Este protocolo describe el uso cultivadas Aorta-gónada-mesonefros para análisis de expresión, unidades formadoras de colonias en la cultura y el bazo y la reconstitución a largo plazo para determinar el efecto de factores reguladores y vías de señalización de vástago de hematopoietic desarrollo de la célula. Esto ha sido demostrado como un sistema eficaz para el estudio de la función y biología de células madre hematopoyéticas.
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Artículo de método
Aplicación de sistema de cultivo de explantes de Aorta-gónada-mesonefros en hematopoyesis del desarrollo
En este artículo
Resumen
Resumen
La limitación del uso de embriones de ratón para los estudios de la hematopoyesis es el mayor inconveniente en operaciones, que es en gran parte debido al desarrollo intrauterino del embrión. Aunque los datos genéticos de ratones knockout (KO) son convincentes, no es realista para generar ratones KO para todos los genes según sea necesario. Además, en vivo rescate experimentos para consolidar los datos obtenidos de ratones KO no es conveniente. Para superar estas limitaciones, se desarrolló la cultura de explante de Aorta-gónada-mesonefros (AGM) como un sistema apropiado para el estudio de desarrollo de células madre hematopoyéticas (HSC). Especialmente para los experimentos de rescate, puede utilizarse para recuperar el deterioro de la hematopoyesis en ratones KO. Mediante la adición de los productos químicos adecuados en el medio, la señalización deteriorada puede ser reactivada o vías regulado de arriba pueden ser inhibidas. Con el uso de este método, muchos experimentos para identificar los reguladores críticos de desarrollo de HSC se puede realizar, incluyendo HSC relacionados con la expresión del gen en ARNm y proteínas, capacidad de formación de Colonia y capacidad de reconstitución. Esta serie de experimentos sería útil en la definición de los mecanismos subyacentes esenciales para el desarrollo de HSC en los mamíferos.
Introducción
Las células madre hematopoyéticas (HSCs) son específicas de tejido las células madre adultas que poseen potencial del multilineage incluyendo eritroide, mieloide y linfocitos así como la capacidad de autorrenovación. Estudios recientes han demostrado que las HSCs más tempranas surgieron una población endotelial especializada, conocida como endotelio hemogenic (él), a través endotelial transición hematopoyético (EHT) en la pared ventral de la aorta dorsal1,2 ,3,4. Una vez formados en la aorta-gónada-mesonefros (AGM) región embrionaria (E) 10....
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Protocolo
todos los procedimientos incluyendo temas animal han sido aprobados por el Comité de examen ético en el Instituto de Zoología de la Academia China de Ciencias, Beijing, China.
1. preparación de material
- esterilizar los 0.65 μm filtros ULTRAVIOLETA rayos producidos bajo la luz ultravioleta ray lámpara sobre la mesa de trabajo limpia durante 4 h y vuelta los filtros después de la marca de 2 h.
Nota: Cuando se trabaja con luz ultravioleta, use protección adecuada. - Esterilizar las mallas de acero inoxidable con el esterilizador de la autoclave a 121 ° C por 30 minutos.
Nota: Se necesita cierta altura de malla....
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Resultados
Una publicación reciente informó de serotonina célula-derivados endotelial promueve la supervivencia de HSCs inhibiendo la vía de favorables-apoptotic en el AGM13. Para confirmar el efecto promoción de la serotonina sobre el desarrollo de la HSC, se incluyó la fluoxetina. Como un inhibidor de la recaptación de serotonina (ISRS), fluoxetina ha demostrado inhibir la reabsorción de la serotonina en los tejidos periféricos16,
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Discusión
Es bien sabido que las HSCs maduras en la médula ósea pueden repoblar el sistema sanguíneo de los receptores irradiados. A diferencia de las HSCs funcionales, las HSCs emergentes en la Junta General de embriones de ratón son inmaduras. Resultados trasplante directo demostraron ese tipo I (VE-cad+ CD45– CD41+) y tipo II (VE-cad+ CD45+) pre-HSCs poseen sin reconstitución capacidad20. Aprovechando el sistema de cultivo de explantes AGM, las HSCs .......
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Divulgaciones
Los autores tienen intereses financieros conflictivos.
Agradecimientos
Agradecemos Suwei Gao ayuda en la preparación de la figura. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la nacional Ciencias naturales Fundación de China (81530004, 31425016) y el Ministerio de ciencia y tecnología de China (2016YFA0100500). J.L. realiza los experimentos y redactó el manuscrito; F.L. había editado el manuscrito. Ambos autores había leído y aprobaron el manuscrito final.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Durapore 0.65 y Micro; m filtros | Millipore | R5BA63787 | AGM cultivo de explantes |
| M5300 medio de cultivo a largo plazo | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM cultivo de explantes |
| Trizol | Tiangen | 5829 | Extracción de ARN |
| M-MLV transcriptasa inversa | Promega | 90694 | transcripción inversa |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | cuantitativo de |
| la proteasa | Roche | 55622 | Extracción de proteínas |
| colagenasa | Sigma | C2674 | digestión de tejidos AGM |
| MethoCult GF M3434 medio | Stem Cell Technologies | 3434 | Ensayo CFU-C |
| ultrabaja placas de 24 pocillos | Costar | 3473 | Ensayo CFU-C |
| Ratones C57BL/6 CD45.2 | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Ensayo CFU-S | |
| C57BL/6 CD45.1 | ratones Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Trasplante a largo plazo | |
| salina tamponada con fosfato | Technologines | Colección 8115284 AGM Solución | |
| de penicilina-estreptomicina | HyClone | SV30010 | AGM cultivo de explantes |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Trasplante a largo plazo |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Lámpara UV de trasplante a largo plazo |
| Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | potencia: 30W | |
| malla de acero inoxidable | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | Diámetro de apertura: 2,5 mm |
| hidrocortisona | Sigma | H0396 | diluida selectivamente en medio M5300 |
Referencias
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Boisset, J. C., Robin, C. Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta. Cell cycle.
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Reimpresiones y permisos
