Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Isolasjon og dyrking av nevrale Progenitors etterfulgt av Chromatin-Immunoprecipitation av Histone 3 lysin 79 Dimethylation

Published: January 26, 2018 doi: 10.3791/56631
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Institute for Anatomy and Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg

Summary

Vi presenterer en effektiv og reproduserbar metode for å isolere og kultur nevrale stamceller fra embryonale og postnatal hjernevev for chromatin immunoprecipitation (ChIP) av histone 3 lysin 79 dimethylation (H3K79me2) - et histone merke ligger i globular domener av histone 3.

Abstract

Hjernens utvikling er en kompleks prosess, som er kontrollert i en temporo-romlige måte av grader av morphogens og forskjellige transcriptional programmer. I tillegg har epigenetic chromatin modifikasjoner, som histone metylering, en viktig rolle for å etablere og opprettholde bestemt celle skjebne i denne prosessen. Majoriteten av histone metylering oppstår på fleksible histone halen, som er tilgjengelig for histone modifikatorer, viskelær og histone leser proteiner. Derimot H3K79 metylering ligger i globular domenet av histone 3 og er involvert i ulike utviklingsmessige funksjoner. H3K79 metylering er evolutionarily bevart og kan finnes i en rekke arter fra Homo sapiens til Saccharomyces cerevisiae. Endringen skjer i ulike celle populasjoner i organismer, inkludert nevrale progenitors. Plasseringen av H3K79 metylering i globular domenet av histone 3 gjør det vanskelig å vurdere. Her presenterer vi metoder å isolere og kultur kortikale stamfar celler (CPC) fra embryonale kortikale hjernevev (E11.5-E14.5) eller lillehjernen detaljert Nevron progenitors (CGNPs) fra postnatal vev (P5-P7) og effektivt immunoprecipitate H3K79me2 for kvantitative PCR (qPCR) og genom hele sekvensering.

Introduction

De sensoriske, motoriske og kognitive funksjonene hjernen er svært komplekse og utsatt for fysisk og miljømessige endringer. Hjernen består av tre generelle deler i hind-, midt- og forebrain, som er sterkt knyttet. Innen forebrain, kan telencephalon deles inn i en dorsal telencephalon (DT) og en ventrale telencephalon (VT). DT mus består av seks kortikale lag som er dannet mellom E11.5 og E18.5 i en "innsiden ut" måte1. VT inneholder de ganglionic eminences i utvikling, som senere basal ganglia2,3. Flere celletyper kan klassifiseres i pattedyr sentralnervesystemet som nerveceller, astrocyttene eller oligodendrocytes4, som utvikler seg i en temporo-romlige måte5. Først gi nevrale stamceller (NPC) opphav til ulike typer nerveceller, interneurons i VT og projeksjon neurons DT og senere på gliacellene (f.eks, astrocyttene6). Under kortikale utvikling, den mest overfladisk layer (lag jeg), som inneholder Cajal-Retzius celler, er dannet først. Deretter mellom E12.5 og E14.5 generere NPCer dypere neuronal lag (VI, V) mens mellom 14,5 og 16,5, progenitors gir opphav til øvre laget (IV-II) neurons7,8. Neuronal identitet angis ved ulike morphogen-indusert temporo-romlige transcriptional programmer og i tillegg epigenetic programmer2.

Lillehjernen som er involvert i koordinasjon, ligger i hindbrain og utvikler seg mellom E10 og grovt P20 i mus9. Den inneholder lillehjernen cortex og lillehjernen kjerner10. Voksen lillehjernen cortex består av tre lag, det ytterste molekylære laget, Purkinje celle laget og innerste granulat laget som inneholder detaljert neurons10. Lillehjernen granule cellene er de minste nervecellene og omtrent 80% av alle neurons i virveldyr hjernen11. De utvikler fra forløpere lokalisert i sonen for eksterne germinal og overføre gjennom Purkinje celle laget til deres destinasjon12. Som i telencephalon, utviklingen av lillehjernen er regulert av flere viktige morphogens, definert som har bestemte tid og plass-avhengig funksjoner og starte transcriptional programmer10.

Utviklingen av kortikale og lillehjernen lag styres av transcriptional uttrykk for bestemte morphogens, og dermed av chromatin DNA. I en forenklet visning kan chromatin stater deles inn i euchromatin som transcriptionally aktiv og heterochromatin som transcriptionally stille områder. Nucleosome som grunnleggende enhet chromatin inneholder to kopier av hver kjerne histone H2A, H2B H3 og H4, omgitt av 147 base parene DNA13. Histones er svært post-translationally endret av metylering, acetylation, fosforylering, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, deamination og proline isomerization14,15. Histone lysin metylering anses å være den mest stabile histone endringen som styrer transkripsjon, replikering, rekombinasjon16, DNA-skade svar17og genomisk preging18. Lysines kan være mono-, di- eller tri-denaturert19 og vises ikke bare på de tilgjengelige histone haler, men også på globular domenet histones20. Bestemt methylations H3K4 og H3K36 er hovedsakelig knyttet til euchromatin, spesifikke methylations H3K9, H3K27 eller H4K20 finnes hovedsakelig i heterochromatic regioner, selv om alle rester ligger innenfor histone hale14, 19,21. H3K79 metylering ligger histone globular domenet og har blitt assosiert med transcriptional aktivitet, men også med transcriptionally inert genomisk regioner22. Endringen er evolutionarily bevart siden det har blitt observert i gjær, kalv thymus, kylling og menneskelige23. H3K79 mono og di trimethylation (H3K79me1, me2, me3) er katalysert av histone methyltransferases DOT1L24,25 og kjernefysiske angi domenet inneholder Protein 2 (Nsd2)-26. DOT1L er involvert i spredning, DNA-reparasjon og cellular reprograming27. Tap av Dot1l i mus fører til en prenatal død rundt utviklingsstadiet E10.528,29. Under utviklingen av hjertet og myocardiocyte differensiering er DOT1L viktig for gene expression regulering30. I det sentrale nervesystemet, DOT1L funksjon kan være involvert i medfødte utvikling31, er involvert i undertrykke Tbr1-uttrykk under forebrain utvikling32, og kan fungere i regulering av ER-stress svar gener33. Kontekst-avhengige aktivere eller repressing handling av H3K79me, spesielt med i vivo situasjoner som utviklingen av det sentrale nervesystemet, er hittil bare delvis forstått32. Siden H3K79 metylering ligger i globular domenet av histone 3, er det sterically mindre tilgjengelig i forhold til endringer på fleksible histone haler23. For å forstå funksjonen av H3K79 metylering, er pålitelig og reproduserbar metoder for å bestemme plasseringen og genomisk miljø nødvendig. I dette metoder papiret presentere vi isolasjon metoder for forskjellige nevrale progenitors (CPC for cortex) og CGNPs for lillehjernen, effektiv DOT1L hemmer behandling og ChIP metode til å analysere H3K79 metylering via qPCR eller sekvensering på ulike tidspunkt poeng under kortikale og lillehjernen utvikling. En oversikt over protokollen og dens muligheter, se figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyrevelferd komiteer av universitetet i Freiburg og lokale myndigheter godkjent alle dyreforsøk (G12/13, G16/11) nevnt i følgende protokollen.

1. forberedelser

  1. Forberedelser for CPC isolasjon
    1. Sette opp tidsbestemte parring for å få embryoer på ulike stadier av cortex utvikling (mellom E11.5 og E14.5). Bruk mus for belastningen NMRI (Naval Medical Research Institute) som er minst 8 uker gamle. Etter parring, bør du vurdere en positiv vaginal plugg i E0.5.
    2. For å ha nok materiale, kan du bruke ett kull NMRI mus for en H3K79me2 ChIP fra halvdelene av E12.5 eller E14.5. For senere embryonale stadier, bruker ett kull for mer ChIP analyser (gjennomsnittlig søppel størrelse NMRI: 10 embryo).
    3. Nedkjøling Hank´s balansert Salt løsning (HBSS) og fosfat-bufret saltvann (PBS) til 4 ° C (langsiktig lagring på RT).
    4. Equilibrate 4 ° C lagret Trypsin-EDTA (0,05% w/v) til 37 ° C.
    5. Forberede kortikale celle medium (CCM): Supplere mediet for neurons (se Tabell for materiale) med siste konsentrasjoner av 2% (v/v) B-27 supplement, 5 µg/mL Apo-Transferrin, 1 µg/mL glutation, 0,5 mM L-glutamin, 0,8 µg/mL Superoxide dismutase og 1% (v/v) Penicillin Streptomycin Neomycin antibiotika blanding. Lagre den på 4 ° C. For eksperimentet, equilibrate mellomlang til 37 ° C.
    6. Tine fosterets kalv serum (FCS), aliquot det (50 mL hver), og equilibrate en aliquot 37 ° c (langsiktig lagring på 20 ° C).
    7. Forberede aksjer DNAse 1 (10 mg/mL) i H2O cellekultur. Lagre dele på 20 ° C.
    8. Eventuelt oppløse de bestemte DOT1L hemmere EPZ-5676 eller SGC0946 i DMSO å en lager konsentrasjon av 100 mM. Bruke en slutt konsentrasjon av 1-5 µM til cellene på dag 0 og på nytt inhibitor annenhver dag.
    9. Dyrking av CPC coat celle kultur plater (6 vel eller 12 vel) med poly-L-ornithine hydrobromide (1 mg/mL i 150 mM borsyre pH 8.4) minst 1t på RT og etterpå med laminin (1 mg/mL) i CCM medium på 37 ° C over natten.
  2. Forberedelser for CGNP isolasjon
    1. Ordne en passende parring mus å generere P5-P7 dyr for isolering av lillehjernen (3-5 dyr per brikke og tilstand).
    2. Forberede HBSS/glukose ved å legge til 6 mg/mL glukose til HBSS buffer.
    3. Forberede CGNP celle kultur medium (CGM) ved å legge til 1% (v/v) N2 supplement, 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin-Neomycin, 25 mM KCl og 10% FCS DMEM-F12. CGNP dyrking forberede CGM medium uten FCS men inkludert 0,6 µg/mL soniske pinnsvin (SSH) (CGM-SSH) og equilibrate det 37 ° c ved behov.
    4. Coat 6-vel celle kultur plater med 100 µg/mL poly-D-lysin for 1-2 h på RT glia celle fjerning. Etterpå vaske to ganger med sterilt ddH2O og la platene tørr. Lagre platene for maksimal en uke på 4 ° C.
    5. For dyrking av CGNPs pels 6-vel celle kultur plater med poly-L-ornithine (0,1 mg/mL) på 4 ° C over natten. Etterpå vaske to ganger med H2O for cellekultur og la platene tørr.
      Merk: Platene kan lagres i maksimalt én uke på 4 ° C.
    6. Forberede 0.025% trypsin (w/v) i HBSS/glukose og equilibrate det 37 ° c ved behov.
  3. Forberedelsene til ChIP av H3K79me2
    1. Forberede PFA (1% i PBS, pH 8) ferske før crosslinking chromatin. For å forberede PFA varme 50 mL PBS i mikrobølgeovn til maksimum 65 ° C. Legg til 0,5 mg PFA PBS under konstant omrøring. Legg deretter til 50 µL 10 M NaOH og vente til PFA er oppløst. Etterpå legger 42,5 µL HCl (37% v/v) for å få en pH på 8. Kontrollere pH igjen og deretter la 1% PFA løsningen nå RT.
    2. Forberede aksjer av RNase (1 mg/mL) og proteinasen K (20 µg/µL) separat i sterilt ddH2O. lagre dele på 20 ° C.
    3. Følgende buffere og reagenser: PBS inneholder 0,02% mellom, lyseringsbuffer, glysin, fortynning buffer, ChIP-buffer 1, buffer 2 er ChIP, ChIP buffer 3 og TE buffer og lagre dem på 4 ° C. Forberede elueringsbufferen fersk hver gang.
      1. Forberede PBS inneholder 0,02% mellom. Venter på de fleste ukes på 4 ° C.
      2. Forberede lyseringsbuffer med 50 mM Tris på pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% (w/v) natrium dodecyl sulfate (SDS) og 1 x Protease inhibitor.
      3. Forberede 2.5 M glysin.
      4. Forberede fortynning buffer med 20 mM Tris ved pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, 0,25% (w/v) SDS og 1 x Protease inhibitor.
      5. Forberede ChIP-buffer 1 bruker 20 mM Tris ved pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100 og 0,2% (w/v) SDS.
      6. Forberede ChIP buffer 2 bruke 20 mM Tris pH 8.0, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100 og 0,2% (w/v) SDS.
      7. Forberede ChIP buffer 3 bruker 20 mM Tris pH 8.0, 250 mM LiCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) NP-40 og 1% (w/v) SDS.
      8. Forberede TE buffer med 20 mM Tris pH 8.0 og 2 mM EDTA.
      9. Forberede fersk elueringsbufferen som inneholder 1% (w/v) SDS, 100 mM NaHCO3.

2. nevrale isolering av hjernevevet

  1. Isolasjon og valgfrie dyrking av CPC
    1. Avlive gravid dyrene av cervical forvridning og overføre embryoene til iskalde HBSS.
    2. Fjern skallen med saks og isolere hjernen, deretter fjerne meninges, eventuelt med liten tang og isolere halvdelene (hele, DT eller VT) av begge halvkuler ved å fjerne alle andre hjernen deler innenfor kikkert med liten tang og hvis nødvendig, liten saks. Lagre de isolerte halvdelene i 5 mL HBSS buffer ved 4 ° C i en 15 mL tube.
    3. Sentrifuge isolert hjernen materiale for 5 min på 1000 x g og 4 ° C.
    4. Vask halvdelene med 5 mL iskalde HBSS og homogenize dem med 1 mL pipette tips av pipettering opp og ned. Eventuelt kutte spissen av pipette spissen.
    5. Sentrifuge homogenisert utvalget for 5 min på 1000 x g og 4 ° C. Fjerne HBSS.
    6. Legge 3 mL Trypsin og Inkuber utvalget for 5 min på 37 ° C.
    7. Legg 1 mL FCS, 5 mL CCM og 30 µL DNase 1 til prøven og homogenize prøven med en 5 mL glass pipette av pipettering forsiktig opp og ned.
    8. Sentrifuge isolert celler for 5 min på 1000 x g og 4 ° C. Forkaste nedbryting, legge til 5 mL CCM og homogenize prøven igjen.
    9. Fortynne en aliquot av prøven, og regne med en Neubauer telling-kammer. En gjennomsnittlig mengde 4.5 x 106 celler per embryoet forventes. Fortsett med trinn 2.1.10 for dyrking av de isolerte CPC. For ChIP, gå rett til trinn 3.
    10. Dyrking av plate CPC på poly-L-ornithine (0,1 mg/mL) og laminin (1 mg/mL) belagt retter på en tetthet mellom 8 x 104 og 2.5 x 105 celler/cm2 CCM medium og ruge dem på 37 ° C, 5% CO2og 100% relativ fuktighet.
    11. Ettersom CPC begynner å skille ut nerveceller i cellekultur (etter ca 4 dager), vurdere disseksjon datoen som dagen i vitro 0 (dag 0). For lengre vilkårene i dyrking, endre halvparten av mediet hver fjerde dag med friske CCM medium.
    12. Bruk 1-5 µM SGC0946 eller EPZ5676 oppløst i DMSO på dag 0 (4-5 h etter cellen aisolering) og oppdatere den hver andre dag. Bruk DMSO som kontroll behandling. Teste effektiviteten av hemmer behandling via standard immunoblot metoder, hvis nødvendig.
  2. Isolasjon og valgfrie dyrking av CGNPs
    1. Euthanize P5-7 dyr ved halshogging med saks. Fjerne hodebunnen hud, åpne skallen og fjern hjernen med liten saks og tang. Isolere lillehjernen og overføre den til iskalde HBSS/glukose. Fjern alle meninges og blodkar og overføre cerebella til 15 mL rør fylt med kaldt HBSS/glukose.
    2. Vask cerebella tre ganger med 10 mL iskalde HBSS/glukose (samle dem med sentrifugering 650 x g i 5 min på 4 ° C) og homogenize cerebella deretter av pipettering forsiktig opp og ned med en 1 mL pipette (maksimum 2 - 3 ganger) å få 0,5-1 mm3 fragmenter.
    3. Legge til 5 mL av 0.025% trypsin i HBSS/glukose og ruge vevet under konstant omrøring i et vannbad 37 ° C i 15 min. stopp fordøyelsen ved legge 5 mL av CGM og samle vev med sentrifugering 650 x g i 5 min på 4 ° C.
    4. Fjerne nedbryting og triturate vev med 1 mL Pipetter tips i 1 mL CGM og overføre den til en ny 15 mL tube.
      Merk: Det er viktig å unngå luftbobler.
      1. Legg til 5 mL CGM og ruge blandingen i 2 minutter på is å avgjøre vev restene. Overføre nedbryting til en ny 15 mL tube. Legg 2 mL CGM til gjenværende vev og gjenta føden.
    5. Pool supernatants (uten vev rester, ca 10 mL totalt) og sentrifuge 650 x g i 5 min på 4 ° C å samle lillehjernen cellene. Resuspend pellet i 10 mL CGM.
    6. Siden astrocyttene følge raskere og sterkere poly-D-lysine enn CGNPs, plate cellene i 100 µg/mL poly-D-lysine belagt 6-vel-plater (opptil 4 mL per brønn) og Inkuber etter 20 min på 37 ° C fjerne astrocyttene.
    7. Riste platen og samle nedbryting. Deretter sentrifuge 650 x g i 5 min på 4 ° C i en 15 mL tube. Resuspend pellet i 10 mL CGM og telle celler med en Neubauer telling kammer.
      Merk: CGNPs er runde, små, og viser en glorie når avbildes bruker fase kontrast mikroskopi.
    8. Hvis nødvendig, frø cellene i 37 ° C før varmet CGM på poly-L-ornithine-belagt plater (3 x 106 celler per 6-brønn) og ruge dem på 37 ° C, 5% CO2 og 100% relativ fuktighet.
      Merk: Hvis det ikke utføres seeding, fortsette til trinn 3.1.
      1. Etter 6-12 h, utveksle mellomlang til CGM-HYSJ. Behandle isolert CGNPs 6 h (eller når du endrer til CGM-HYSJ) etter isolasjon med DOT1L-hemmer og DMSO kontroll og fornye den hver andre dag (Sammenlign med 2.1.12). Teste effektiviteten av hemmer behandling via standard immunoblot metoder hvis nødvendig. For ChIP, fortsetter du med trinn 3.3.
        Merk: Forlate CGM på plater (og med det FBS) vil resultere i differensiering av CGNPs i lillehjernen detaljert neurons (CGNs).

3. fiksering av celler og klippe av Chromatin

Merk: Hvis cellene ikke er kultivert, utfører du trinn 3.1 og 3.2, hvis de videre til trinn 3.3.

  1. Samle cellene med sentrifugering for 4 min 1000 x g og legge til 1,3 mL PBS. Overføre prøven til en 1,5 mL tube. Sentrifuge for 4 min 1000 x g på 4° C. Vask prøven to ganger med 1,3 mL PBS.
  2. Viktige trinn: Legge til 350 µL 1% PFA til prøven og Inkuber det etter 5 min på 22 ° C. For å stoppe reaksjonen, legge til 18,4 µL glysin 1 mL PBS. Sentrifuge utvalget for 5 min på 1000 x g på 4 ° C.
    1. Vask prøven to ganger med iskald PBS. Samle fast cellene med sentrifugering for 5 min på 1000 x g og 4 ° C. Holde prøvene på is fra nå av.
      Merk: Fiksering tiden må være nøyaktig 5 min å få optimale resultater. Ulike celle tall kan kreve tid tilpasninger.
  3. Viktige trinn: Kultivert CGNPs (eller CPC), legge til opptil 1 mL 1% PFA direkte til celle kultur plate brønnene. Etter en 5 min incubation på 22 ° C, legge til en passende mengde glysin og PBS og høste celler med en celle skraper.
    1. Overføre cellene til 1,5 mL rør og sentrifuge utvalget for 5 min på 1000 x g og 4 ° C. Vask prøven to ganger med iskald PBS. Samle fast cellene med sentrifugering for 5 minat 1000 x g på 4 ° C. Holde prøvene på is fra nå av.
  4. Viktige trinn: Legge til 700 µL av lyseringsbuffer (+ protease hemmer) og ruge prøven i 15 min på 4 ° C. Vortex prøven hver 5 min. skråstille chromatin lysed cellene 3 x 10 minutter i sonicator (30 s puls, 30 s pause) ved maksimal kraft.
    1. Kontroller at volumet ikke overstiger 350 µL per rør. Vortex prøvene hvert 10 min. Sjekk lysate for gjenværende kjerner med kontrast mikroskop.
      Merk: Det er viktig å få optimale klipping resultater (sammenligne med figur 1B) for senere analyse. Ved å bruke andre metoder for fjerning av chromatin, kan du optimalisere klippe chromatin fragmenter størrelse mellom 200-500 bp.
  5. Pellets celle restene for 10 min, 13 000 x g, 4 ° C. Bruk nedbryting for preclearing trinn 5.2. Fryse prøven på 20 ° C for senere bruk, om nødvendig.

4. forberedelse av perler og Preclearing

  1. Vask 45 µL protein A magnetiske perler/ChIP og 20 µL magnetiske perler/prøve med 1 mL iskald PBS inneholder 0,02% mellom tre ganger med en magnetisk stand. Deretter legge til 1 mL av iskalde PBS perler.
  2. 1 mL iskald PBS og 45 µL perler/ChIP, legge 3 µg antistoff/chip (H3K79me2 eller kanin IgG). Inkuber prøvene for 2t 4 ° c på et rotator binde antistoffer til perler. Avhengig av antistoffer, bruke ~ 3 µg antistoff/ChIP.
  3. Vask antistoff-bundet-perler tre ganger med 1 mL iskald PBS inneholder 0,02% mellom. Legge til passende perle volumet (fra volumet av magnetiske perler brukt) av iskalde PBS vasket antistoff-sammen-perler.
  4. Legge til 600 µL fortynning bufferen og 20 µL av vasket magnetiske perler til utvalget for preclearing (totalt volum 1,320 µL) og ruge for 2t 4 ° c på et rotator. Fjerne perler med en magnetisk stand. Ta 5% (33 µL) av lysates som innspill prøvene og fryse dem på 20 ° C.

5. chromatin Immunoprecipitation

  1. Dele precleared ekstrakt i to rør (ca 643.5 µL), legge til samme volum fortynning buffer og antistoff-bundet-perler (45 µL/prøve; H3K79me2 eller kanin IgG). Inkuber prøvene på 4 ° C over natten på et rotator.
  2. Vask perler med iskald buffer 1 er ChIP, ChIP-buffer 2 og ChIP bufferen 3 for 10 min hver på 4 ° C på et rotator. Senere vaskes tre ganger med TE bufferen for 5 min på 4 ° C på et rotator.
  3. Elute perler med elueringsbufferen 1t 1400 RPM i en shaker ved romtemperatur.
  4. Legge til 10 µg RNase (1 mg/mL) per ChIP prøve og 5 µg innspill prøvene og ruge prøvene i 30 min på 37 ° C (1400 rpm).
  5. Legge til 100 µg proteinasen K (20 µg/µL) per ChIP utvalg og 50 µg per inngang og ruge over natten ved 65 ° C på 1400 rpm.

6. rensing av ChIP prøver

  1. Renser ChIP og innspill prøvene med en DNA-rensing kit (se Tabell for materiale) i henhold til veiledningen. Bruk rensing kolonner når mer enn 5 µg DNA forventes. Elute prøven med 2 x 15 µL av DNA elueringsbufferen i settet.
  2. Utføre kvantifisering av prøvene (bruk 1 µL) ved hjelp av en visualizing fluorophore og en fluorospectrometer (se Tabell for materiale).

7. analyse av ChIP prøver via qPCR

  1. For primer design for qPCR analyse, kan du hente genomisk sekvenser av interesse fra integrerende Genomics seer (IGV) nettleser34. Utforme primere rundt transcriptional startwebstedet (TSS) med et siden H3K79me2 sannsynligvis vil bli plassert der. Som en kontroll, vurdere ikke-koding genomisk regionene eller områdene rundt 10 Kb oppstrøms av TSS eller 10 Kb nedstrøms av transcriptional slutten nettsted (TES).
    1. Generere primerne med https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ bruker en produktet størrelse mellom 70 og 200 bp og en optimal temperatur forhåndsinnstilte 60 ° c. For prøveformål, bruke grunning for regionene genomisk, Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, og Npm1 oppført i tabell 1.
  2. Teste nydesignede primere med følgende qPCR programmet, master mix og en annealing temperaturgradient mellom 58 ° C og 63 ° C, og velg den annealing temperaturen med høyeste produktet kvantitet og kvalitet.
    1. Bruke DNA gel geleelektroforese for å kontrollere størrelsen på forventet produktet. QPCR analyse, bruke en Real-Time PCR Detection System (se Tabell for materiale).
    2. Klargjør master blandingen 10 µL DNA polymerase master mix, 0,5 µL primer frem (10 µM), 0,5 µL primer omvendt (10 µM), 4 µL nuclease-fritt vann og 5 µL DNA (1 ng/µL).
    3. Bruk en 2-trinns qPCR program som følger: 5 min på 95 ° C, 50 x (30 s på 95 ° C, 30 s 58 ° C - 63 ° c), og denaturering gradient stadig i 4 ° C.
  3. Opprette en fortynning rekke genomisk, renset og skåret DNA-prøver (2 ng/µL, 1 ng/µL, 0,5 ng/µL, 0,25 ng/µL og 0.125 ng/µL) og bruke 5 µL for en effektivitet test med qPCR. Fastslå skråningen av standardkurve og beregne primer effektiviteten av følgende formel:
    Effektivitet (%) = (10^(-1/slope)-1) * 100.
    1. Bruke primere med effektivitet mellom 90% og 105% i en ideell sak eller på minst med effektivitet mellom 85% og 115%.
  4. Analysere ChIP og innspill prøvene, bruke 0.1-1 ng ChIP DNA blandet med respektive fremover og bakover grunning, nuclease-fritt vann og DNA polymerase master bland i et endelig antall 20 µL for hver qPCR reaksjon.
  5. Bestemme terskelen syklus (Ct) verdier av ChIP og innspill prøvene og normalisere prøven Ct Ct verdier inngang til å beregne berikelse (% inngang) med følgende formel. Bruk Ct verdier Hentet fra IgG kontroll for å fastslå hvilket bakgrunn.
    % input = 100-2^(norm. input − normen. ChIP)
    normen. input = Ct (inngang) − Logg2(fortynningsfaktoren)
    normen. ChIP = Ct (ChIP) − Logg2(fortynningsfaktoren)
    Merk: normen. = normalisert

8. analyse av ChIP prøver via sekvensering

  1. Overføre ChIP prøvene (inngang og immunoprecipitated DNA eksempel) til et sekvensering.
  2. For å forberede et bibliotek på forhånd, bruk en passende biblioteket kit (se Tabell for materiale) og konvertere 2 ng av input DNA og alt av immunoprecipitated DNA i indekserte biblioteker for neste generasjon multiplex sekvensering på den angitt plattform (se Tabell for materiale).
  3. Viktige trinn: Etter kit instruksjonene, ligate sekvensering adaptere (med en arbeider konsentrasjon av 15 µM) for å avslutte reparert og dA-tailed DNA fragmenter. Sekvensering adaptere og PCR bruke primere riktige oligos (se Tabell for materiale). For denne mengden inn DNA, bruk 6-9 PCR sykluser for å berike adapter samskrevet DNA fragmenter.
    Merk: Normalt, det er ikke nødvendig å utføre en størrelse utvalg av adapter samskrevet DNA. Det er best å bruke så få PCR sykluser som mulig, siden mange PCR forsterkning sykluser resultatet i PCR duplikater og en høy GC skjevhet.
  4. For en siste biblioteket sjekk, ta 0,5 µL av totale reaksjonen for analyse å visualisere størrelsesDistribusjon på en passende enhet (se Tabell for materiale). For kvantifisering, bruk en visualizing fargestoff i kombinasjon med en fluorospectrometer eller andre metoder (se Tabell for materiale).
  5. Siden H3K79me2 synes å være en histone endring, som er bredt spredt over større genomisk regioner, sekvens prøver sammen-slutten med Les lengde på 50 bp og med en sekvensering dybde av 75 Mio.
  6. Analysere ChIP-seq data med Galaxy/Uni Freiburg serveren (galaxy.uni-freiburg.de).
  7. Utføre kvalitetskontroll med innhentet ChIPseq med FastQC, og eventuelt tilordne dem direkte med Bowtie2 versjon 2.2.035 med eller uten beskjæring. Som referanse genomet montering bruke mm9 eller den nyeste versjonen mm10; og som referanse merknad Ensembl FTP slipp 79.
  8. Valgfritt: Les Fjern duplikater bruker Picard MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard) før toppen ringer.
  9. Kall topper med MACS2 versjon 2.1.036 alternativet 'bred' for H3K79me2.
  10. For å få logge2 forholdet mellom ChIP og input eksempel Logg2 antall leser i lyder forholdet av begge prøver bruk BamCoverage og BamCompare.
  11. For alle andre ChIP-seq bestemt dybdeanalyse, gjelde deepTools2 versjon 2.3.5 eller 2.4.137, i.e. å generere dekning spor filer (bamCoverage for ChIP, bamCompare for sammenligning av ChIP til inngangen), for å beregne ChIP ytelse bruker plotFingerprint og for å generere en generell oversikt bruker computeMatrix, plotHeatmap. Velg K-betyr clustering under computeMatrix prosessen for klynge genomisk områder etter den H3K79me2 fordelingen.
  12. Bruk publiserte ChIP-seq data som H3K79me2 av E14.5 DT deponert på NCBI for prøveformål (tiltredelse nummer: SRP057733).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Generelle ordningen av nevrale isolasjon, dyrking, H3K79me2 ChIP og ChIP analyseteknologi: Figur 1 viser et flytskjema for å utføre H3K79me2 ChIP kortikale progenitor celler på ulike tidspunkt under embryonale hjernens utvikling eller lillehjernen detaljert Nevron progenitors i postnatal stadier. Som et første skritt, hjernen isoleres og telencephalon (mellom E11.5 og E14.5) eller lillehjernen (P5-P7) hentes. Det er mulig å analysere de ulike regionene i telencephalon deles inn i DT og VT. Etterpå vevet vil være homogenisert og det nevrale progenitors segregert. Nå er det mulig å kultur stamfar celler og behandle dem med DOT1L hemmere. En annen mulighet er å fikse progenitors direkte og gitt dem til ChIP prosedyren. For ChIP, chromatin skåret i fragmenter av 200-500 bp og ruges senere med magnetiske perler-koblede antistoff mot H3K79me2. Etter vask perler og hente DNA, kan utfelt DNA analyseres av sekvenser eller qPCR (figur 1A). Det er viktig å ha en god størrelsesDistribusjon av chromatin fragmenter etter klipping, så det er tilrådelig å kontrollere fragment størrelsen med DNA gel geleelektroforese eller andre metoder (eksempler i figur 1B). Når du velger genomet hele sekvensering, leveres ChIP-seq-leser for H3K79me2 bruk som en fastq-fil for videre analyse (figur 1 c). Kvaliteten på sekvensering leser må vurderes ved FastQC, og eventuelt fastq-filene kan trimmes ved hjelp av TrimGalore. Tilordning til Mus musculus genomet mm9 eller mm10 kan utføres med Bowtie2 og styres via PlotFingerprint. Det er lurt å fjerne duplikater med MarkDuplicates og normalisere lest av BamCoverage og sammenligne ChIP å input prøver med BamCompare. ChIP-seq-leser kan senere bli visualisert genomet bredt i heatmaps eller gene-wise i integrerende Genomics seer (IGV) leserøkter.

CPC kultur og DOT1L hemming: CPC ble isolert og behandlet med 5 µM DOT1L hemmer SGC0946 på 0 og dagen 2. Løsemiddel DMSO ble brukt som en kontroll. På dag 3, CPC ble høstet, proteiner ble isolert, kvantifisert og analysert via immunoblot (figur 2A). Figur 2A viser at H3K79me2 nivåer er effektivt redusert etter tre dager med CPC dyrking og DOT1L hemming sikrer en effektiv hemmer behandlingsopplegg. Protein mengden H3, GAPDH eller Tubulin-Alfa som lasting kontroller var dermed ikke svekket. Immunostaining av faste CPC med antistoffer mot aktive caspase 3 (CASP3 +) for å oppdage apoptose og høgskolen/D for å visualisere neuronal celler angitt som behandling av CPC med DOT1L hemmer førte til økt celledød etter tre dager i kultur, som vist i figur 2B. Kvantifisering av cellene som er CASP3 / DAPI + eller høgskolen/D + DAPI + i CPC kultur avslørt en betydelig økning av CASP3 + celler avsløre programmert celledød ved DOT1L hemming. Antall høgskolen/D-positiv nevroner, derimot, forble uendret (figur 2C).

H3K79me2 ChIP-qPCR Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, og Npm1 fra CPC behandlet med DOT1L hemmer: å teste om SGC0946 hemmer behandling av DOT1L var effektiv og ledet til en reduksjon i H3K79me2 på spesifikke gener, vi utført en ChIP analyse fulgt av qPCR av CPC behandlet for 3 dager. Kanin IgG ble brukt som en ChIP. Siden det er kjent at H3K79me2 ligger på endoplasmatic stress-responsive gener Aft4, Ddit3, Scd1, og Aft3 samt på kjernefysiske transport genet Npm133,38, brukte vi qPCR primere dekker TSS, TES og genomisk regioner i gene meldingsteksten for å fastslå forskjellene i H3K79me2 fordeling etter DOT1L hemming (figur 3A). Gener med høy H3K79me2 reduksjon i utgangspunktet som Atf4, Ddit3, og Npm1 var mest responsive til hemmer behandling slik at tre dager med hemming av DOT1L førte til en betydelig av H3K79me2. Gener med en lavere H3K79me2 dekning, som Atf3 og Scd1, viste ingen betydelig endring i H3K79me2 nivåer.

Oversikt av H3K79me2 ChIP-seq analyse: Genomet hele analyse av H3K79me2 i CPC fra E14.5, utført og analysert i henhold til presentert ordninger og protokoller (figur 1), viste en meget høy kvalitet ChIP. Mens binned teller, sortert etter frekvensen i input lyder i fingeravtrykk blot (figur 4A), var jevnt fordelt, H3K79me2 teller viste berikelse ved bestemte regioner (skuffer rangert 1), som viser vellykket Oppsamling av chromatin fragmenter endres H3K79. En heatmap av H3K79me2 langs gener mellom deres TSS og deres TES og +/-10Kb oppstrømshastighet eller nedstrøms viser (figur 4B) som H3K79me2 topper rundt TSS og redusert mot TES generelt. Det er gener som er helt dekket med H3K79me2, og gener som har en topp bare innenfor regionen TSS. Endoplasmatic-stress relatert gener som Atf4, Ddit3, og nucleophosmin Npm1 havnen, for eksempel H3K79me2 høy på TSS, som er bare litt ned langs hele genet kroppen (figur 4C). I kontrast, har Scd1 en lav H3K79me2 belegg på TSS og ingen H3K79me2 i genet kroppen. Atf3 som et siste eksempel har forskjellige skarpe og lavt nivå H3K79me2 topper langs genet kroppen.

Figure 1
Figur 1: ordningen med H3K79me2 ChIP-protokollen fra isolert CPC eller CGNPs og flytskjema sekvensering analyse. (A) oversikt over presentert protokollen. CPC isolering, første E14.5 hjernen blir isolert og halvdelene kan deles inn i DT og VT, hvis nødvendig. For CGNPs har cerebelli fra P5-P7 mus. Vev blir homogenisert, progenitors segregert, og deretter cellene kan kultivert og behandlet med en passende inhibitor eller direkte brukes for brikken. For ChIP følges fiksering av chromatin av skjæring og immunoprecipitation med en anti-H3K79me2 antistoffer og kanin IgG som kontroll. Etter rensing DNA ChIP prøver kan analyseres via biblioteket forberedelse og sekvenser eller kan analyseres via qPCR. (B) eksempler på passende og upassende kvalitet chromatin. DNA fragment fordelingen vises i bp. (C) ChIP-seq resultater kan utsettes for en analyse rørledningen på Freiburg/Galaxy serveren. Etter en kvalitet kontroll (FastQC), kan leser være trimmet med TrimGalore og deretter tilordnes via Bowtie2 musen genomet (i presentert tilfeller mm9). PlotFingerprint vurderer ChIP. Definere topper for H3K79me2, kan MACSpeaks brukes. Normalisering BamCoverage og sammenligning med input BamCompare kan brukes. For å visualisere resultatene IGV passer nettleser og heatmaps. Forventet filformater er kursiv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: kortikale stamfar kultur og DOT1L hemming. (A) Immunoblots viser H3K79me2 nivåer i CPC på E14.5 etter DOT1L hemming for 3 dager (dag 3, n = 3-11) i forhold til kontrollen DMSO. H3, GAPDH og Tubulin alfa ble brukt som lasting kontroller. (B) Immunocytological farging av en CPC kultur dager 2 og 3. Aktivert Caspase 3 (CASP3 grønn)-positive celler og neurons (høgskolen/D: rød) var farget. DAPI (blå) ble brukt til å visualisere celle kjerner. Skala bar: 100 µm. (C) kvantifisering av immunostainings presentert i (B). Forholdet mellom positive celler for CASP3 + DAPI + eller høgskolen/D + DAPI + i prosent er gitt. For statistisk analyse, ble kort Student t-tester utført. p < 0,01 **. Dette tallet ble endret fra Roidl et al. 33 , 38 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: H3K79me2 ChIP-qPCR Aft4, Ddit3, Aft3, Scd1, og Npm1 fra CPC behandlet med DOT1L hemmer. (A) E14.5-avledet CPC ble behandlet med 5 µM DOT1L hemmer 4-5 h etter isolasjon og for andre gang på dag 2 i kultur. CPC var fast på dag 3, som ble etterfulgt av chromatin utvinning, ChIP eksperiment og qPCR. Resultater vises som de mener (+/-SEM) % inngang (n = 3). IgG ble brukt som en negativ kontroll. Gjennomsnittet av IgG nivået er avbildet som stiplet linje. For statistisk analyse, ble toveis VARIANSANALYSE brukt. p < 005 *; p < 0,01 **, p < 0,001 ***; TSS transcriptional start nettsted, TES transcriptional slutten. Dette tallet ble endret fra Roidl et al. 33 , 38 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: oversikt over H3K79me2 ChIP-seq analyse. (A) fingeravtrykk av H3K79me2 ChIP-seq fra E14.5-avledet CPC forhold til input viser en berikelse av DNA fragmenter for H3K79me2 å sikre en høy ChIP-seq-kvalitet. (B) H3K79me2 ChIP-seq resultater plottet i en heatmap. Sterkt beriket genomisk regioner presenteres i blått. Skalering 0 (mørk rød) - 45 (mørk blå). H3K79me2 topper nær TSS og reduksjoner i 3´ retning til TES. (C) H3K79me2 ChIP-seq leser ble tilordnet mm9 genomet og visualisert med integrerende genomet viewer (IGV). H3K79me2 innholdet av et gen vises som log2 antall leser forholdet mellom ChIP og input leser per kilobase per million (skalering: -10-10). Refseq gene struktur representeres mens en rød boks angir den første ekson inkludert TSS. Genene Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, og Npm1 vises. For sammenligning vises et H3K4me3 signal i samme genomisk regionen. TSS transcriptional start nettsted, TES transcriptional slutten. Dette tallet ble endret fra Roidl38. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Gene Regionen Primer frem 5 - 3' Primer reversere 5 - 3'
Aft4 TSS GGACGATCTCTAACGCCACA GCCCTAAACCCGCCCTTTAT
Aft4 TSS + 1500 CTCCCGAATATGACATGAACCG TCCATTCGAAACAGAGCATCG
Aft4 TES CCGTAATAGGGTAGTCAGGTGC AAAGAATGACACTGAAAACCCACA
Ddit3 TSS GTACTGGCTCCGTCTAACCC CAAGAGAGGGCCTGTAAGCA
Ddit3 TSS + 2500 TCAAGCAGCCGGTCTCATAG CTCAGATCCCCCAATGGCTT
Ddit3 TSS + 4500 GAGCTGGAAGCCTGGTATGA TCACCTCTTCGTTTCCTGGG
Ddit3 TES CACCAAGCATGAACAGTGGG GTACCGTCTATGTGCAAGCC
Aft3 TSS AACTGAGAGCGCAACTCCTC GCTGCCGTTCTTAGCTGGTA
Aft3 TES CTGTTGGCACAAAGTGGCTC GGGATCTGCCATGGTGGAAA
Scd1 TSS TAGTGACCACACACAAAAGCTC CCCAAGTGTAATTTGGATGATTTCC
Npm1 TSS TCCCCCTCCAGTCAGTTACC CGTCCTTTCCTTGGCGTGA
Npm1 TES AGGGACATACTTAAGACAAGCCAG AGGATTGAGGCAGACTGTCAAT
TSS: Transcriptional startwebstedet
TES: Transcriptional slutten nettsted

Tabell 1: Liste over primere brukt for ChIP-qPCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er to store måter å utføre chromatin immunoprecipitation for å oppdage genomisk belegget av histone modifikasjoner, transkripsjonsfaktorer, histone koden lesere, forfattere eller viskelær. En er innfødt ChIP metoden bruker nuclease fordøyd, opprinnelige chromatin for immunoprecipitation, og den andre er presentert metoden bruker PFA-fast, skråstilte chromatin, der nucleosomes og andre DNA-vedlagt proteiner er covalently bundet til DNA 39. native brikke med sin høye antistoff oppdagelsen rate bør gjelde for histone metylering siden chromatin og histone methylations er relativt stabil gjennom ChIP. Men siden en stor mengde starter materiale er nødvendig, er det ikke for å studere kortikale eller lillehjernen utvikling, der antall celler fra musen hjerner er vanligvis begrenset. Men antistoffer er generelt mot ikke-fast materiale, kan vi bevise at antistoffer spesielt oppdager H3K79me2 siden spesifikk hemming av DOT1L fører til et redusert H3K79me2 signal i ChIP-qPCR analyse og immunoblots (figur 2A og figur 3A). ChIP bruker krysskoblet materiale kan være ineffektiv, men presentert protokollen sikrer nok spesielt beriket materiale for qPCR og sekvensering analyse.

For en effektiv ChIP, kan SDS konsentrasjonen av lyseringsbuffer være avgjørende, siden SDS denatures proteiner og gjør dem tilgjengelige for antistoff bindingen. Denne funksjonen er spesielt viktig for H3K79me2, som er en histone endring beliggenhet på globular domenet av histone 3 nucleosome kjernen chromatin's minste enhet22. Således, for H3K79me2, en høyere SDS konsentrasjon (ca 0,3% w/v) under analysen for å sikre optimal antigene tilgjengelighet. Med denne SDS konsentrasjon, kunne vi svært berike H3K79me2 over IgG kontroller (Figur 3) og inndata (Figur 4). Dermed kvaliteten på ChIP-materiale for sekvensering var riktig og anriking over input sammenlignes med H3K4me3 (Figur 4). Vi forventer at samme SDS konsentrasjonen ville være nødvendig for ChIP av H3K79 mono eller trimethylation. Generelt, jo mer strenge ChIP bufferen er, mindre falske positive chromatin fragmenter er immunoprecipitated, hvis kvaliteten på antistoffer ikke påvirkes av vaskemiddel brukes. For fremtiden, kan det være mulig å bruke presentert protokollen andre histone modifikasjoner på globular domenet av histones.

Hvis antistoffer er egnet for ChIP og stabilt på høyere vaskemiddel konsentrasjoner, inneholder protokollen hovedsakelig to viktige trinn. Først skal fiksering av cellene og påfølgende klippe av chromatin være optimalisert for hver celle type og hver ultrasonicator. Langvarig cross-linking fører til fiksering gjenstander og kan redusere antistoff oppdagelsen rate siden antigener kan bli maskert. Chromatin klippe måtte føre en størrelsesDistribusjon av DNA mellom 200 og 500 bp (figur 1B). Nucleosomes inneholder 147 bp DNA. Chromatin fragmenter som er for lang vil føre til falske positive resultater i qPCRs. Under genomet hele sekvensering, vil en feil størrelsesDistribusjon føre til falske negative resultater, siden anses ofte bare små fragmenter. Det andre kritiske trinnet er biblioteket forberedelse til genomet hele sekvensering. Et DNA amplifikasjon skritt må utføres med 6-9 PCR-sykluser. Det er viktig å unngå mange PCR sykluser siden de kan føre til en høy GC bias og mange PCR duplikater. Med presentert protokollen, kan nok DNA hentes for å holde antall nødvendige PCR sykluser lav.

Hjernevev består av en svært variert mengde celletyper som nerveceller, oligodendrocytes og glia celler4. Under utviklingen av disse cellene avledet fra nevrale stamceller og bygge bestemte områder i hjernen på en tid og sted-avhengig måte3. Neurogenesis i hjernebarken, for eksempel, foregår mellom E11.5 og E18.5 i mus. På tidligere stadier som E11.5 og E12.5 nesten alle cellene har stamfar identitet1, men senere mobilnettet mangfold må tas i betraktning. Derfor en ChIP av kortikale vev på E14.5 kan avsløre H3K79me2 eller noen andre histone endring på det bestemte tidspunktet, men kan ikke vise celle-type spesifikke chromatin funksjoner. Dette problemet kan løses ved anriking av bestemte celler med fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) eller magnetisk-aktivert celle sortering (Mac-sortering)40, som er gjennomførbare etter hjernen homogenisering. Med Mac-sortering nevrale stamceller bærer bestemt celle overflate markører kan merkes med magnetiske perler og deretter isolert bruker en magnetisk stå40. Etterpå kan cellene kultivert eller direkte brukes for brikken. Presentert protokollen kan brukes ikke bare for nevrale stamceller, men også for andre homogen celle populasjoner. Med tillegg av FACS eller Mac, kan protokollen brukes for alle isolerende cellene i en organisme.

Sammen gjør presenterte protokollen det mulig å undersøke histone endring H3K79me2 på ulike tidspunkt kortikale og lillehjernen utvikling på en effektiv og reproduserbar måte. Det kan gjelde andre histone endringer innenfor histone kjernen og kan brukes på andre homogen celletyper i organismen. Siden H3K79me2 er en bevart histone endring23, kan protokollen også være egnet til å analysere H3K79me2 ikke bare i mus, men over forskjellige arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser

Acknowledgments

Vi takker Henriette Bertemes for å etablere CGN dyrking protokollen i laboratoriet. Notatet metoden ble støttet av DFG-finansiert CRC992 medisinske Epigenetics av finansiering til TV. Forfatterne bekrefter støtte fra Freiburg Galaxy laget: Pavankumar Videm, Björn Grüning og Prof Rolf Backofen, bioinformatikk, Universitetet i Freiburg, Tyskland finansiert av samarbeidende Research Centre 992 medisinsk Epigenetics (DFG grant SFB 992/1 2012) og tysk Federal Utdannings- og forskning (BMBF grant 031 A538A RBC (de. NBI)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-GAPDH Abcam ab8245 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000
Anti-H3 Abcam ab1791 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Anti-H3K79me2 Diagenode pAb-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP antibody
Anti-H3K79me2 Abcam ab-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000
Anti-rabbit-IgG Diagenode C15410206 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody
Anti-Tubulin alpha Abcam ab108629 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml) Sigma-Aldrich T1147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
B27 Supplement (50x) Life Technologies 17504044 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Bioanalyzer Agilent technologies G2940CA Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin
Bioruptor NextGen Diagenode B01020001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Ultrasonicator
Boric acid pH 8.4 Sigma Aldrich B6768 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
CFX Connect RT PCR Detection System Bio-Rad 1855201 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR
DMEM-F12 Life Technologies 11320-033 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
Dynabeads Protein A Invitrogen 10001D Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP
EPZ-5676 Selleckchem S7062 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Ethylenediamine tetraacetic acid SERVA 39760.01 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: EDTA
Fetal Bovine Serum 10% (v/v) Gibco 10082147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM
Glucose Sigma-Aldrich G5767 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Glutathione (1.25 mg/ml) Sigma-Aldrich G4251 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Glycine Carl Roth 3187 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For cell fixation
GoTaq mastermix Promega A6002 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR
Hank’s Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-100 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: HBSS
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030081 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Lithium chloride Sigma-Aldrich L4408 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: LiCl
N2 supplement Life Technologies 17502048 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
NanoDrop 3300 Thermo Fisher 3300 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina NEB E7645S Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina NEB E7335 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation
Neurobasal medium Gibco 21103049 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
NP-40 Alternative Calbiochem 492016 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Paraformaldehyde Carl Roth 335 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation
Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) Life Technologies 15640055 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM
Phosphate buffered saline Life Technologies 10010023 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation
PicoGreen Kit Thermo Fisher P11496 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Poly-L-ornithine hydrobromide Sigma Aldrich P3655 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Potassium chloride Thermo Fisher AM9640G Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: KCl, for CGM
Protease inhibitor Roche 4693159001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Proteinase K Sigma-Aldrich 3115879001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Qiagen MinElute Qiagen 28004 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification
RNAse Sigma-Aldrich R6513 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
SGC0946 Selleckchem S7079 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Sodium bicarbonate Carl Roth 8551.1 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: for Elution buffer
Sodium chloride Carl Roth 9265 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Sodium dodecylsulfate Carl Roth 183 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP
Sonic hedgehock (SHH) Sigma-Aldrich SRP6004 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Superoxide dismutase (1mg/ml) Sigma-Aldrich S7571 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Carl Roth 9090 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer
Triton X-100 Carl Roth X100 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) Sigma Aldrich 59417C Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation
Tween20 Carl Roth 28320 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For bead preparation
Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath
CCM: Cortical cell medium
CGM: CGNP cell culture medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
  2. Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science. 290, 1113-1120 (2000).
  3. Götz, M., Sommer, L. Cortical development: the art of generating cell diversity. Dev. Camb. Engl. 132, 3327 (2005).
  4. Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. Epigenetic control of neural precursor cell fate during development. Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).
  5. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372, 263-266 (1994).
  6. Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).
  7. McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254, 282-285 (1991).
  8. Desai, A. R., McConnell, S. K. Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development. Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).
  9. Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
  10. Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).
  11. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  13. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  14. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  15. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  16. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).
  17. Sanders, S. L., et al. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell. 119, 603-614 (2004).
  18. Martin, C., Zhang, Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).
  19. Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).
  20. Ng, H. H., et al. Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association. Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).
  21. Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest. FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).
  22. Roidl, D., Hacker, C. Histone methylation during neural development. Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).
  23. Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure. Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).
  24. van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core. Cell. 109, 745-756 (2002).
  25. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
  26. Woo Park, J., et al. RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20. Sci. Rep. 5, 12485 (2015).
  27. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. , (2016).
  28. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
  29. Feng, Y., et al. Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase. Blood. 116, 4483-4491 (2010).
  30. Cattaneo, P., et al. DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation. Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).
  31. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  32. Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).
  33. Roidl, D., et al. DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro. Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).
  34. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  35. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).
  36. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
  37. Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).
  38. Roidl, D. Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).
  39. Turner, B. ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , Institut national de la santé et de la recherche médicale. (2001).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).

Tags

Nevrovitenskap problemet 131 lillehjernen cellekultur kortikale cellekultur cortex utvikling lillehjernen utvikling H3K79 metylering DOT1L ChIP DOT1L hemming
Isolasjon og dyrking av nevrale Progenitors etterfulgt av Chromatin-Immunoprecipitation av Histone 3 lysin 79 Dimethylation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bovio, P., Roidl, D., Heidrich, S.,… More

Bovio, P., Roidl, D., Heidrich, S., Vogel, T., Franz, H. Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark. J. Vis. Exp. (131), e56631, doi:10.3791/56631 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter