Summary
该协议描述了一个平台, 用于制造可变尺寸的自组装组织环使用定制的 3 d 印刷塑料模具。在 3 d-印刷模中固化了该底片;然后, 琼脂糖被投在固化的中和阴性。细胞被播种到产生的琼脂糖阱中, 它们聚集成组织环。
Abstract
工程组织正在临床上用于组织修复和置换, 并正在开发作为药物筛选和人类疾病模型的工具。自组装组织提供优于脚手架的组织工程, 如增强基质沉积, 强度和功能。然而, 没有在支架内或内的种子细胞制造3D 组织的可用方法很少。以前, 我们开发了一个系统, 以制造自组装组织环的种子细胞, 以非粘性琼脂糖水井。在加工聚碳酸酯模具中首先铸造了烷的阴性, 然后将琼脂糖凝胶在其阴性形成环状细胞播种井。然而, 这种方法的通用性受限于用于加工聚碳酸酯模具的工具的解决。在这里, 我们证明, 3 d-印刷塑料可以作为替代加工聚碳酸酯的制造新的底片。3 d-印刷模具和修订模具设计是更简单的使用, 廉价的生产, 并要求大大减少琼脂糖和每细胞播种良好。我们已经证明, 由此产生的琼脂糖水井可以用来创建自组装的组织环与定制的直径从各种不同的细胞类型。环可以用于机械, 功能, 和组织学分析, 或制造更大和更复杂的管状组织。
Introduction
细胞自组装方法制造组织工程化血管是一种替代脚手架的方法。自组装, 无支架组织可能有更大的细胞密度, 增强基质沉积和强度, 并改善生物学功能相比, 基于脚手架的组织1,2,3,4.然而, 在没有使用外源脚手架支持的情况下, 形成3D 组织是一个挑战。有些方法将单元格层的图层融合在一起, 形成较厚的构造, 尽管此过程可能耗费大量时间, 而且劳动密集型5。或者, 可以将单元格播种到非粘附模具中, 并允许聚合成球体、圆环和其他组织形状6,7,8。
自组装组织环要求较少的细胞, 较短的培养时间和较少的试剂比较大的管状工程组织, 但仍可进行机械测试, 组织学检查, 或用于收缩力和其他功能测试7,9,10,11. 因为它们可以快速制作和易于测试, 组织环是筛选大量的文化参数的理想选择, 并有潜力作为疾病模型11或药物筛选的工具12。此外, 环可以融合成更复杂的组织结构, 如血管或气管7,13, 和环可能更完全融合比其他形状, 如球体14,15。
琼脂糖因其生物相容性、渗透性和非细胞粘接性能而被广泛用作制造自组装组织的模具材料。例如, Norotte et从挤出棒中制造了琼脂糖模具, 这使得对模具形状和所需的专用设备的有限控制达到了15。棕褐色et将海藻酸盐滴作为建筑单位, 制造出各种形状 (金字塔, 方形)16的定制水凝胶模具。然而, 海藻酸盐球体 (300 µm) 的大直径导致了低分辨率的特征。这种低分辨率可能导致不均匀的模具表面, 从而对细胞聚集一致性产生不利影响。或者, 琼脂糖可以被投进聚合物底片, 以创建具有平滑特性和特定尺寸的非粘附模具6,7,17。
我们以前报告了一个系统, 制造自定义环状琼脂糖细胞播种井从一个在碾磨聚碳酸酯模具7,18。琼脂糖被倒进了一个阴性, 允许设置7,18。然后将细胞播种到琼脂糖阱中, 它们聚集在不到24小时的7,18中, 形成自组装的无支架组织环。耐高压, 可多次重复使用, 柔软灵活, 易于去除固化琼脂糖。最初在 Gwyther et中报告此系统时。7中, 从碾磨聚碳酸酯模具 (图 1A) 中浇铸出了其底片。琼脂糖浇铸后, 细胞播种井分别被切出并放入12井板7,18的水井中。最近对设计进行了修改, 使单琼脂糖模产生5环, 适合于6井板的井中, 无需切断单个油井, 减少生产每枚戒指所需的中和琼脂的数量 (图 1B)。使用较小的细胞播种槽宽度, 以减少所需的种子细胞数量, 以实现环形成。尽管有这些变化, 模具的分辨率和定制也被限制在可用的标准立铣刀尺寸上, 而且 micromilling 的成本也很高。此外, 计算机数控 (CNC) 加工可以耗费时间和繁琐, 因为需要在大量使用的定制设备上预留时间, 增加计算机辅助制造 (CAM) 软件来转换计算机辅助设计 (CAD) 文件到可编程刀具路径, 以及在加工过程中聚碳酸酯零件的可靠夹具。
在本研究中, 我们考察了3D 印刷作为数控加工的替代品的使用。3D 印刷广泛用于工程定制植入物, 制造脚手架材料, 并用于直接打印细胞和组织球体15,19,20。我们使用了高分辨率的3D 打印机, 和专门的3D 打印材料, 使我们能够打印一个刚性模具, 光滑, 光泽表面完成 (见材料表)。我们的技术允许制造高可定制, 高分辨率的塑料模具, 可以用于铸造中的底片和琼脂糖井。在图 1中总结了设计迭代。模具设计进一步修改, 在 3 d-印刷模具版本, 包括锥形外墙和中心孔, 以减轻从 3 d-印刷模具和琼脂糖的反胶油的底片去除。这些锥形特征不能用标准加工工艺实现。在这个迭代中, 从井底到模具底部的距离增加了, 从而在柱下形成了一个较厚的琼脂糖基, 以减少在琼脂糖清除过程中出现断柱的风险。模具和环形制造过程在图 2中以示意图的方式显示。
Protocol
1. 准备3维印刷模具
- 在所需尺寸内准备模具的 CAD 绘图。
- 将 CAD 文件发送到高分辨率3D 打印机。选择合适的塑料印刷材料, 有光泽的完成。
- 印刷后, 用洗涤剂和水彻底清洗模具。
2. 压铸底片
- 根据平衡量来测量所需的。对于具有60毫米直径和2毫米井柱的模具, 请使用25克。
- 在 1:10 (w/w) 比的基础上添加硫化剂。
- 用力搅拌, 直到两个组分完全结合。不充分的混合可能导致不完全固化的聚硅烷, 导致一个 "俗气" 的表面。
- 将一张实验室胶带放在3维印刷模具的边界周围, 以便在印刷井上方形成一层基片。
- 将该混合料倒入模具中, 将模具放入真空室, 直至释放所有气泡。
- 治疗 2–4 h 50 摄氏度, 或直到凝固足够的去除。
- 取出实验室胶带, 并仔细提取该底片。
- 在60摄氏度的时候, 将其孵化为额外的1小时 (从 3 d-印刷模具中取出) 以确保模具完全固化。
- 用洗涤剂和水彻底清洗, 去除残留物。不充分的洗涤可能导致不良的圆环形成为第一个用途的反。
3. 制备琼脂糖井
- 在播种细胞前1天准备琼脂糖水井。
- 在 DMEM 和高压釜中制作 2% (w/v) 琼脂糖溶液。
- 吸管4毫升熔融琼脂糖成一个蒸压的甲基硅烷阴性。然后吸管琼脂糖直接进入了其底片的帖子。去除任何气泡与吸管尖端, 因为气泡可能会导致不均匀性在井维度。
- 注: 请勿溢出模具;琼脂糖的顶端表面必须是平的, 因此琼脂糖井将是水平的, 当去除从聚硅烷和安置入6井培养板材。剩余的琼脂糖可以重新蒸压, 并再次使用, 虽然不超过一次。
- 在琼脂糖冷却以后 (大约10分钟为4毫升琼脂糖; 更大的模子可能需要更长的冷却时间), 小心地分离琼脂糖井从用钝钳和转移入一个6井板材的井。
- 在完全培养基中浸泡琼脂糖井, 并在使用前在37摄氏度的孵化器中平衡过夜。
4. 种子组织环
- 培养大鼠主动脉平滑肌细胞21 (RaSMCs) 在 DMEM 含有10% 胎牛血清 (血清), 1% l-谷氨酰胺, 1% 非必需氨基酸, 1% 丙酮酸钠, 1% 青霉素-链霉素, 直到它们达到70% 汇合。
注意: 细胞应该培养在 5% CO2和37°c 在 15 cm 组织培养板材。 - 模具平衡后 (3 节), 准备 RaSMCs 播种。
- 用5毫升的磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS) 冲洗两次盘子。
- 添加3毫升0.25% 胰蛋白酶每15厘米培养皿。把盘子移到一个37摄氏度的 2–3, 或者直到细胞从盘子里抬起。
- 中和胰蛋白酶的同等体积 (每板3毫升) 完全培养基。并用重悬细胞彻底分解成团簇。
- 用台盼蓝染料稀释细胞悬浮1:1 的整除, 用 hemocytometer 计数细胞。
- 离心机细胞悬浮液总体积为5分钟, 在 200 x g 到颗粒细胞。
- 每毫升1000万细胞浓度的并用重悬细胞;这将导致每50µL 50万个细胞。
注意: 不同的细胞类型可能需要不同的细胞浓度。 - 从琼脂糖霉菌中吸取所有培养基。小心把所有介质从单个井中取出, 但不要刺穿水井的底部。
- 吸管50µL 悬浮入每个井。
- 小心添加2毫升新鲜培养基周围的琼脂糖霉菌。小心不要让中溢入琼脂糖的水井。在孵化室过夜 (大约16小时)。
- 夜间孵化后, 从模具外部吸入介质, 并在6井板的每个井中加入4.5 毫升的新鲜培养基, 使模具和环完全浸没。每日更改媒体。
Representative Results
该系统允许简单, 定制的琼脂糖细胞播种井的制作, 使细胞自组装的环形3D 工程组织。3D. 在模具设计中, 比起加工聚碳酸酯, 尺寸受可用刀具尺寸的限制, 使其分辨率和灵活性更高。有了高分辨率的3D 打印机, 可以打印0.254 毫米厚的墙壁, 槽尺寸仅受打印机分辨率的限制 (这些研究的15.2 µm 分辨率)。通常, 不到0.3 毫米的 CNC 端铣刀在商业上是不可用的, 因此不可能创建较小宽度的槽。微铣可以产生较小的功能, 虽然所需的设备可能是昂贵或难以进入许多生物医学研究实验室。槽尺寸和曲率也受立铣刀尖端形状的限制。此外, 有角或锥形墙的功能是不可能的, 小的功能可能会打破在加工过程中。
CAD 图纸可以很容易地修改, 以生产 3 d 印刷模具和可定制尺寸的负面因素。图 3描述了与以前的设计迭代相比, 当前 2 mm 后 3 d 打印模具的尺寸。过程是低廉的;2 mm, 5 环 3 d 打印模具成本44.67 美元至3D 打印, 每部分可用于创建多个的反式底片。到目前为止, 我们已经创造了超过30个从一个单一的 3 d 打印模具底片。每一个负数要求25克的0.11 美元每克 (每一个2.75 美元的%)。根据使用频率的不同, 可以用洗涤剂、蒸压和再用数年的方法清洗每一个。与原始设计18相比, 紧凑型 3 d 打印模具的使用率要低得多, 每 2 mm 组织环 (图 1E) 中的琼脂糖。
平衡琼脂糖阱中的细胞聚集在不到24小时内形成组织环, 其大小取决于琼脂糖阱的尺寸。在这里, 我们证明了自组装大鼠平滑肌细胞环可以在井中制造 2, 4, 或12毫米直径员额 (图 4)。虽然这项研究中的环只培养了3天, 我们以前培养的 hSMC 环长达2周22, hMSC 软骨环长达3周13。如前所述, 环可以作为人体组织的 3D体外模型来进行组织功能的定量评估11和机械强度13,22, 也可以作为模块化的建筑单位, 以生成管状组织构造7,13。从这些细胞类型设计的组织环的细胞播种条件和功能属性在表 1中进行了总结。
图 1: 聚碳酸酯模具设计.最初, 15 井模具被加工成聚碳酸酯 (A)。后来的版本有一个更紧凑的设计 (B), 5 口井设计, 以适应单一的聚碳酸酯模具, 并在一个井的6井板。在这里, 我们修改了这个设计, 以使用 3 d 印刷塑料作为一个更可定制的替代加工聚碳酸酯 (C)。在 (D) 中显示的琼脂糖井是从最初设计的18 (左) 与当前紧凑型设计 (右) 相比的, 它需要大大减少琼脂糖, 不需要人工分离水井。每种设计迭代所需的聚硅烷和琼脂糖数量 (E) 中显示。中心柱直径为2毫米。模子在 (A) 是 6 cm x 12 cm, (B) 有 5 cm 直径, 并且 (C) 有 6 cm 直径。缩放条 (D) = 3 厘米.请单击此处查看此图的更大版本.
图 2: 自组装组织环的制作.一个 3 d 打印模具被用来铸造一个负极, 然后用于铸造琼脂糖水井 (a)。然后将细胞直接播种到琼脂糖阱中, 它们聚集在不到24小时内形成组织环 (B)。(B) 中的虚线显示了井轮廓。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 3 维打印模具 CAD 绘图的横断面视图.显示槽宽度 (A)、槽高度 (B)、中心孔 (C)、总直径 (D)、外唇 (E) 和外墙高度 (F) 的尺寸。外墙 (1)、水井 (2) 的上部部分和中心孔 (3) 呈锥形 (在5°角为1和 3, 45 °为 2), 以提高对其负移除的方便性。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 带有相应的自组装 SMC 和 2 (A)、4 (B) 和 12 (C) 毫米柱径的 CAD 绘图.在 (A) 中, (1) 指示提供方向的凹槽 (2) 表示用于改善灌注的中心孔 (3) 是一个文件号, 它直接印在了该外墙的底片上, (4) 显示了外层壁, 这是锥形的, 以缓解其负移除。琼脂糖井中的刻度条 = 1 厘米.请单击此处查看此图的较大版本.
| 单元格类型 | 每圈种子细胞 | 环形直径 | 文化持续时间 | 执行的功能分析 |
| 大鼠 SMC | 0.5、1或 3 x 106 | 2、4或12毫米 | 3天 | 当前研究;N/A |
| iPSC 派生的 SMC11 | 0.6 x 106 | 2毫米 | 17天 | 收缩力试验、单轴拉伸试验、组织学分析 |
| 人工 SMC22 | 0.4 x 106 | 2毫米 | 2、7或14天 | 单轴拉伸试验、组织学分析 |
| 人类 MSC14 | 0.4 x 106 | 2毫米 | 21天 | 单轴拉伸试验、组织学分析、环形融合和管压缩试验, 分化为软骨组织 |
表 1: 不同细胞类型的环形加工所需的细胞数。
Discussion
在这里, 我们提出了一个通用的方法, 快速制造自组装的组织环, 易于定制的尺寸使用3D 印刷。我们的方法类似于在 Svoronos et al中报告的。6,其中3个 d-印制的蜂窝状和狗骨形蜡模被用来铸造的。然而, 模具已被修改, 以包含几个独特的设计功能。凹槽 (图 4A(1)) 提供了模具的方向, 允许每个圆环分别进行标记和监视。中心孔 (图 4A(2)) 有助于改善介质向油井的扩散。CAD 文件编号直接打印在模具上;因此, 在每个标签上都标有版本号和 post 直径 (图 4A3)。锥形外墙 (图 3(1), 5 °), 在井槽的顶部 (图 3(2), 45 °) 和中央孔 (图 3(3), 5 °), 使从 3 d 打印模具中移除该底片更容易, 琼脂糖井更容易从该底片 (图 4A(2), A (4)) 中删除。
我们通过制作各种直径和细胞类型的自组装环形组织, 包括主要人体平滑肌细胞 (SMCs)18,22, 大鼠主动脉 SMCs7 , 展示了该系统的通用性。,23, 人骨髓间充质干细胞 (hMSCs)13, SMCs 来源于诱导多能干细胞 (iPSCs)11 (表 1)。在目前的工作中, 我们正在评估从其他细胞类型, 如内皮细胞的形成环, 并融合不同大小的软骨环, 用于气管置换的潜在应用。除了完全的细胞衍生结构, 我们也使用这个系统制造环与合并交联明胶微球13,22。在自组装过程中, 微球可以在组织环内加入, 以提供额外的机械强度, 或者用于生长因子的局部传递13,22。
在制作组织环时, 可能需要对不同细胞类型进行细胞数的优化。根据单元格的大小和类型, 最小单元格数可能会有所不同。例如, 从 iPSCs 派生的 hSMCs 为60万个单元格/环11, hMSCs 和主 hSMCs 在40万个单元格/环13、22上播种, 鼠主动脉 SMCs 在50万个单元格/环18上播种。槽尺寸也可能影响圆环形成和圆环形成所需的最小单元数24。对于人类细胞和 3 d-印刷模具的研究, 使用了槽宽2毫米。原来的聚碳酸酯模具的槽宽为3.75 毫米, 需要 75万 hSMCs 形成2毫米细胞环18。随着槽宽的降低, 我们能够将环状形成所需的细胞数量减少 46%, 每环的40万个细胞为25。在表 1中汇总了每环所播种的单元格数量。
在选择3维印刷材料时, 需要考虑许多因素。由于其通常固化在60摄氏度, 3 d-印刷材料必须有足够高的熔化温度, 以避免损害在进行了在进行中。本研究中使用的材料的熔化温度 (一种专有材料, 请参阅材料表) 不可用。然而, 当烘烤60°c 为1小时, 我们观察到的材料开始产生一种气味。因此, 我们决定降低固化温度为50摄氏度, 并增加固化时间, 以烘烤的, 而不损害 3 d-印刷材料。如果模具被修改以形成更大的, 则固化时间的调整可能是必要的。另一种固化期在60摄氏度后, 从 3 d-印刷模具去除, 防止最终的反式树脂的残余俗气, 同时限制了 3 d-印刷模具的温度暴露。请注意, 有些材料抑制了对甲基硅烷的固化, 因此确保所选材料与其兼容。最后, 还必须考虑模具材料的毒性。虽然 3 d 打印模具将不会与细胞直接接触, 有可能在固化过程中, 从模具中的一些残留物可能被转移到基硅烷阴性。我们发现, 非常彻底的洗涤与洗涤剂是足以消除任何残留从该公司的负面。然而, 我们以前观察到, 不充分的洗涤导致了在琼脂糖井的圆环形成不良为最初的少量用途的对此。使用来自其他3维印刷材料的滤液可能需要额外的调查, 以验证洗涤剂是否足以去除霉菌残留物, 包括任何潜在的。定期测试也可能是必要的, 因为它可能的重复加热循环 (即使到50°c) 可能会损坏模具随着时间的推移, 并导致在重复使用后残留增加。到目前为止, 我们已经使用了一个 3 d 打印模具产生超过30个, 已被用于成功地产生组织环的一个。
总体而言, 3D 打印允许更多功能的制造琼脂糖模具比加工的聚碳酸酯。它提供了更高的分辨率比可能与模具, 模具设计不受限制的工具的尺寸可用。这允许更大的自定义, 并增加功能, 如削尖, 可能是不可能的加工。除了圆环6、17之外, 该系统还可用于在其他形状中制作自组装组织。利用环形制作方法, 我们开发了各种细胞类型和大小的组织环, 用于气管组织工程中潜在的应用13, 工程血管7, 血管疾病的建模11。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感激地感谢埃里卡 Stults 博士 (学术研究 & 应用科学家, 信息技术服务) 为她的帮助与3D 印刷, 阿曼达 Zoë Reidinger, 博士, 克里斯 Nycz, 和凯伦, 法医, 为他们对模具设计的投入,凯西 Suqui 和珍妮弗. 曼为他们的协助测试模具设计, 和迈克尔 O ' 柯弗 ' 为他的协助拍摄。 这项工作得到了 NSF IGERT DGE 1144804 (水利部)、nih R15 HL097332 (水利部、TAH)、NSF 拉吴 EEC0754996 (BA)、nih 1R01 EB023907 (水利部) 和 nih R15 HL137197 (水利部) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50040 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| DMEM | Corning Cellgro | 15-017-CV | |
| VeroWhite | StrataSys | RGD835 | |
| 3D printer | StrataSys | Objet 260 Connex | |
| DMEM | Corning Cellgro | 15-017-CV | |
| FBS | Thermo Fisher | 16000069 | |
| L-glutamine | Corning Cellgro | 25-015-CI | |
| Non-essential amino acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
| Sodium pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
| Pen-strep | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| Trypsin | Corning Cellgro | 25-053-CI | |
| Trypan blue | Corning Cellgro | 25-900-CI | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| 6-well plate | Corning | 353046 | |
| WKY 3M-22 rat aortic smooth muscle cells | Provided by T. Wight [ref 21] | N/A |
References
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