Análisis de las células inmunes en solo de los nervios ciático y de ganglio de raíz Dorsal de un ratón mediante citometría de flujo

Asa S. Hidmark; Peter P. Nawroth; Thomas Fleming

doi:10.3791/56538

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Artículo de método

Análisis de las células inmunes en solo de los nervios ciático y de ganglio de raíz Dorsal de un ratón mediante citometría de flujo

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DOI:

10.3791/56538

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6 de diciembre de 2017

Asa S. Hidmark¹ , Peter P. Nawroth¹^,²^,³ , Thomas Fleming¹^,³

¹Department of Medicine I and Clinical Chemistry, University Hospital of Heidelberg, ²Institute for Diabetes and Cancer IDC Helmholtz Center Munich, Germany & Joint Heidelberg-IDC Translational Diabetes Program, ³German Center for Diabetes Research (DZD)

En este artículo

Resumen

Análisis cuantitativo de contenido de la celda dentro del nervio ciático murino es difícil debido a la escasez del tejido. Este protocolo describe un método para la digestión del tejido y la preparación que proporciona suficientes células para el análisis de citometría de flujo de poblaciones de células inmunitarias de los nervios de los ratones.

Resumen

Residente del nervio las células inmunes en el sistema nervioso periférico (PNS) son esenciales para mantener la integridad neuronal en un nervio sano. Las células inmunes de la PNS son afectadas por lesiones y enfermedad, que afecta a la función del nervio y la capacidad de regeneración. Las células inmunes neuronales comúnmente son analizadas por inmunofluorescencia (IF). Mientras que si es esencial para determinar la ubicación de las células inmunes en el nervio, si es solamente semicuantitativa y el método se limita al número de marcadores que se pueden analizar simultáneamente y el grado de expresión superficial. En este estudio, citometría de flujo se utilizó para el análisis cuantitativo de la infiltración de leucocitos en los nervios ciáticos o ganglios de raíz dorsal (GRD) de los ratones. Realizó el análisis unicelular con DAPI y varias proteínas se analizaron simultáneamente para la expresión superficie o intracelular. Ambos nervios ciático de un ratón que fueron tratados de acuerdo con este protocolo genera 30.000 eventos nucleados simples ≥. La proporción de leucocitos en los nervios ciáticos, determinados por la expresión de CD45, fue aproximadamente 5% del contenido total de células en el nervio ciático y aproximadamente 5-10% en el DRG. Aunque este protocolo se centra principalmente en la población de células inmunitarias en el PNS, la flexibilidad de la citometría de flujo para medir un número de marcadores simultáneamente significa que las otras poblaciones de células presentes dentro del nervio, tales como las células de Schwann, pericitos , fibroblastos y células endoteliales, pueden también ser analizadas utilizando este método. Por lo tanto, este método proporciona nuevos medios para el estudio de efectos sistémicos en el PNS, como neurotoxicología y modelos genéticos de la neuropatía o enfermedades crónicas como la diabetes.

Introducción

Las células inmunes que entran en el PNS de la circulación, según lo definido por la expresión de CD45 y CD11b, ayudan a mantener la integridad del nervio y desempeñar un papel tanto en regeneración y degeneración¹. Macrófagos (definidos por la expresión de CD68 en ratón) pueden ser sesgados hacia un fenotipo inflamatorio, expresando más MHC de clase II y CD86 en la superficie (M1), o hacia un fenotipo antiinflamatorio, expresando más CD206 intracelular (M2)². Sesgo del fenotipo macrófago es un proceso dinámico que regula a través de Akt señalización³, reflejando las diferentes tareas de macrófag....