Summary
Este protocolo describe el uso cultivadas Aorta-gónada-mesonefros para análisis de expresión, unidades formadoras de colonias en la cultura y el bazo y la reconstitución a largo plazo para determinar el efecto de factores reguladores y vías de señalización de vástago de hematopoietic desarrollo de la célula. Esto ha sido demostrado como un sistema eficaz para el estudio de la función y biología de células madre hematopoyéticas.
Abstract
La limitación del uso de embriones de ratón para los estudios de la hematopoyesis es el mayor inconveniente en operaciones, que es en gran parte debido al desarrollo intrauterino del embrión. Aunque los datos genéticos de ratones knockout (KO) son convincentes, no es realista para generar ratones KO para todos los genes según sea necesario. Además, en vivo rescate experimentos para consolidar los datos obtenidos de ratones KO no es conveniente. Para superar estas limitaciones, se desarrolló la cultura de explante de Aorta-gónada-mesonefros (AGM) como un sistema apropiado para el estudio de desarrollo de células madre hematopoyéticas (HSC). Especialmente para los experimentos de rescate, puede utilizarse para recuperar el deterioro de la hematopoyesis en ratones KO. Mediante la adición de los productos químicos adecuados en el medio, la señalización deteriorada puede ser reactivada o vías regulado de arriba pueden ser inhibidas. Con el uso de este método, muchos experimentos para identificar los reguladores críticos de desarrollo de HSC se puede realizar, incluyendo HSC relacionados con la expresión del gen en ARNm y proteínas, capacidad de formación de Colonia y capacidad de reconstitución. Esta serie de experimentos sería útil en la definición de los mecanismos subyacentes esenciales para el desarrollo de HSC en los mamíferos.
Introduction
Las células madre hematopoyéticas (HSCs) son específicas de tejido las células madre adultas que poseen potencial del multilineage incluyendo eritroide, mieloide y linfocitos así como la capacidad de autorrenovación. Estudios recientes han demostrado que las HSCs más tempranas surgieron una población endotelial especializada, conocida como endotelio hemogenic (él), a través endotelial transición hematopoyético (EHT) en la pared ventral de la aorta dorsal1,2 ,3,4. Una vez formados en la aorta-gónada-mesonefros (AGM) región embrionaria (E) 10.5 a E12.5 en el embrión de ratón, HSCs a migrar en el hígado fetal para la expansión y finalmente colonizar la médula ósea para mantener la hematopoyesis durante toda la vida de un individuo adulto 5 , 6. aunque esto ha sido estudiado por muchos años, los mecanismos subyacentes de la aparición de HSC y el desarrollo siguen siendo incompleto entendidos.
A diferencia de la fertilización in vitro y el desarrollo de embriones de pez cebra, desarrollo intrauterino de embriones de ratón hace que el estudio de la hematopoyesis definitiva durante la embriogénesis mucho más incómoda. Aunque comúnmente se utilizan experimentos genéticos con ratones knockout (KO), la falta de ciertos ratones KO también limita su uso en el campo de investigación hematopoyético. Además, los experimentos en vivo rescate no se realizan fácilmente en los ratones KO. Desde 1996, el cultivo de explantes de AGM se ha desarrollado estudios hematopoyéticos por los pioneros en el campo7. Con la ayuda de este sistema de cultivo, se han identificado los tejidos ventrales de la región AGM para promover actividad HSC, mientras que los tejidos dorsales ejercen un efecto opuesto8,9. El sistema de cultivo de explantes AGM también se ha aplicado para determinar el papel de la serotonina, Mpl, SCF, BMP y erizo en HSC desarrollo10,11,12,13, 14. lo importante, es también un método popular usado para rescate hematopoyéticos defectos en embriones mutantes13,15.
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Protocol
todos los procedimientos incluyendo temas animal han sido aprobados por el Comité de examen ético en el Instituto de Zoología de la Academia China de Ciencias, Beijing, China.
1. preparación de material
- esterilizar los 0.65 μm filtros ULTRAVIOLETA rayos producidos bajo la luz ultravioleta ray lámpara sobre la mesa de trabajo limpia durante 4 h y vuelta los filtros después de la marca de 2 h.
Nota: Cuando se trabaja con luz ultravioleta, use protección adecuada. - Esterilizar las mallas de acero inoxidable con el esterilizador de la autoclave a 121 ° C por 30 minutos.
Nota: Se necesita cierta altura de malla de acero inoxidable para soportar los filtros en la interfase aire-líquido y esto puede realizarse con el alambre de la malla de acero ( figura 1 A). - Fluoxetina diluir a una concentración final de 10 μm en el MAX® 5300 a largo plazo de la cultura media y mezclar uniformemente.
Nota: Para una placa de seis pozos, medio de cultivo a largo plazo 2 mL MAX® 5300 es apropiado para cada bien. Hidrocortisona en 10 -6 M puede ser selectivamente diluido al medio. - Transferencia suplementado con fluoxetina en 10 μm en placas de 6 pocillos o platos y poner las mallas de acero inoxidable esterilizado en el medio.
- Lavar el 0,65 μm los filtros con agua hirviendo dos veces por 3 minutos cada uno en la placa de cultivo celular de vidrio para la esterilización. Después de cada lavado, sitúe los filtros en tampón fosfato salino (PBS) durante 2 minutos y lugar mojado filtros en acero inoxidable mallas de pie en la interfase aire-líquido como se muestra en la figura 1 A [pdf en el centro].
Nota: Agua hirviendo puede ser generado con el esterilizador de autoclave para conseguir la asepsia y debe ser saque equipo Esterilizador autoclave de manera oportuna para evitar una disminución en la temperatura.
2. Cultura de explante de AGM
- separar cuidadosamente las regiones AGM de los embriones E10.5 o E11 con fórceps.
- Los úteros de ratones embarazadas la tira con las tijeras de disección y separar los embriones de los úteros.
- Limpie el saco vitelino, el cordón umbilical y la víscera del cuerpo del embrión.
- Remueva cuidadosamente los tejidos finos del nervio dorsal y tejidos musculares circundantes.
- Corte de los tejidos con el fórceps en el sitio de las extremidades anteriores y posteriores y separa la región AGM del cuerpo del embrión. las figuras 1 B-C muestra la representación esquemática y morfología de AGM disecada.
- Presentaron la AGA disecado por separado en los filtros en la interfaz aire-líquido ( figura 1 A) y la cultura en el 5% de CO 2 a 37 ° C durante 2-3 días.
Nota: No coloque la AGM disecada sobre el alambre de la malla de acero y asegúrese de que los filtros estén en la interfase aire-líquido en cultura. Además de la Junta General, hígado fetal y saco vitelino también pueden ser cultivadas con este sistema de 7.
3. Análisis de la expresión
- nivel de mRNA
- recoger las cultivadas juntas en 1 mL de PBS y centrifugar a 4 ° C, 310 g x 6 min
- Después de retirar el sobrenadante, ARN total se extrae de la AGA recogidos con una solución monofásica de fenol, según el fabricante ' instrucciones s.
- ARN total (2 μg) es entonces revés transcrito utilizando la transcriptasa reversa M-MLV para obtener cDNA como plantilla. El análisis cuantitativos de PCR en tiempo real se realizan con SYBR Green y Gapdh se utiliza como el control interno.
- Nivel de la proteína
- recoger la AGM cultivada como se describió anteriormente en el paso 3.1.1.
- Preparar la proteína de la AGM cultivada con el tampón de lisis celular (10 mM Tris-HCl 10 mM NaCl y 0,5% NP-40) que contiene el inhibidor de la proteasa y el uso de western blot para detectar el nivel de proteína como se ha descrito 13.
4. Unidades formadoras de colonias en el ensayo de cultivo (CFU-C)
- después de cultivo durante 2-3 días, recoger las regiones AGM en 1 mL tamponada fosfato salina (PBS) y centrifugar a 4 ° C, 310 x g durante 6 minutos y disociar con colagenasa de μl 200 (0.1% en PBS) a las 37 ° C.
Nota: El tiempo necesario para que colagenasa generar suspensiones de células individuales es cerca de 20 minutos. Sacudiendo el tubo que contiene AGM cada 5 minutos pueden acelerar el proceso de digestión. Colagenasa de 0.1% de 200 μl se utiliza para cada AGM y 200 μl 10% de suero se utiliza para detener la reacción.
Solo suspensiones celulares en medio de la M3434 en placas de 24 pocillos de fijación ultra baja de la cultura de - .
Nota: Para evitar la contaminación, solución de penicilina-estreptomicina puede ser selectivamente añadió al medio. Porque el M3434 medio es viscoso, se utiliza una 1,0 jeringa de cc sin aguja para mezclar las células y el medio. - Después de 7 - 10 días de cultivo a 37 ° C en 5% CO 2, el número de cada tipo de colonias incluyendo explosión formando unidad--eritroides (BFU-E), UFC-granulo-monocitos (UFC-GM) y CFU-granulocitos, eritrocitos, macrófagos, megacariocitos (UFC-GEMM) son distinguidos basados en la morfología y anotó con un microscopio invertido ( figura 2 C).
5. En Vivo Ensayo de trasplante
- formadoras de colonias (CFU-S) de unidades-bazo ensayo
- después de 2 - 3 días de cultivo de explantes, reunir las juntas y preparar suspensiones celulares solo por incubación con 200 colagenasa μl (0.1% en PBS) 20 mínimo
- Realizar la irradiación letal (9 Gy de rayos x) de 8 a 10 semanas de edad ratones C57BL/6 machos 4-5 h antes de la inyección celular.
- Poner el ratón irradiado en un limitador para restringir su actividad.
- Limpiar la cola con un hisopo de algodón empapado en alcohol al 75% para promover la vasodilatación de la vena.
- Inyectar 0,5 embrión equivalente (ee) o 1 ee sola suspensiones celulares de AGM por vía intravenosa en la vena de la cola de ratón irradiado con una jeringa de cc 1,0.
Nota: Se suspenden las células con PBS y 0.5 mL de PBS por receptor es un volumen adecuado. Una aguja de calibre 25 o calibre 26 tamaño se utiliza para la inyección con una 1,0 jeringa de cc. Aire no se puede introducir en la jeringa. Presione el sitio de la inyección con un algodón embebido en antiséptico para detener el sangrado. - Once días post trasplante, recoger y fijar el bazo de los ratones receptores en Bouin ' solución de s (solución acuosa de ácido pícrico de 1.22% saturado de 15 mL, 2 mL 40% de metanol y 1 mL de ácido acético) durante 1-2 días y lavado con alcohol 80% otro 1-2 días. Contar las colonias visibles en el bazo macroscópicamente y determinar el número de colonias por ee.
Nota: Bouin ' fijador s, use protección adecuada.
- Ensayo a largo plazo de trasplante
- después de 2-3 días presentaron cultivo, recoger el Aga y preparar suspensiones celulares solo por incubación con 200 colagenasa μl (0.1% en PBS) durante 20 min
- Realizar la irradiación letal (9 Gy de rayos x) de 8 a 10 semanas de edad ratones C57BL/6 machos 4-5 horas antes de la inyección celular.
- Poner el ratón irradiado en un limitador para restringir su actividad.
- Limpiar la cola con un hisopo de algodón empapado en alcohol al 75% para promover la vasodilatación de la vena. < lYo > inyectar 0,5 embrión equivalente (ee) o 1 ee solo suspensiones celulares de AGM por vía intravenosa en la vena de la cola de un ratón irradiado con una 1,0 jeringa de cc. AGM se inyectan a dosis de 1 ee por receptor con 2 × 10 5 células de médula ósea (fondo CD45.1).
Nota: no se puede introducir aire en la jeringa. Presione el sitio de la inyección con un algodón embebido en antiséptico para detener el sangrado. - Cuatro meses de poste-trasplante, recolectar la médula ósea del receptor y utilizar para el ensayo de reconstitución por FACS. Sólo los receptores con ≥ 10% donante-derivadas quimerismo se consideran exhibir reconstitución éxito.
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Representative Results
Una publicación reciente informó de serotonina célula-derivados endotelial promueve la supervivencia de HSCs inhibiendo la vía de favorables-apoptotic en el AGM13. Para confirmar el efecto promoción de la serotonina sobre el desarrollo de la HSC, se incluyó la fluoxetina. Como un inhibidor de la recaptación de serotonina (ISRS), fluoxetina ha demostrado inhibir la reabsorción de la serotonina en los tejidos periféricos16,17,18. Usando el AGM presentaron el sistema de cultivo, el efecto de fluoxetina sobre el desarrollo de HSC fue examinado mediante el procedimiento presentado arriba. Las expresión análisis demostradas aumento de la expresión de Runx1, que se define como un gen fundamental para HSC desarrollo19, en AGA tratados con fluoxetina en los niveles de mRNA y proteína, respectivamente (figura 2A y 2B). Fluoxetina puede también aumentar la capacidad de formación de Colonia de HSCs en la Junta General, incluyendo BFU-E, UFC-GM y UFC-GEMM (figura 2C yDde la figura 2). Además, en vivo los resultados del trasplante demostraron que HSCs en la AGM tratados con fluoxetina pueden aumentar el número de colonias del bazo en recipientes adultos irradiados (figura 2E).
Figura 1 . Representación esquemática de la estructura de la AGM y explante sistema de cultivo.
(A) el diagrama de flujo para el uso de la AGM explante cultura systemto examinar el efecto de productos químicos en el desarrollo de HSCs. Brevemente, juntas son disecados de embriones y cultivadas en los filtros en la interfase aire-líquido con sustancias químicas diluidas en medio de cultivo a largo plazo MAX® 5300. 2 - 3 días más tarde, AGA cultivados se recogen y se utiliza para examinar la expresión de genes relacionados con hematopoyético, capacidad de formación de Colonia y capacidad de repoblación. AGM, aorta-gónada-mesonefros; Unidades de CFU-C, formadoras de colonias en la cultura; CFU-S, forman colonias unidades-bazo. (B) en este diagrama se muestra la estructura de la AGM. Una, aorta dorsal; Me, mesénquima; G, gónada; M, mesonefros. (C) la morfología de AGM. La Junta General se separa de la mitad caudal del cuerpo embrionario con las células mesenquimales circundantes en E10.5. Barras de escala = 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Aplicación de la AGM presentaron sistema de cultivo para detectar el efecto de fluoxetina sobre el desarrollo de la HSC. (A) el nivel de mRNA de Runx1 en la AGA tratados con fluoxetina en 10 μm fue detectado por PCR cuantitativa en tiempo real. Prueba t de Student: **, P < 0.01. Los resultados se presentan como media ± SEM. (B) Western Blot análisis más confirmó que el aumento de la expresión de Runx1 en el nivel de proteína en la AGA tratados con fluoxetina. (C) las representativas imágenes muestran la morfología de BFU-E, UFC-GM y UFC-GEMM. Barras de escala = 100 μm. (D) CFU-C ensayo demostró que el tratamiento de fluoxetina puede aumentar el número de cada tipo de Colonia. Se utilizó un embrión equivalente (ee). Prueba t de Student: *, P < 0.05; **, P < 0.01.The resultados se presentan como media ± SEM. CFU-S (E) ensayo con juntas tratadas con fluoxetina mostró que la fluoxetina puede aumentar el número de colonias en el bazo de recipientes adultos irradiados. Barras de escala = 1,5 mm. 1 se utilizó ee. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Es bien sabido que las HSCs maduras en la médula ósea pueden repoblar el sistema sanguíneo de los receptores irradiados. A diferencia de las HSCs funcionales, las HSCs emergentes en la Junta General de embriones de ratón son inmaduras. Resultados trasplante directo demostraron ese tipo I (VE-cad+ CD45– CD41+) y tipo II (VE-cad+ CD45+) pre-HSCs poseen sin reconstitución capacidad20. Aprovechando el sistema de cultivo de explantes AGM, las HSCs nacientes en la región AGM puede reconstituir a los destinatarios en el trasplante ensayo4,20. Además, debido al desarrollo intrauterino del embrión de ratón, en vivo experimentos para rescatar la deteriorada la hematopoyesis en ratones KO son inconvenientes para llevar a cabo. La cultura de explante AGM es un sistema alternativo, que es muy adecuado para los experimentos del rescate, simplemente agregando los productos químicos (factores de crecimiento y citoquinas) en el medio13,15. Además de la Junta General, el saco vitelino y el hígado fetal también pueden ser cultivadas con este sistema7.
Al principio de este experimento, la estricta esterilización de filtros y mallas de acero inoxidable es muy importante para evitar la contaminación. Lo más importante, el paso crítico en la cultura es hacer AGM disecada cultivados en los filtros en la interfase aire-líquido. Demasiado medio hará la Junta General ser cultivadas en el líquido y puede ser descompuesto, mientras que muy poco medio hará la AGM secas. Durante el cultivo, también es importante para evitar la evaporación del medio de mantener la adecuada humedad de la incubadora de la célula.
Otra mejora de este sistema de cultivo para realmente imitar el desarrollo de HSCs en vivo, junto con los avances recientes en el organoide cultura técnicas21de explante, ampliará considerablemente su aplicación en estudios de hematopoyesis, de Diferenciación de auto-renovación, multilineal HSC y la interacción de HSC-nicho para modelado y drogas el descubrimiento de la enfermedad.
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Disclosures
Los autores tienen intereses financieros conflictivos.
Acknowledgments
Agradecemos Suwei Gao ayuda en la preparación de la figura. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la nacional Ciencias naturales Fundación de China (81530004, 31425016) y el Ministerio de ciencia y tecnología de China (2016YFA0100500). J.L. realiza los experimentos y redactó el manuscrito; F.L. había editado el manuscrito. Ambos autores había leído y aprobaron el manuscrito final.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
References
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