Summary
Det här protokollet beskriver använder odlade Aorta-Gonad-Mesonephros för uttryck analyser, kolonibildande enheter i kultur och mjälte och långsiktiga beredning för att bestämma effekten av reglerande faktorer och signalvägar på hematopoetiska stamceller cell utveckling. Detta har påvisats som ett effektivt system för att studera hematopoetiska stamcellsbiologi och funktion.
Abstract
Begränsning av använda musembryon för blodbildning studier är extra besväret i verksamheten, vilket till stor del beror på intrauterin utvecklingen av embryot. Även om genetiska data från knockoutmöss (KO) är övertygande, är det inte realistiskt att generera KO möss för alla gener som behövs. Dessutom utför i vivo rescue experiment att konsolidera data från KO möss är inte bekvämt. För att övervinna dessa begränsningar, utvecklades Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) explant kulturen som ett lämpligt system att studera hematopoetiska stamceller (HSC) utveckling. Särskilt för räddning experiment, kan det användas till återvinna den försämrad blodbildningen i KO möss. Genom att lägga till lämpliga kemikalier i mediet, den nedsatt signalering kan återaktiveras eller uppreglerat vägar kan hämmas. Med användning av denna metod, många experiment kan utföras för att identifiera kritiska tillsynsmyndigheterna för HSC utveckling, däribland HSC besläktade genuttryck på mRNA och protein nivåer, koloni bildandet förmåga och beredning kapacitet. Denna serie experiment skulle vara till hjälp i att definiera vilka underliggande mekanismer som är nödvändiga för HSC utveckling hos däggdjur.
Introduction
Hematopoetiska stamceller (Förenta) är vävnadsspecifika adulta stamceller som besitter Multilinjärt potential inklusive erytroid, myeloisk, samt lymfoida celler och förmågan att själv förnya. Nyare studier har visat att de tidigaste Förenta uppstod från en specialiserad endothelial befolkning, känd som hemogenic endotel (han), genom den endothelial hematopoetiska övergång (EHT) på den ventrala väggen av dorsala aorta1,2 ,3,4. När bildades aorta-gonad-mesonephros (AGM) regionen från embryonala (E) 10,5 till E12.5 i mus embryot, kommer att Förenta migrera in i fostrets levern för expansion och slutligen kolonisera benmärgen för att upprätthålla vuxen blodbildning hela individens liv 5 , 6. Trots detta har studerats under många år, de bakomliggande mekanismerna för HSC uppkomst och utveckling förbli ofullständigt förstådda.
Till skillnad från in vitro- befruktning och utveckling av zebrafisk embryon gör intrauterin utveckling av musembryon studien av slutgiltiga blodbildning under embryogenes mycket mer obekväm. Även om genetiska experiment med knockoutmöss (KO) används ofta, begränsar bristen på vissa KO möss också deras användning i forskningsfältet hematopoetiska. I vivo rescue experiment utförs dessutom inte enkelt i KO möss. Sedan 1996 har årsstämman explant kulturen utvecklats för hematopoetiska studier av pionjärerna i fält7. Med hjälp av denna kultur system, har ventrala vävnader i regionen AGM identifierats för att främja HSC aktivitet, medan dorsala vävnader utöva en motsatt effekt8,9. Årsstämman explant kultur systemet har också använts för att fastställa rollerna för Serotonin, Mpl, SCF, BMP och Hedgehog-signalering i HSC utveckling10,11,12,13, 14. viktigast av allt, det är också en populär metod som används för att rädda hematopoetiska defekter i mutant embryon13,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alla förfaranden inklusive animaliska ämnen har godkänts av den etiska Review Committee i Institute of Zoology, kinesiska vetenskapsakademin, Beijing, Kina.
1. material förberedelse
- Sterilize 0,65 µm filter med ultravioletta strålar produceras under ultraviolett stråle lampa på bänken ren för 4 h och vänd filter efter 2 h märket.
Observera: När du arbetar med UV-ljus, bära lämpliga skydd. - Sterilisera rostfritt stål maskorna med autoklav sterilizer vid 121 ° C i 30 minuter.
Obs: En viss höjd av nät av rostfritt stål som behövs för att stödja filtren på gränssnittet luft-vätska och detta kan realiseras med binda på armeringsnät ( figur 1 A). - Späda ut fluoxetin till en slutlig koncentration av 10 µM till den långsiktiga M5300 kultur medium och blanda jämnt.
Obs: En sex-well platta, 2 mL M5300 långsiktiga odlingssubstratet är lämpligt för varje brunn. Hydrokortison på 10 -6 M kan spädas selektivt till medium. - Överför mediet kompletteras med fluoxetin vid 10 µM in sex brunnar eller rätter och sätta steriliserad rostfritt stål maskorna i mediet.
- Tvätta 0,65 µm filter med kokande vatten två gånger i 3 minuter varje gång i glas cell kultur skålen för sterilisering. Efter varje tvätt, sätta filter i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för 2 minuter och placera våta filter på rostfritt maskor stående vid luft-vätska gränssnittet som visas i figur 1 A [Schematisk i stadens].
Obs: Kokande vatten kan genereras med autoklav sterilizer att uppnå aseptik och utrustning ska tas ut ur autoklav sterilizer i tid för att undvika en minskning av temperatur.
2. Årsstämman Explant kultur
- noga skilja Regionkommittén årsstämman från embryon på E10.5 eller E11 med pincett.
- Remsa av uteruses från dräktiga möss med dissekera saxen och separata embryon från uteruses.
- Torka bort den gulesäcken, navelsträng och inälvor från embryo kroppen.
- Ta försiktigt bort den dorsala nerven vävnader och omgivande muskler.
- Cut off vävnader med hjälp av tången på platsen för främre och bakre extremiteterna och separata regionen årsstämman från embryo kroppen. figurerna 1 B-C Visa schematiska och morfologi av dissekerade AGM.
- Explant dissekerade årsstämmorna separat på filtren vid luft-vätska gränssnitt ( figur 1 A) och kultur i 5% CO 2 vid 37 ° C i 2-3 dagar.
Obs: Inte placera dissekerade årsstämman på binda av armeringsnät och kontrollera filtren är gränssnittet luft-vätska under kultur. Utöver årsstämman gulesäcken och fostrets lever kan också vara odlade med detta system 7.
3. Uttryck analyser
- mRNA nivå
- samla odlade årsstämmorna i 1 mL PBS och centrifugera vid 4 ° C, 310 x g för 6 min.
- Efter bort supernatanten, total-RNA utvinns ur insamlade årsstämmorna med en monofasiska lösning av fenol, enligt tillverkaren ' anvisningar.
- Total-RNA (2 µg) är sedan omvänd transkriberas använder M-MLV omvänt transkriptas för att erhålla cDNA som mall. Kvantitativ realtids PCR analyserna utförs med SYBR Green och Gapdh används som internkontroll.
- Proteinnivå
- samla odlade årsstämman som beskrivs ovan i steg 3.1.1.
- Förbereda proteinet från årsstämman odlade med cell lysis bufferten (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl och 0,5% NP-40) innehållande proteashämmare och användning för western blotting för att påvisa proteinnivå som tidigare beskrivs 13.
4. Kolonibildande enheter i kultur (CFU-C) analysen
- efter odling för 2-3 dagar, samla Regionkommittén årsstämman till 1 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och centrifugera vid 4 ° C, 310 x g i 6 minuter och separera med 200 µL kollagenas (0,1% i PBS) på 37 ° C.
Obs: Den tid som behövs för kollagenas att generera enda cell-suspensioner är cirka 20 min. Skaka röret som innehåller årsstämman kan varje 5 minuter påskynda matsmältningen. 200 µL 0,1% kollagenas används för varje årsstämma och 200 µL 10% serum används för att stoppa reaktionen. - Kultur enda cell-suspensioner i M3434 medium i ultra-låg fastsättning 24 brunnar.
Obs: För att undvika kontaminering, Penicillin-Streptomycin lösning kan selektivt läggas till medium. Eftersom det M3434 mediet är trögflytande, en 1.0 cc spruta utan nål används för att blanda celler och medium. - Efter 7 - 10 dagar odling vid 37 ° C i 5% CO 2, antalet för varje typ av kolonier inklusive Burst utgör enhet--erytroid (BFU-E), CFU-granulo-monocyt (CFU-GM) och CFU-granulocyt, erytrocyt, makrofager, megakaryocyt (CFU-GEMM) är framstående baserat på Morfologi och gjorde med ett inverterat Mikroskop ( figur 2 C).
5. In Vivo Transplantation Assay
- kolonibildande enheter-mjälte (CFU-S) assay
- efter 2 - 3 dagar av explant odling, samla årsstämmorna och förbereda enda cell-suspensioner av inkubation med 200 µL kollagenas (0,1% i PBS) för 20 min.
- Utföra dödliga bestrålning (9 Gy röntgenstrålar) av 8 - 10 vecka gamla manliga C57BL/6 möss 4-5 h före cellen injektion.
- Sätta bestrålade musen i en fasthållning att begränsa verksamheten.
- Torka svansen använda en bomullstopp som doppats i 75% alkohol för att främja vasodilatation av venen.
- Som injicera 0,5 embryo motsvarande (ee) eller 1 ee enda cell-suspensioner av årsstämman intravenöst i svansen ven av bestrålade mus med en 1.0 cc spruta.
Obs: Blodkropparna är suspenderade med PBS och 0,5 mL PBS per mottagare är en lämplig volym. En nål av 25 gauge eller 26 mätare storlek används för injektion med en 1.0 cc spruta. Ingen luft kan införas i sprutan. Tryck på injektionsstället med en antiseptisk pinnen att stoppa blödning. - Elva dagar efter transplantation, samla och fixa mjälte av mottagarens möss i Bouin ' s lösning (15 mL 1,22% pikrinsyra mättad vattenlösning, 2 mL 40% metanol och 1 mL ättiksyra) för 1-2 dagar och tvätta med 80% alkohol i ytterligare 1-2 dagar. Räkna de synliga kolonierna i mjälten makroskopiskt och bestämma antalet kolonier per ee.
Obs: Bouin ' s fixativ, lämpliga slitageskydd.
- Långsiktiga transplantation assay
- efter 2-3 dagar explant odling, samla årsstämmorna och förbereda enda cell-suspensioner av inkubation med 200 µL kollagenas (0,1% i PBS) för 20 min.
- Utföra dödliga bestrålning (9 Gy av röntgen) av 8 - 10 vecka gamla manliga C57BL/6 möss 4-5 timmar före cellen injektion.
- Sätta bestrålade musen i en fasthållning att begränsa verksamheten.
- Torka svansen använda en bomullstopp som doppats i 75% alkohol för att främja vasodilatation av venen. < lJag > injicera 0,5 embryo motsvarande (ee) eller 1 ee enkel cell-suspensioner av årsstämman intravenöst i svansen ven av en bestrålade mus med en 1.0 cc spruta. Årsstämman injiceras med en dos på 1 ee per mottagare med 2 × 10 5 benmärgsceller (CD45.1 bakgrund).
Obs: Ingen luft kan införas i sprutan. Tryck på injektionsstället med en antiseptisk pinnen att stoppa blödning. - Fyra månader efter transplantation, samla benmärgen hos mottagaren och använda det för beredning analysen av FACS. Endast mottagare med ≥ 10% givare-derived chimärism anses uppvisa framgångsrika beredning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En ny publikation rapporterade endothelial cell-derived serotonin främjar Förenta överlevnad genom att hämma den pro-apoptotiska vägen i årsstämma13. För att bekräfta att främja effekten av serotonin på HSC utveckling, ingick fluoxetin. Selektiva serotonin återupptaget hämmare (SSRI), har fluoxetin visats hämma serotonin re absorption i perifera vävnader16,17,18. Med årsstämman explant kultur system, effekten av fluoxetin på HSC utveckling undersöktes genom att följa proceduren ovan. Uttryck analyserna visade ökat uttryck av Runx1, som definieras som en pivotala gen för HSC utveckling19, i fluoxetin-behandlade bolagsstämmor på mRNA och protein nivåer, respektive (figur 2A och 2B). Fluoxetin kan också avsevärt öka kolonin bildandet förmåga Förenta årsstämma inklusive BFU-E, CFU-GM och CFU-GEMM (figur 2C och figur 2D). I vivo transplantation resultaten visade dessutom att Förenta i årsstämman behandlades med fluoxetin kan öka antalet mjälte kolonier i bestrålade vuxna mottagare (figur 2E).
Figur 1 . Schematisk framställning av årsstämman struktur och explant kultur system.
(A) flödesschema för att använda den årsstämman explant kultur systemto undersöka effekten av kemikalier på Förenta utveckling. Kort, bolagsstämmor är dissekeras från embryon och odlade på filter på gränssnittet luft-vätska med kemikalier utspätt i M5300 långsiktiga odlingsmedium. 2 - 3 dagar senare, odlade årsstämmorna samlas in och används för att undersöka uttrycket av hematopoetiska relaterade gener, koloni bildandet förmåga och återinsättning kapacitet. Årsstämman, aorta-gonad-mesonephros; CFU-C, kolonibildande enheter i kulturen. CFU-S, kolonibildande enheter-mjälte. ()B) årsstämman struktur visas i diagrammet. En, dorsala aorta; Mig, mesenchyme; G, gonad; M, mesonephros. ()C) morfologi av årsstämman. Årsstämman är skild från den kaudala delen av embryonala kroppen med omgivande mesenkymala celler på E10.5. Skala barer = 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 . Tillämpningen av årsstämman explant kultur-systemet för att identifiera effekten av fluoxetin på HSC utveckling. (A) mRNA nivå av Runx1 i årsstämmorna behandlats med fluoxetin vid 10 µM upptäcktes av kvantitativ realtids-PCR. Student's t -test: **, P < 0,01. Resultaten presenteras som medelvärde ± SEM. (B) Western blotting analys ytterligare bekräftade det ökat uttrycket av Runx1 på proteinnivå i årsstämmorna behandlades med fluoxetin. (C) de representativa bilderna visar morfologi av BFU-E, CFU-GM och CFU-GEMM. Skala barer = 100 µm. (D) CFU-C test visade att fluoxetin behandling kan öka antalet av varje typ av kolonin. Ett embryo motsvarande (ee) användes. Student's t -test: *, P < 0,05; **, P < 0.01.The resultat presenteras som medelvärdet ± SEM. (E) CFU-S assay med årsmöten behandlats med fluoxetin visade att fluoxetin kan öka antalet kolonier i mjälten hos bestrålade vuxna mottagare. Skala barer = 1,5 mm. 1 ee användes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det är väl känt att mogna Förenta i benmärgen kan återbefolka blodsystemet av bestrålade mottagare. Till skillnad från dessa funktionella Förenta är de framväxande Förenta i årsstämma i musembryon omogna. Direkta transplantation resultaten visade den typen jag (VE-cad+ CD45– CD41+) och typ II (VE-cad+ CD45+) pre-Förenta besitter ingen beredning förmåga20. Dra nytta av AGM explant kultur systemet, de begynnande Förenta i regionen årsstämman kan bereda mottagarna i transplantation assay4,20. Dessutom på grund av intrauterin utveckling av mus embryot är in-vivo -experiment för att rädda den försämrad blodbildningen i KO möss obekvämt att utföra. Årsstämman explant kulturen är ett alternativt system, som är väl lämpad för räddning experiment, helt enkelt genom att lägga till kemikalierna (tillväxtfaktorer och cytokiner) till medelstora13,15. Utöver årsstämman kan i gulesäcken och fostrets lever också vara odlade med detta system7.
I början av detta experiment är strikt sterilisering av filter och rostfritt stål maskor ganska viktigt att undvika kontaminering. Viktigare, är den kritiska steget i kulturen att göra årsstämman dissekerade odlade på filtren på gränssnittet luft-vätska. För mycket medium kommer att orsaka årsstämman vara odlade i vätskan och det kan vara skämda, medan för lite medium kommer göra årsstämman torr. Under odling, upprätthålla cell inkubatorn rätt luftfuktighet är också viktigt att förhindra avdunstning av mediet.
Ytterligare förbättring av detta explant kultur system för att verkligen efterlikna utvecklingen av Förenta i vivo, tillsammans med nya framsteg i organoid kultur tekniker21, kommer att kraftigt utöka sin ansökan i blodbildning studier från HSC självförnyelse, multi härstamning differentiering och HSC-nisch interaktion till sjukdom modellering och drug discovery.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga motstridiga ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Suwei Gao för hjälp i figur förberedelse. Detta arbete stöds av bidrag från den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (81530004, 31425016) och ministeriet för vetenskap och teknik i Kina (2016YFA0100500). J.L. utfört experimenten och utarbetat manuskript; F.L. redigerade manuskriptet. Båda författarna läst och godkänt det slutliga manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
References
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Boisset, J. C., Robin, C. Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta. Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).
- Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129, 4891-4899 (2002).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86, 897-906 (1996).
- Peeters, M., et al. Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development. Development. 136, 2613-2621 (2009).
- Taoudi, S., Medvinsky, A. Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta. PNAS. 104, 9399-9403 (2007).
- Crisan, M., et al. BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).
- Durand, C., et al. Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells. PNAS. 104, 20838-20843 (2007).
- Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis. Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).
- Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. 5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival. J Exp Med. 214, 529-545 (2017).
- Souilhol, C., et al. Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells. Nature communications. 7, 10784 (2016).
- Fitch, S. R., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).
- Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes. Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).
- Ortiz, J., Artigas, F. Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine. Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).
- Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine. Life sciences. 15, 471-479 (1974).
- Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter. Nature. 457, 887-891 (2009).
- Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).
- Muthuswamy, S. K. Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead. Development. 144, 963-967 (2017).
