC Klasse II und CD206 (Abb. 3 b–D, unteren Platten); in der Regel ca. 60-80 % von den CD68+ Makrophagen ausgedrückt CD206, während ein kleinerer Teil der den CD68+ ausgedrückt Co CD206 in die DRGs (Abb. 3 b). Interessanterweise hat der M1 Makrophagen Marker CD86 nicht generiert positive Färbung, weder auf Makrophagen von Nerv noch von PCL (Daten nicht gezeigt). Die Makrophagen Marker F4/80, zeigte einen heterogene Ausdruck sowohl in DRG Ischias Nerven (Abb. 3 b–C), einen Anteil an den CD68 Färbung– und ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG– Zellen. Darüber hinaus F4/80 Ausdruck nicht vollständig mit den CD68 Ausdruck überschneiden.
Abbildung 1: repräsentative Daten von Flow-Zytometrie-Analyse des DAPI gefärbt kernhaltigen Zellen von DRG und Ischiasnerv. Alle Ereignisse gesammelt, dargestellt als Scatterplots (obere Leiste) oder Dichte von DRG (A) oder (B) Ischiasnerv (SN) eine repräsentative Maus (untere Platte), Grundstücke. Pfeile in den unteren Platten zeigen die Toren, ausgenommen das Material an der Spitze der FCS-Achse. (C) Rücken-gating der Zellen in das DAPI-Gate (Unterhemden), gezeigt im Streudiagramm SSC vs. FSC-Panel (A) gesammelt. (D) Anzahl der Unterhemden von SN und allen wichtigen DRG aus sechs gesunden C57BL/6 Mäusen. Darstellung von Daten Mittelwert ± SD Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Flow Cytometry Analyse der Oberflächenexpression von CD45, MHC-Klasse II, und CD11b auf Unterhemden von DRG und Ischiasnerv. Veranstaltungen in das DAPI-Gate (Unterhemden) in Abbildung 1 dargestellte ausgewählt wurden analysiert. (A) Anteil an den Unterhemden CD45 in der Ischiasnerv (SN) auszudrücken und DRG aus sechs Kontroll-Mäusen. (B) repräsentative Scatter Grundstücke Unterhemden von DRG (obere Abdeckung) und SN (untere Leiste). Zellen mit dem Ausdruck CD11b sind durch blaue Farbe gekennzeichnet. Darstellung von Daten Mittelwert ± SD Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Flow Cytometry Analyse der Oberflächenexpression von CD68, MHC-Klasse II, und CD206 auf Unterhemden von DRG und Ischiasnerv. Veranstaltungen in das DAPI-Gate (Unterhemden) in Abbildung 1 dargestellte ausgewählt wurden analysiert. (A) Anteil an den Unterhemden CD68 im Ischiasnerv (SN) und DRGs aus sechs gesunden C57BL/6 Mäusen zum Ausdruck zu bringen. (B) Anteil des CD68+ Makrophagen Co CD206 in SN und DRG aus sechs gesunden C57BL/6 Mäusen auszudrücken. (C) repräsentative Streudiagrammen von Unterhemden von DRG (obere Abdeckung) und SN (untere Leiste) zeigt CD68 und MHC-Klasse-II-Ausdruck. (D) repräsentative Streudiagrammen von Unterhemden von DRG (obere Abdeckung) und SN (untere Leiste) zeigt CD68 und CD206 Ausdruck. Mit dem Ausdruck F4/80 Zellen sind mit Magenta Farbe gekennzeichnet. Darstellung von Daten Mittelwert ± SD Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Ischias Nerven enthalten einen großen Anteil an Lipiden, wie Cholesterin, aufgrund des Gehaltes an Myelin um die Axone. Da die Eigenschaften von Lipiden mit Temperatur ändern, erhalten Sie unterschiedliche Ergebnisse bei unterschiedlichen Temperaturen. Um die Zelle Erhaltung zu gewährleisten, wurden alle Schritte in diesem Protokoll nach der Verdauung auf Eis durchgeführt. Während Konsistenz aus Gründen der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse empfohlen wird, kann Ausbeute zu erhöhen, durch Ausführen der Schritte 3.6 und 3.7 bei Raumtemperatur möglich. Wenn die Nerven bei Schritt 3,8 ausreichend nicht verdaut haben, werden kleine Stücke von Nerv auf dem Netz angezeigt. Im Falle unzureichender Verdauung kann das Material auf dem Netz erhalten wieder verdaut werden, durch die Übertragung auf eine neue 1,5 mL-Tube mit 250 µL Verdauung Medien und sich wiederholende Schritte 3.2-3.6. Wenn der Ertrag ist Armen, dann eine Probe von der Zellsuspension nach vorbei durch das Sieb (Schritt 3.6) unter einem Lichtmikroskop mit Trypan blau angezeigt werden soll. Tragfähig, nicht-blau, Zellen sollte zusammen mit stabförmige Strukturen sichtbar, die Fragmente der Axone sind. Wenn keine lebensfähigen Zellen vorhanden sind, dann verursachte die Verdauung und/oder falsche Übergabe des Materials Nekrose. Wenn nur große Aggregaten sichtbar sind, empfiehlt es sich, das Material zu sammeln, durch Zentrifugation und wiederholen die Verdauung (Schritte 3.2-3.6).
Die Methode der Flow Cytometer-Analyse der murinen Ischias Nerven und DRGs eignet sich für Fragen rund um ganze Nerven und mehrere DRGs. vor kurzem gab es ein erhöhtes Interesse an der Analyse der PNS mit flow Cytometry11,12 . Liu Et Al. entwickelten eine Methode mit Papain und mechanische Dissoziation des Ischias-Nerven und DRGs mit 21 G und 23 G gezielt so wenig wie 1 cm Abschnitt des Nervs zu analysieren, wodurch für die Analyse der Nerv Material von bestimmten Websites von Verletzungen11. Die hier vorgestellte Methode empfiehlt sich für die Auswirkungen auf die PNS, systemisch, wie in Neurotoxicology und genetische Modelle der Neuropathie oder bei chronischen Erkrankungen wie Diabetes sein soll. Aufgrund der niedrigen Ertrag von kernhaltigen Zellen aus Ischiasnerv es empfiehlt sich nicht versuchen, kleine Populationen mit ≤ 100 gated Ereignisse aus einer einzelnen Maus zu studieren. Jedoch würde die Bündelung von Material aus mehreren Mäusen das Studium solcher kleiner Populationen innerhalb der Nerv erleichtern. Dennoch wäre es interessant zu untersuchen, ob die enzymatische Gewebe Dissoziation mit Papain und 21G / 23G Nadeln von Liu Et Al. beschrieben 11 kann kombiniert werden mit dem Flow Cytometry beflecken von Kernen, wie beschrieben in dieser Studie, um den Ertrag der einzelnen Zellen zu verbessern. Die Möglichkeit, sehr kleine Mengen von Gewebe zu analysieren ist entscheidend für die Durchführung von Vergleich zwischen Ipsi- und kontralateralen DRGs nach einseitigen Ischiasnerv Axotomie. Dies ist jedoch den Rahmen dieser Studie sprengen. Interessanterweise fanden sich häufig verwendeten Marker zur Identifizierung von Makrophagen, um unerwartet heterogenen Ausdruck in der PNS von Mäusen zu haben. Zum Beispiel wurden CD11b und F4/80 beide gefunden auf einen Großteil der nicht-hämatopoetischen, nicht antigenpräsentierende Zellen im Ischiasnerv und DRGs ausgedrückt werden. Darüber hinaus in den Ischias Nerven, nicht alle CD68+ Makrophagen ausgedrückt CD11b und F4/80, wie aus der Studie von anderen Organen zu erwarten gewesen wäre. Es wird daher empfohlen, dass Vorsicht geboten ist bei Verwendung dieser Marker für die Studie von Makrophagen in der PNS und andere Marker wie CD163, untersucht werden sollte. Darüber hinaus sollte die Empfindlichkeit der verschiedenen Markierungen, die enzymatische Spaltung auch als dies vielleicht eingerichtet werden, eine Erklärung für die Unterschiede im Ausdruck, z. B. mit CD11b oder F4/80 zu beachten.
Dieses Protokoll wurde zuvor verwendet, um die Immunzellen in der PNS nach giftigen Herausforderung mit Streptozocin (STZ)13, eine Chemikalie, die üblicherweise für die Induktion von Diabetes in Modellorganismen Nagetier zu analysieren. Es wurde gezeigt, dass zunächst STZ, die TRPV1 und TRPA1 aktiviert, eine Erschöpfung der Immunzellen im Ischiasnerv und DRGs, verursacht, während keine Entzündung im Nerv verursacht. Obwohl die Zahl der Immunzellen in der DRGs wiederhergestellt, die Immunzellen und vor allem Makrophagen noch deutlich erschöpft waren post drei Wochen giftige Herausforderung. Es wurde anschließend die Hypothese, dass Makrophagen Phagozytose von Nerv Schutt, infolge Verletzung durch Ionen-Kanal Übererregbarkeit kann führten zu die Apoptose von Makrophagen, wodurch ihre Erschöpfung von der allgemeinen Zellpopulation. Es ist nicht bekannt, wie andere periphere Nervengifte Nerv resident Makrophagen beeinflussen. Wenn Erschöpfung von Makrophagen ein gemeinsames Ergebnis solcher Erreger ist kann das Auswirkungen auf die Behandlung haben.
Es wurde festgestellt, dass nur 5-10 % der kernhaltigen Zellen vom Nerv Leukozyten hämatopoetischen Ursprungs waren. Die verbleibenden Zellen sind vermutlich eine Mischung der anderen Nervenzelle, nämlich Schwann-Zellen, Endothelzellen, Perizyten und Fibroblasten. Aufgrund der Kapazität der Durchflusszytometrie sind Systeme zur Messung mehrerer Parameter und vorausgesetzt, dass es spezifische Marker und/oder Antikörper zur Verfügung, es denkbar, dass diese Zelltypen auch mit dieser Methode analysiert werden könnte. Diese Methode wurde für murine Material beschrieben. Mit einigen Änderungen, hat jedoch auch für die Analyse von PNS Material vom Schwein und vom menschlichen verwendet worden. Es wird erwartet, dass diese Methode in Zukunft für die Analyse des Materials von Arten größer als Mäuse, nützlicher sein wird.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte in Bezug auf diese Studie.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SFB1118). Die Autoren möchten Axel Erhardt für die Durchführung der Großteil der Dissektion und hilfreiche Vermittlung dieses Wissens und Dr. Volker Eckstein für die Unterstützung bei den technischen Aspekt der das Durchflusszytometer danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve - tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
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