Summary
Vi presenterar en effektiv och reproducerbar metod för att isolera och kultur neurala stamceller från embryonala och postnatal hjärnvävnad för kromatin immunoprecipitation (ChIP) av Histon 3 lysin 79 dimethylation (H3K79me2) - en Histon mark ligger inom den klotformig domän Histon 3.
Abstract
Hjärnans utveckling är en komplex process som styrs på ett temporo-spatial sätt av lutningar av morphogens och olika transkriptionell program. Dessutom har epigenetiska kromatin ändringar, som Histon metylering, en viktig roll för att etablera och upprätthålla viss cell öden inom denna process. Den stora majoriteten av Histon metylering sker på flexibla Histon svansen, som är tillgänglig för Histon modifierare, suddgummin och Histon läsaren proteiner. Däremot H3K79 metylering ligger i domänen klotformiga av Histon 3 och är inblandad i olika utvecklings funktioner. H3K79 metylering är evolutionärt bevarade och finns i ett brett spektrum av arter från Homo sapiens till Saccharomyces cerevisiae. Förändringen inträffar i olika cellpopulationer inom organismer, inklusive neurala progenitorceller. Platsen för H3K79 metylering i domänen klotformiga av Histon 3 gör det svårt att bedöma. Här presenterar vi metoder att isolera och kultur kortikala progenitor cells (CPC) från embryonala kortikala hjärnvävnad (E11.5-E14.5) eller cerebellär granulat neuron stamfäder (CGNPs) från postnatal vävnad (P5-P7), och att effektivt immunoprecipitate H3K79me2 för kvantitativ PCR (qPCR) och genome-wide sekvensering.
Introduction
De sensoriska, motoriska och kognitiva funktionerna i hjärnan är mycket komplexa och känsliga för fysiska och miljömässiga förändringar. Hjärnan består av tre allmänna delar av hind-, mid-, och framhjärnan, som förbinds djupt. Inom framhjärnan, kan telencephalon delas in i en dorsal telencephalon (DT) och en ventral telencephalon (VT). DT av möss består av sex kortikala skikt som bildas mellan E11.5 och E18.5 i en ”inside-out” sätt1. VT innehåller de ganglieblockerande eminenser i utveckling, som senare bildar den basala ganglier2,3. Flera celltyper kan klassificeras i däggdjur centrala nervsystemet såsom nervceller, astrocyter och oligodendrocyter4, som utvecklas i en temporo-spatial sätt5. Först ger de neurala stamceller (NPC) upphov till olika typer av nervceller, interneuroner i VT och projektion nervceller i DT, och senare vidare till gliaceller (t.ex., astrocyter6). Under kortikala utveckling, det mest ytliga lagret (lager jag), som innehåller Cajal-Retzius celler, bildas först. Sedan, mellan E12.5 och E14.5, NPCs skapa djupare neuronala lager (VI, V) medan mellan 14,5 och 16,5, stamfäder ge upphov till övre lagret (IV-II) nervceller7,8. Neuronala identitet anges genom olika morphogen-inducerad temporo-spatial transkriptionell program och dessutom epigenetiska program2.
Lillhjärnan, som är inblandade i finmotorik samordning, ligger i hindbrain och utvecklas mellan E10 och ungefär P20 i möss9. Den innehåller cerebellar cortex och cerebellär kärnor10. Adult cerebellar cortex består av tre lager, det yttersta molekylära lagret, det Purkinje cell-lagret och den innersta korniga lagret som innehåller granulat nervceller10. Cerebellär granule celler är de minsta nervcellerna och utgör cirka 80 procent av alla neuroner i ryggradsdjur hjärnan11. De utvecklas från prekursorer ligger i zonen för externa germinal och migrera genom Purkinje celler lagret till sin destination12. Som i telencephalon, utvecklingen av lillhjärnan regleras av flera viktiga morphogens, definieras som har särskilda och utrymme-tidsberoende funktioner och initiera transkriptionell program10.
Utvecklingen av kortikala och cerebellär lager styrs av transkriptionell uttryck av specifika morphogens och därmed av kromatin staten av DNA. I en förenklad vy, kan kromatin stater delas in i euchromatin som transcriptionally aktiv och Heterokromatin som transcriptionally tyst regioner. Nukleosomens som den grundläggande enheten av kromatin innehåller två kopior av varje core Histon H2A, H2B, H3 och H4, omgiven av 147 baspar i DNA13. Histoner modifieras högt post-translationally av metylering, acetylering, fosforylering, ubikvitinering, sumoylation, ADP-ribosylering, deaminering och prolin isomerization14,15. Histon lysin metylering anses vara den mest stabila Histon modifiering som styr transkription, replikation, rekombination16, DNA-skada svar17och genomisk prägling18. Lysines kan vara mono-, di- eller tri-metylerat19 och visas inte bara på tillgängliga Histon svansar, utan också inom domänen klotformiga av histoner20. Särskilda methylations vid H3K4 och H3K36 är främst förknippas med euchromatin, särskilda methylations på H3K9, H3K27 eller H4K20 finns huvudsakligen i heterochromatic regioner, även om alla rester ligger inom Histon svans14, 19,21. H3K79 metylering ligger inom domänen Histon klotformig och har associerats med transkriptionell aktivitet, men också med transcriptionally inert genomisk regioner22. Ändringen är evolutionärt bevarade eftersom det har observerats i jäst, kalv bräss, kyckling och mänskliga23. H3K79 mono, di och trimethylation (H3K79me1, me2, me3) är katalyseras av Histon metyltransferaser DOT1L24,25 och den nukleära ange domän-innehållande Protein 2 (Nsd2)26. DOT1L är inblandad i spridning, DNA-reparation och cellular reprograming27. Förlust av Dot1l i möss leder till en prenatal död runt de utvecklingsstadier E10.528,29. Under hjärtat utveckling och myocardiocyte differentiering är DOT1L viktigt för gen uttryck förordning30. I det centrala nervsystemet, DOT1L funktion kan vara inblandade i neuralrörsdefekter utveckling31, är involverade i undertrycka Tbr1-uttryck under framhjärnan utveckling32, och kanske fungerar i regleringen av ER-stress svar gener33. Den innehållsberoende aktivera eller förtränga åtgärder av H3K79me, särskilt med i vivo situationer som utvecklingen av det centrala nervsystemet, är hittills bara delvis förstod32. Eftersom H3K79 metylering är beläget i domänen klotformiga av Histon 3, är det koalisera mindre tillgängliga jämfört med ändringar på flexibla Histon svansar23. För att förstå funktionen av H3K79 metylering, behövs tillförlitliga och reproducerbara analysmetoder för att bestämma dess läge och genomisk miljö. I detta metoder papper presentera vi isoleringsmetoder olika neurala stamfäder (CPC för cortex) och CGNPs för lillhjärnan, effektiv DOT1L hämmare behandling och en ChIP metod att analysera H3K79 metylering via qPCR eller sekvensering vid annan tidpunkt punkter under kortikala och cerebellär utveckling. För en översikt av protokollet och dess möjligheter, se figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurens välbefinnande kommittéer av universitetar av Freiburg och lokala myndigheter godkänt alla djurförsök (G12/13, G16/11) nämns i följande protokoll.
1. förberedelser
-
Förberedelserna för CPC isolering
- Ställa in tidsinställda parning för att erhålla embryon i olika skeden av cortex utveckling (mellan E11.5 och E14.5). Använda möss stam NMRI (Naval Medical Research Institute) som är minst 8 veckor gamla. Efter parning, överväga en positiv vaginal plugg på E0.5.
- För att ha tillräckligt med material, använder du en kull av NMRI möss för ett H3K79me2 ChIP från cortices av E12.5 eller E14.5. För senare embryonala stadier, använda en kull för fler ChIP analyser (genomsnittlig kullstorlek NMRI: 10 embryon).
- Precool Hank´s balanserad Salt lösning (HBSS) och fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) till 4 ° C (långsiktig lagring på RT).
- Temperera den 4 ° C lagras Trypsin-EDTA (0,05% w/v) till 37 ° C.
- Förbered kortikal cell medium (CCM): Komplettera mediet för nervceller (se Tabell för material) med slutliga koncentrationer av 2% (v/v) B-27 supplement, 5 µg/mL Apo-Transferrin, 1 µg/mL glutation, 0,5 mM L-glutamin, 0,8 µg/mL superoxiddismutas och 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin-Neomycin antibiotika blandning. Förvara den vid 4 ° C. För experimentet, temperera medellång till 37 ° C.
- Tina fetalt kalvserum (FCS), alikvotens det (50 mL), och låt jämvikta en alikvot till 37 ° C (långtidsförvaring vid-20 ° C).
- Förbereda lager av DNAS 1 (10 mg/mL) i H2O för cellodling. Lagra alikvoter vid-20 ° C.
- Om det behövs, lös de specifika DOT1L-hämmare EPZ-5676 eller SGC0946 i DMSO till en lager koncentration på 100 mM. Tillämpa en slutet koncentration av 1-5 µM till celler på dag 0 och återanvända hämmaren varannan dag.
- För CPC odling, täck cell kultur-plattor (6 Tja eller 12 brunn) med poly-L-ornithine hydrobromid (1 mg/mL i 150 mM borsyra pH 8,4) för minst 1 h i RT och efteråt med laminin (1 mg/mL) i CCM medium vid 37 ° C under natten.
-
Förberedelserna för CGNP isolering
- Organisera en lämplig parning av möss att generera P5-P7 djur för isolering av lillhjärnan (3-5 djur per ChIP och villkor).
- Förbereda HBSS/glukos genom att lägga till 6 mg/mL glukos till HBSS buffert.
- Förbered CGNP cell odlingssubstratet (CGM) genom att lägga till 1% (v/v) N2 supplement, 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin-Neomycin, 25 mM KCl och 10% FCS till DMEM-F12. För CGNP odling förbereda CGM medium utan FCS men inklusive 0,6 µg/mL sonic hedgehog (SHH) (CGM-SHH) och temperera den vid 37 ° C när det behövs.
- Coat 6-väl cell kultur plattor med 100 µg/mL poly-D-lysin i 1-2 h på RT för glia-cell borttagning. Därefter tvätta två gånger med steril ddH2O och låt plattorna torka. Lagra plattorna för maximalt en vecka vid 4 ° C.
- För odling av CGNPs kappa 6-väl cell kultur plattor med poly-L-ornithine (0,1 mg/mL) vid 4 ° C över natten. Därefter tvätta två gånger med H2O för cellodling och låt plattorna torka.
Obs: Plattorna kan förvaras i max en vecka vid 4 ° C. - Förbereda 0.025% trypsin (w/v) i HBSS/glukos och temperera den vid 37 ° C när det behövs.
-
Förberedelserna för H3K79me2-ChIP
- Förbereda PFA (1% i PBS, pH 8) nymalen innan crosslinking kromatin. För att förbereda PFA värma 50 mL PBS i mikron till max 65 ° C. Lägga till 0,5 mg PFA PBS under ständig omrörning. Sedan Tillsätt 50 µL 10 M NaOH och vänta tills PFA är upplöst. Lägg därefter till 42,5 µL HCl (37% v/v) att få ett pH på 8. Kontrollera pH igen och låt den 1% PFA lösningen nå RT.
- Förbereda bestånd av RNase (1 mg/mL) och proteinas K (20 µg/µL) separat i sterila ddH2O. lagra alikvoter vid-20 ° C.
- Förbered följande buffertar och reagenser: PBS som innehåller 0,02% Tween, lyseringsbuffert, glycin, förtunningsbuffert, ChIP buffert 1, ChIP buffert 2, ChIP buffert 3 och TE buffert och lagra dem vid 4 ° C. Förbereda eluering bufferten nymalen varje gång.
- Förbereda PBS som innehåller 0,02% Tween. Väntar på de flesta en vecka vid 4 ° C.
- Förbereda lyseringsbuffert med 50 mM Tris på pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) och 1 x proteashämmare.
- Förbereda 2,5 M glycin.
- Förbereda förtunningsbuffert med 20 mM Tris vid pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton x-100, 0,25% (w/v) SDS och 1 x proteashämmare.
- Förbered ChIP buffert 1 med 20 mM Tris vid pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton x-100 (v/v) och 0,2% (w/v) SDS.
- Förbered ChIP buffert 2 använda 20 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton x-100 (v/v) och 0,2% (w/v) SDS.
- Förbereda ChIP buffert 3 med 20 mM Tris pH 8,0, 250 mM LiCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) NP-40 och 1% (w/v) SDS.
- Laga TE buffert med 20 mM Tris pH 8,0 och 2 mM EDTA.
- Förbereda färska eluering buffert innehållande 1% (w/v) SDS, 100 mM NaHCO3.
2. neurala stamceller isolering av hjärnvävnad
-
Isolering och valfri odling av CPC
- Avliva de dräktiga djur av cervikal dislokation och överföra embryon till iskall HBSS.
- Ta bort skallen med sax och isolera hjärnan och ta sedan bort hjärnhinnorna, om tillämpligt, med liten pincett och isolera cortices (hela DT eller VT) av båda hjärnhalvorna genom att ta bort alla andra hjärnan delar under den kikare omfattning använder liten pincett och, om nödvändigt, små saxar. Lagra de isolerade cortices i 5 mL HBSS buffert vid 4 ° C i en 15 mL tub.
- Centrifugera det isolera hjärnan materialet för 5 min på 1 000 x g och 4 ° C.
- Tvätta cortices med 5 mL iskallt HBSS och homogenisera dem med en 1 mL pipettspetsen genom pipettering upp och ner. Om det behövs, skär spetsen av pipettspetsen.
- Centrifugera det homogeniserade provet för 5 min på 1 000 x g och 4 ° C. Ta bort HBSS.
- Tillsätt 3 mL Trypsin och inkubera provet för 5 min vid 37 ° C.
- Tillsätt 1 mL FCS, 5 mL CCM och 30 µL av DNAS 1 och Homogenisera provet med pipett 5 mL glas genom pipettering försiktigt upp och ner.
- Centrifugera isolerade celler för 5 min vid 1000 x g och 4 ° C. Kassera supernatanten, tillsätt 5 mL CCM och Homogenisera provet igen.
- Späd en alikvot av provet och räkna det med en Neubauer räknar-kammare. Ett genomsnittligt belopp på 4,5 x 106 celler per embryo förväntas. För odling av isolerade systemet fortsätter du med steg 2.1.10. För ChIP, genast fortsätta med steg 3.
- För odling, plattan systemet på poly-L-ornithine (0,1 mg/mL) och laminin (1 mg/mL) belagd rätter på en densitet mellan 8 x 104 och 2,5 x 105 celler/cm2 i CCM medium och inkubera dem vid 37 ° C, 5% CO2och 100% relativ fuktighet.
- Eftersom systemet börjar differentieras till nervceller i cellkultur (efter cirka 4 dagar), anser dissektion datumet som dag in vitro- 0 (dag 0). För längre löptider av odling, ändra hälften av medium varje fjärde dag med färska CCM medium.
- Applicera 1-5 µM SGC0946 eller EPZ5676 löses i DMSO på dag 0 (4-5 h efter cell isolering) och uppdatera den varannan dag. Använda DMSO som kontroll behandling. Testa effektiviteten av hämmare behandling via standard immunoblot metoder, om det behövs.
-
Isolering och valfri odling av CGNPs
- Euthanize P5-7 djur genom halshuggning med sax. Ta bort hårbotten huden, öppna skallen och ta bort hjärnan med hjälp av liten sax och pincett. Isolera lillhjärnan och överföra det till iskall HBSS/glukos. Ta bort alla hjärnhinnorna och blodkärl och överför cerebella till 15 mL rör fyllda med kall HBSS/glukos.
- Tvätta cerebella tre gånger med 10 mL iskallt HBSS/glukos (samla dem genom centrifugering vid 650 x g i 5 minuter vid 4 ° C) och homogenisera cerebella därefter genom pipettering försiktigt upp och ner med en 1 mL pipett (maximalt 2 - 3 gånger) att få 0,5-1 mm3 fragment.
- Tillsätt 5 mL 0,025% trypsin i HBSS/glukos och inkubera vävnaden under ständig omrörning i 37 ° C vattenbad för 15 min. Stop matsmältningen genom att tillsätta 5 mL av CGM och samla in vävnaden genom centrifugering vid 650 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och pulverisera vävnaden med en 1 mL Pipettera spets i 1 mL CGM och överföra den till en ny 15 mL tub.
Obs: Det är viktigt att undvika luftbubblor.- Tillsätt 5 mL CGM och inkubera blandningen i 2 min på is sedimentera vävnad resterna. Över supernatanten till en ny 15 mL tub. Tillsätt 2 mL CGM i kvarvarande vävnad och upprepa förfarandet sönderdelning.
- Slå samman supernatanterna (utan vävnad resterna, ca 10 mL totalt) och centrifugera vid 650 x g i 5 minuter vid 4 ° C att samla in cerebellär cellerna. Återsuspendera pelleten i 10 mL CGM.
- Eftersom astrocyter följer snabbare och starkare poly-D-lysin än CGNPs, platta celler med 100 µg/mL poly-D-lysin 6-brunn-plattorna (upp till 4 mL per brunn) och Inkubera under 20 minuter vid 37 ° C ta bort astrocyterna.
- Skaka plåten och samla supernatanten. Sedan Centrifugera vid 650 x g i 5 minuter vid 4 ° C i en 15 mL tub. Återsuspendera pelleten i 10 mL CGM och räkna cellerna med en Neubauer räknar kammare.
Obs: CGNPs är runda, liten och visa en Gloria när avbildas med hjälp av fas kontrast mikroskopi. - Om krävs, utsäde cellerna i 37 ° C före värmde CGM på poly-L-ornithine-belagda plattor (3 x 106 celler per 6-brunn) och inkubera dem vid 37 ° C, 5% CO2 och 100% relativ fuktighet.
Obs: Om seedning inte utförs, Fortsätt till steg 3.1.- Efter 6-12 h, utbyta medellång till CGM-SHH. Behandla den isolera CGNPs 6 h (eller när du ändrar till CGM-SHH) efter isolering med DOT1L-hämmare och DMSO kontrollera och förnya det varannan dag (jämför med 2.1.12). Testa effektiviteten av hämmare behandling via standard immunoblot metoder om det behövs. För ChIP, fortsätter du med steg 3.3.
Obs: Lämna CGM på plattorna (och med att FBS) kommer att resultera i differentieringen av CGNPs till cerebellär granulat nervceller (CGNs).
- Efter 6-12 h, utbyta medellång till CGM-SHH. Behandla den isolera CGNPs 6 h (eller när du ändrar till CGM-SHH) efter isolering med DOT1L-hämmare och DMSO kontrollera och förnya det varannan dag (jämför med 2.1.12). Testa effektiviteten av hämmare behandling via standard immunoblot metoder om det behövs. För ChIP, fortsätter du med steg 3.3.
3. fixering av celler och klippning av kromatin
Obs: Utför steg 3.1 och 3.2 om celler inte odlas, om de är vidare till steg 3.3.
- Samla in cellerna genom centrifugering för 4 min på 1 000 x g och tillsätt 1,3 mL PBS. Överför provet till en 1,5 mL tub. Centrifugera under 4 minuter vid 1 000 x g vid 4° C. Tvätta provet två gånger med 1,3 mL PBS.
-
Kritiska steg: Tillsätt 350 µL 1% PFA till provet och inkubera det i 5 minuter vid 22 ° C. För att stoppa reaktionen, lägga till 18,4 µL glycin och 1 mL PBS. Centrifugera provet för 5 min vid 1 000 x g vid 4 ° C.
- Tvätta provet två gånger med iskall PBS. Samla in de fasta cellerna genom centrifugering för 5 min vid 1 000 x g och 4 ° C. Hålla proverna på is från nu på.
Obs: Fixering tiden måste vara exakt 5 min att få optimala resultat. Olika cell nummer kan kräva tid anpassningar.
- Tvätta provet två gånger med iskall PBS. Samla in de fasta cellerna genom centrifugering för 5 min vid 1 000 x g och 4 ° C. Hålla proverna på is från nu på.
-
Kritiska steg: Odlade CGNPs (eller CPC), Lägg till 1 mL 1% PFA direkt till cell kultur plattan brunnarna. Efter en 5 minuters inkubation vid 22 ° C, tillsätt en lämplig mängd glycin och PBS och skörda cellerna med en cell skrapa.
- Överföra cellerna i 1,5 mL rör och centrifugera provet för 5 min på 1 000 x g och 4 ° C. Tvätta provet två gånger med iskall PBS. Samla in de fasta cellerna genom centrifugering för 5 minat 1 000 x g vid 4 ° C. Hålla proverna på is från nu på.
-
Kritiska steg: Tillsätt 700 µL lyseringsbuffert (+ proteashämmare) och inkubera provet under 15 minuter vid 4 ° C. Vortex provet varje 5 min. skjuvning kromatinet lyserat celler 3 x 10 min i den någon sonikator (30 s puls, 30 s paus) vid maximal effekt.
- Kontrollera att volymen inte överstiger 350 µL per rör. Vortex proverna var 10 min. Kontrollera den lysate för resterande kärnor med en faskontrastmikroskop.
Obs: Det är viktigt att få optimal klippning resultat (jämför med figur 1B) för senare analys. Vid användning av andra metoder för klippning kromatinet, optimera den skevningen till kromatin fragment storlek mellan 200-500 bp.
- Kontrollera att volymen inte överstiger 350 µL per rör. Vortex proverna var 10 min. Kontrollera den lysate för resterande kärnor med en faskontrastmikroskop.
- Pellet cell rester för 10 min, 13 000 x g, 4 ° C. Använd supernatanten för preclearing steg 5.2. Frys provet vid-20 ° C för senare användning, om det behövs.
4. beredning av pärlor och Preclearing
- Tvätta 45 µL protein A magnetiska pärlor/ChIP och 20 µL magnetiska pärlor/prov med 1 mL iskallt PBS som innehåller 0,02% Tween tre gånger med en magnetisk stå. Sedan lägger du till 1 mL iskallt PBS pärlorna.
- 1 mL iskallt PBS och 45 µL pärlor/ChIP, tillsätt 3 µg av antikropp/ChIP (H3K79me2 eller kanin IgG). Inkubera proverna för 2 h vid 4 ° C på en rotator att binda antikroppar till pärlorna. Beroende på antikroppen, använda ~ 3 µg antikropp/ChIP.
- Tvätta antikropp-bound-pärlorna tre gånger med 1 mL iskallt PBS som innehåller 0,02% Tween. Lägga till lämpliga pärla volymen (start volymen av magnetiska pärlor används) iskall PBS tvättade antikropp-tillsammans-pärlorna.
- Lägga till 600 µL förtunningsbuffert och 20 µL av tvättade magnetiska pärlor i provet för preclearing (total volym 1 320 µL) och inkubera i 2 h vid 4 ° C på en rotator. Ta bort pärlor med hjälp av en magnetisk stå. Ta 5% (33 µL) av lysates som input prover och frysa dem vid-20 ° C.
5. kromatin Immunoprecipitation
- Dela precleared extraktet i två rör (cirka 643.5 µL), Tillsätt samma mängd förtunningsbuffert och antikropp-bound-pärlor (45 µL/prov; H3K79me2 eller kanin IgG). Inkubera proverna vid 4 ° C över natten på en rotator.
- Tvätta pärlorna med iskall ChIP buffert 1, ChIP buffert 2 och ChIP buffert 3 för 10 min varje vid 4 ° C på en rotator. Därefter, tvätta tre gånger med TE buffert för 5 min vid 4 ° C på en rotator.
- Eluera pärlorna med eluering buffert för 1 h vid 1400 rpm i en shaker vid rumstemperatur.
- Tillsätt 10 µg RNase (1 mg/mL) per ChIP prov och 5 µg till ingående proverna och inkubera proverna för 30 min vid 37 ° C (1400 rpm).
- Lägga till 100 µg proteinas K (20 µg/µL) per ChIP prov och 50 µg per ingång och inkubera över natten vid 65 ° C vid 1 400 rpm.
6. rening av ChIP prover
- Renar ChIP och input prover med en DNA-rening kit (se Tabell för material) enligt manualen. Använd mer rening kolumner när mer än 5 µg av DNA förväntas. Eluera provet med 2 x 15 µL av DNA eluering bufferten i kit.
- Utföra kvantifiering av proverna (Använd 1 µL) med hjälp av en visualisera fluorophore och en fluorospectrometer (se Tabell för material).
7. analys av ChIP prover via qPCR
- För primer design för qPCR-analys, Hämta genomsekvenser sevärdheter från den integrativa genomik Viewer (IGV) webbläsare34. Utforma primers runt den transkriptionell startwebbplats (TSS) av en gen, eftersom H3K79me2 kommer sannolikt att vara belägna där. Som en kontroll, anser icke-kodande genetiska regioner eller regioner ca 10 Kb uppströms av TSS eller 10 Kb nedströms av transkriptionell slutet webbplats (TES).
- Generera primers med https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ använder en Produktstorlek mellan 70 och 200 bp och en optimal temperatur förinställning av 60 ° C. För teständamål, använda primers för genomisk regionerna Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, och Npm1 listade i tabell 1.
- Testa nydesignade grundfärger med följande qPCR program, master mix och en glödgning temperaturgradient mellan 58 ° C och 63 ° C och välj glödgning temperaturen med högsta produktkvantitet och kvalitet.
- Tillämpa DNA gelelektrofores för att styra förväntade produktens storlek. För qPCR-analys, använda en Real-Time PCR-Detection System (se Tabell för material).
- Förbereda huvudmixen använder 10 µL DNA-polymeras master mix, 0,5 µL primer framåt (10 µM), 0,5 µL primer omvänd (10 µM), 4 µL nuclease-gratis vatten och 5 µL DNA (1 ng/µL).
- Använd en 2-stegs qPCR program enligt följande: 5 min vid 95 ° C, 50 x (30 s vid 95 ° C, 30 s vid 58 ° C - 63 ° C), och denaturering lutning ständigt vid 4 ° C.
- Skapa en utspädning serie av genomiska, klippt, renade DNA-prover (2 ng/µL, 1 ng/µL, 0,5 ng/µL, 0,25 ng/µL och 0,125 ng/µL) och använda 5 µL för ett effektivitet-test med qPCR. Bestäm lutningen av standardkurvan och beräkna primer effektivitet genom följande formel:
Effektivitet (%) = (10^(-1/slope)-1) * 100.- Använda primers med effektivitet mellan 90 och 105% i en ideala fallet, eller åtminstone med effektivitetsvinster mellan 85 och 115%.
- För att analysera de ChIP och input prover, tillämpa 0,1-1 ng av ChIP DNA blandas med respektive framåt och reverse primer, nuclease-gratis vatten och DNA-polymeras master mix i en slutlig volym av 20 µL för varje qPCR reaktion.
- Bestämma cykel (Ct) tröskelvärdena i ChIP och input prover och normalisera provet Ct Ct -värden för ingående att beräkna berikning (% ingång) med följande formel. Använd Ct värden erhålls från IgG kontroll att bestämma bakgrundsnivån.
% input = 100-2^(norm. ingående − normen. ChIP)
norm. input = Ct (ingång) − log2(utspädningsfaktor)
norm. ChIP = Ct (ChIP) − log2(utspädningsfaktor)
Obs: norm. = normaliserat
8. analys av ChIP prover via sekvensering
- Överföra de ChIP proverna (input och immunoprecipitated DNA-prov) till en anläggning för sekvensering.
- För att förbereda en bibliotek i förväg, Använd en lämplig bibliotek förberedelse kit (se Tabell av material) och konvertera 2 ng av ingående DNA och allt av immunoprecipitated DNA i indexerade bibliotek för nästa generation multiplex sekvensering på den anges plattform (se Tabell för material).
-
Kritiska steg: Efter anvisningarna i kit och ligera sekvensering adaptrar (med en arbetande koncentration av 15 µM) för att avsluta repareras och dA-tailed DNA-fragment. För sekvensering adaptrar och PCR använda primers lämpliga oligos (se Tabell för material). För denna mängd input DNA, Använd 6-9 PCR cykler för att berika adapter sammanskrivna DNA-fragment.
Obs: Normalt, det är inte nödvändigt att utföra ett storlek urval av adapter sammanskrivna DNA. Det är bäst att använda så få PCR cykler som möjligt, sedan många PCR-amplifiering cykler resulterar i PCR-dubbletter och en hög GC-bias. - För en slutlig bibliotek check, ta 0,5 µL av den totala reaktionen för analys att visualisera storleksfördelning på lämplig anordning (se Tabell för material). För kvantifiering, Använd en visualisera färg i kombination med en fluorospectrometer eller andra metoder (se Tabell för material).
- Eftersom H3K79me2 verkar vara en Histon ändring, som är allmänt spridda över större genomisk regioner, sekvens prover Parade-slutet med en Läs längd 50 bp och med sekvensering djup 75 Mio läsningar.
- Analysera ChIP-seq data med Galaxy/Uni Freiburg servern (galaxy.uni-freiburg.de).
- Utföra kvalitetskontroll med erhållna ChIPseq med FastQC och, i förekommande fall, mappa dem direkt med Bowtie2 version 2.2.035 med eller utan trimning. Som referens använda genomet församlingen mm9 eller den nyaste versionen mm10; och som referens anteckning häckning FTP släpp 79.
- Valfritt: Ta bort Läs dubbletter med hjälp av Picard MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard) innan peak calling.
- Kalla toppar med MACS2 version 2.1.036 använda alternativet 'breda' för H3K79me2.
- För att få en log2 förhållandet mellan ChIP och ingående prov, de log2 av antalet läsningar av läser förhållandet mellan båda prover Använd BamCoverage och BamCompare.
- För alla andra ChIP-seq specifika djupanalys, applicera deepTools2 version 2.3.5 eller 2.4.137, dvs att generera täckning spår filer (bamCoverage för ChIP endast, bamCompare för jämförelse av ChIP till ingången), för att uppskatta ChIP prestanda Använd plotFingerprint och för att generera en allmän översikt computeMatrix, plotHeatmap. Välj K-medelvärde klustring under processen computeMatrix klustra genomisk regioner enligt H3K79me2 distribution.
- Användning publicerade ChIP-seq data som H3K79me2 av E14.5 DT deponeras på NCBI för teständamål (anslutningen nummer: SRP057733).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Systematik av neurala stamceller isolering, odling, H3K79me2 ChIP och ChIP analysmetoder: Figur 1 visar ett flödesschema för att utföra H3K79me2 ChIP av kortikala stamceller vid olika tidpunkter under embryonala hjärnans utveckling eller cerebellär granulat neuron stamfäder i postnatal stadier. Som ett första steg, hjärnan har isoleras telencephalon (mellan E11.5 och E14.5) eller lillhjärnan (P5-P7) har som ska hämtas. Det är möjligt att analysera de olika regionerna av telencephalon uppdelade i de DT och VT. Efteråt kommer vara homogeniserad vävnad och neurala föräldraparets segregerade. Nu, är det möjligt att odla stamceller cellerna och behandla dem med DOT1L-hämmare. En annan möjlighet är att fixa föräldraparets direkt och utsätta dem för förfarandet för ChIP. För ChIP, blir kromatinet klippt i fragment av 200-500 bp och inkuberas därefter med magnetiska pärlor-kopplade antikroppar mot H3K79me2. Efter tvättning pärlorna och hämtar DNA, kan utfällda DNA analyseras genom sekvensering eller qPCR (figur 1A). Det är viktigt att ha en bra storlek distribution av kromatin fragment efter klippning, så är det tillrådligt att kontrollera fragment storlek med DNA gelelektrofores eller med andra metoder (se exempel i figur 1B). När du väljer genome-wide sekvensering, tillhandahålls ChIP-seq-läsningar för H3K79me2 inflyttning som en fastq-fil för vidare analys (figur 1 c). Kvaliteten på sekvensering läser måste bedömas med tillämpning av FastQC och, om nödvändigt, fastq-filerna kan trimmas med TrimGalore. Mappning till Mus musculus genomet mm9 eller mm10 kan utföras med Bowtie2 och styras via PlotFingerprint. Det är lämpligt att ta bort dubbletter med MarkDuplicates och att normalisera läser av BamCoverage och att jämföra chipet ingående prov med BamCompare. Den ChIP-seq läser kan sedan visualiseras genome wide i heatmaps eller gene-wise i integrativ genomik Viewer (IGV) webbläsarsessioner.
CPC kultur och DOT1L hämning: Systemet var isolerade och behandlades med 5 µM DOT1L hämmare SGC0946 vid dag 0 och dag 2. De lösningsmedel DMSO användes som kontroll. På dag 3, CPC skördades, proteinerna var isolerade, kvantifieras och analyseras via immunoblot (figur 2A). Figur 2A visar att H3K79me2 är effektivt minskat efter tre dagar av CPC odling och DOT1L hämning att säkerställa en effektiv hämmare behandlingsschemat. Protein mängden H3, GAPDH eller Tubulin-alpha tjänstgör som kontroller laddas var därmed inte nedsatt. Immunfärgning av fasta CPC med antikroppar mot aktiva kaspas 3 (CASP3 +) för att upptäcka apoptos och HuC/D för att visualisera neuronala celler anges att behandling av systemet med DOT1L-hämmare som ledde till ökad celldöd efter tre dagar i kultur, som visas i figur 2B. Kvantifiering av celler som är CASP3 +/ DAPI + eller HuC/D +/ DAPI + inom CPC kulturen visade en betydande ökning av CASP3 + celler avslöjar programmerad celldöd vid DOT1L hämning. Antalet HuC D-positiva neuroner, förblev dock oförändrad (figur 2 c).
H3K79me2 ChIP-qPCR av Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, och Npm1 från CPC behandlades med DOT1L-hämmare: att testa om SGC0946 hämmare behandling av DOT1L var effektiv och ledde till en minskning av H3K79me2 på specifika gener, genomförde vi en ChIP analys följt av qPCR av CPC behandlas i 3 dagar. Kanin IgG användes som en spånkontroll. Eftersom det är känt att H3K79me2 ligger på endoplasmatic stress-lyhörd generna Aft4, Ddit3, Scd1, och Aft3 samt på den nukleära transporter gen Npm133,38, använde vi qPCR primers som täcker TSS, TES och genomisk regioner inom organ som genen för att avgöra skillnader i H3K79me2 fördelning efter DOT1L hämning (figur 3A). Gener med hög H3K79me2 minskning i första hand som Atf4, Ddit3, och Npm1 var mest lyhörda till hämmare behandling så att tre dagar av hämning av DOT1L ledde till en betydande av H3K79me2. Gener med en lägre H3K79me2 täckning, såsom Atf3 och Scd1, visade ingen signifikant förändring i H3K79me2 nivåer.
Översikt av H3K79me2 ChIP-seq analys: Genome-wide analys H3K79me2 nivåer i systemet från E14.5, utförs och analyseras enligt de presenterade system och protokoll (figur 1), visade en mycket hög kvalitet ChIP. Medan binned räkningarna, sorteras enligt deras frekvens av ingående läser i Fingerprint blot (figur 4A), var jämnt fördelade, H3K79me2 räkningarna visade berikning på specifika regioner (lagerplatser rankas med 1), som visar framgångsrika ansamling av kromatin fragment modified på H3K79. En heatmap av H3K79me2 längs gener mellan deras TSS och sin TES och +/-10Kb uppströms eller nedströms visar (figur 4B) att H3K79me2 toppar runt TSS och minskade mot TES i allmänhet. Det finns gener som är helt täckt med H3K79me2, och gener, som har en topp endast inom regionen TSS. Endoplasmatic-stress relaterade gener såsom Atf4, Ddit3, och nucleophosmin Npm1 hamnen, till exempel en H3K79me2 hög på TSS, som är endast något minskade längs hela genen kroppen (figur 4 c). Scd1 har däremot en låg H3K79me2 beläggning på TSS och ingen H3K79me2 i gen kroppen. Atf3 som ett sist exempel har olika skarpa och låg nivå H3K79me2 toppar längs gen kroppen.
Figur 1: systemet av H3K79me2 ChIP protokoll från isolerade CPC eller CGNPs och flödesschema för sekvensering analys. (A) översikt över presenteras protokoll. För CPC isolering, första E14.5 hjärnor blir isolerade och cortices kan delas in i DT och VT, om det behövs. För CGNPs har cerebelli hämtas från P5-P7 möss. Vävnaden blir homogeniserad, föräldraparets segregerade, och sedan cellerna kan odlade och behandlades med en lämplig hämmare eller direkt användas för ChIP. För ChIP, är fixering av kromatinet följt av klippning och immunoprecipitation med en anti-H3K79me2 antikropp och kanin IgG som kontroll. Efter den DNA-reningen, ChIP prover kan analyseras via biblioteket förberedelse och sekvensering eller kan analyseras via qPCR. (B) exempel på lämpliga och olämpliga kvalitet kromatin. DNA fragment fördelningen visas i bp. (C) ChIP-seq resultat kan bli föremål för en analys pipeline på Freiburg/Galaxy servern. Efter en kvalitetskontroll (FastQC), kan läser trimmas med TrimGalore och sedan mappas via Bowtie2 till mus genomet (i den presenterade fall mm9). PlotFingerprint utvärderar kvaliteten på chipet. Om du vill definiera toppar för H3K79me2, kan MACSpeaks tillämpas. För normalisering BamCoverage och jämförelse med de ingående BamCompare är användbara. För att visualisera resultaten IGV är webbläsare och heatmaps lämpliga. Förväntade fil-format är kursiv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: kortikala stamceller kultur och DOT1L hämning. (A) Immunoblots visar H3K79me2 nivåer i CPC på E14.5 efter DOT1L hämning i 3 dagar (dag 3, n = 3-11) i jämförelse med DMSO kontroll. H3, GAPDH och Tubulin alpha användes som kontroller laddas. (B) Immunocytological färgning av en CPC-kultur på dag 2 och 3. Aktiverad kaspas 3 (CASP3 grön)-positiva celler och nervceller (HuC/D: röd) var målat. DAPI (blå) användes för att visualisera cellkärna. Skalstapeln: 100 µm. (C) kvantifiering av immunostainings presenteras i (B). Förhållandet mellan positiva celler för CASP3 +/ DAPI + eller HuC/D +/ DAPI + i procent ges. För statistisk analys utfördes oparade Student's t-tester. p < 0,01 **. Denna siffra ändrades från Roidl et al. 33 , 38 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: H3K79me2 ChIP-qPCR av Aft4, Ddit3, Aft3, Scd1, och Npm1 från CPC behandlades med DOT1L-hämmare. (A) E14.5-derived CPC behandlades med 5 µM DOT1L hämmare 4-5 h efter isolering och för andra gången på dag 2 i kultur. CPC fastställdes på dag 3, som följdes av kromatin utvinning, ChIP experiment och qPCR. Resultaten är representerade som medelvärdet (+/-SEM) % ingång (n = 3). IgG har använts som en negativ kontroll. Medelvärdet av IgG nivå avbildas som streckad linje. För statistisk analys tillämpades tvåvägs ANOVA. p < 005 *; p < 0,01 **, p < 0,001 ***; TSS transkriptionell startwebbplats, TES transkriptionell slutet webbplats. Denna siffra ändrades från Roidl et al. 33 , 38 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: översikt över H3K79me2 ChIP-seq analys. (A) fingeravtryck av H3K79me2 ChIP-seq från E14.5-derived CPC jämfört med ingång visar en anrikning av DNA-fragment för H3K79me2 vilket garanterar en hög ChIP-seq-kvalitet. (B) H3K79me2 ChIP-seq resultaten ritas i en heatmap. Starkt berikat genomisk regioner presenteras i blått. Skala 0 (Mörkröd) - 45 (mörkblå). H3K79me2 toppar nära TSS och minskar i 3´ riktning till TES. (C) H3K79me2 ChIP-seq läsningar var mappade till mm9 genomet och visualiseras med integrativ genomet viewer (IGV). H3K79me2 beläggningen av en gen visas som log2 av antalet läsningar förhållandet mellan ChIP och ingående läsningar per kilobase per miljon (skalning: -10 till 10). RefSeq genstruktur representeras medan en röd ruta anger den första exon inklusive TSS. Gener Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, och Npm1 visas. En H3K4me3 signal i samma genomiska region visas för jämförelse. TSS transkriptionell startwebbplats, TES transkriptionell slutet webbplats. Denna siffra ändrades från Roidl38. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Gene | Region | Primer framåt 5' - 3' | Primer omvänd 5' - 3' | ||
| Aft4 | TSS | GGACGATCTCTAACGCCACA | GCCCTAAACCCGCCCTTTAT | ||
| Aft4 | TSS + 1500 | CTCCCGAATATGACATGAACCG | TCCATTCGAAACAGAGCATCG | ||
| Aft4 | TES | CCGTAATAGGGTAGTCAGGTGC | AAAGAATGACACTGAAAACCCACA | ||
| Ddit3 | TSS | GTACTGGCTCCGTCTAACCC | CAAGAGAGGGCCTGTAAGCA | ||
| Ddit3 | TSS + 2500 | TCAAGCAGCCGGTCTCATAG | CTCAGATCCCCCAATGGCTT | ||
| Ddit3 | TSS + 4500 | GAGCTGGAAGCCTGGTATGA | TCACCTCTTCGTTTCCTGGG | ||
| Ddit3 | TES | CACCAAGCATGAACAGTGGG | GTACCGTCTATGTGCAAGCC | ||
| Aft3 | TSS | AACTGAGAGCGCAACTCCTC | GCTGCCGTTCTTAGCTGGTA | ||
| Aft3 | TES | CTGTTGGCACAAAGTGGCTC | GGGATCTGCCATGGTGGAAA | ||
| Scd1 | TSS | TAGTGACCACACACAAAAGCTC | CCCAAGTGTAATTTGGATGATTTCC | ||
| Npm1 | TSS | TCCCCCTCCAGTCAGTTACC | CGTCCTTTCCTTGGCGTGA | ||
| Npm1 | TES | AGGGACATACTTAAGACAAGCCAG | AGGATTGAGGCAGACTGTCAAT | ||
| TSS: transkriptionell startwebbplats | |||||
| TES: transkriptionell slutet webbplats | |||||
Tabell 1: Lista över primers används för ChIP-qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns två stora sätt att utföra kromatin immunoprecipitation för att upptäcka genomisk beläggningen i Histon modifieringar, transkriptionsfaktorer, Histon kodläsare, författare eller suddgummin. En är infödda ChIP metod använder nuclease rötas, infödda kromatin för immunoprecipitation, och den andra är den presenterade metoden använder PFA-fast, klippt kromatin, där nucleosomes och andra DNA-anslutna proteiner kovalent bundna till DNA 39. infödda ChIP med dess höga antikroppar upptäckten hastighet bör tillämpas för Histon metylering sedan kromatinet och Histon methylations är relativt stabila under hela ChIP. Men eftersom en stor mängd utgångsmaterial behövs, det är inte tillämplig för att studera kortikala eller cerebellär utveckling, där antalet celler från mus hjärnor är vanligtvis begränsad. Även om antikroppar höjs generellt mot icke-fasta material, kunde vi bevisa att antikroppen specifikt identifierar H3K79me2 sedan specifik hämning av DOT1L leder till en minskad H3K79me2-signal i ChIP-qPCR-analys och i immunoblots (figur 2A och figur 3A). ChIP med tvärbundna material kan vara ineffektiv, men protokollet presenterade säkerställer tillräckligt specifikt berikad material för qPCR och sekvensering analys.
För en effektiv ChIP, kan SDS koncentrationen av lysisbuffert vara avgörande, eftersom SDS denaturerar proteiner och gör dem tillgängliga för antikropp bindande. Den här funktionen är särskilt viktigt för H3K79me2, som är en Histon ändring ligger inom domänen klotformiga av Histon 3 och inom nukleosomens kärnan av kromatins minsta enhet22. Således, för H3K79me2, en högre SDS koncentration (cirka 0,3% w/v) under analysen behövs för att säkerställa optimal antigene tillgänglighet. Med denna SDS koncentration, kunde vi mycket berika H3K79me2 över IgG kontroller (figur 3) och över ingång (figur 4). Således, kvaliteten på ChIP-materialet för sekvensering var lämpligt och berikning över ingång jämförbar med H3K4me3 (figur 4). Vi förväntar oss att samma SDS koncentration behövs för ChIP av H3K79 mono eller trimethylation varumärke. I allmänhet, desto strängare ChIP bufferten är, mindre falskt positiva kromatin fragment är immunoprecipitated, om kvaliteten på antikroppen inte påverkas av de rengöringsmedel som används. För framtiden, kan det vara möjligt att tillämpa protokollet presenteras andra Histon ändringar inom domänen klotformiga av histoner.
Om antikropparna är lämpliga för ChIP och är stabil vid högre koncentrationer som tvättmedel, innehåller protokollet huvudsakligen två kritiska steg. Först, fixering av cellerna och den efterföljande klippning av kromatinet bör optimeras för varje cell och varje ultrasonicator. Långvarig bryggbindningen leder till fixering artefakter och kan minska den antikropp upptäckt hastigheten eftersom antigener kan maskeras. Den kromatin klippning behövs för att leda en storlek distribution av DNA mellan 200 och 500 bp (figur 1B). Nucleosomes innehåller 147 bp DNA. Kromatin fragment som är alltför långa kommer att leda till falskt positiva resultat i qPCRs. Under genome-wide sekvensering, kommer att en felaktig storlek distribution leda till falskt negativa resultat, eftersom ofta bara små fragment anses. Den andra kritiska steget är bibliotek förberedelserna för genome-wide sekvensering. En DNA förstärkning steg måste utföras med 6-9 PCR-cykler. Det är viktigt att undvika många PCR cykler eftersom de kan leda till en hög GC-bias och många PCR dubbletter. Med protokollet presenteras, kan tillräckligt med DNA hämtas för att hålla antalet nödvändiga PCR cykler låg.
Hjärnvävnaden består av en mycket varierad mängd celltyper som neuron, oligodendrocyter och glia celler4. Under utvecklingen dessa celler härleda från neurala stamceller och bygga särskilda områden i hjärnan vid en tid - och plats-beroende sätt3. Neurogenes i hjärnbarken, exempelvis sker mellan E11.5 och E18.5 i möss. I tidigare skeden såsom E11.5 och E12.5 nästan alla celler har stamceller identitet1, men senare cellulära mångfald behöver beaktas. Därför ett ChIP av kortikal vävnad på E14.5 kan avslöja H3K79me2 eller någon annan Histon modifiering vid denna specifika tidpunkt men kan inte Visa celltyp specifika kromatin funktioner. Problemet kan lösas genom anrikning av specifika celler med fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) eller magnetisk-aktiverad cell sortering (Mac-sortering)40, vilket är genomförbart efter hjärnan homogenisering. Med Mac-sortering neurala stamceller medför viss cell yta markörer kan märkas med magnetiska pärlor och sedan isoleras med hjälp av en magnetisk stå40. Efteråt kan cellerna odlade eller direkt användas för ChIP. Presenterade protokollet kan användas inte bara för neurala stamceller, men också för andra homogena cellpopulationer. Med tillägg av FACS eller Mac-datorer, kan protokollet tillämpas för alla isolatable celler inom en organism.
Sammantaget gör presenterade protokollet det möjligt att undersöka den Histon modifieringen H3K79me2 vid olika tidpunkter av kortikala och cerebellär utveckling i ett effektivt och reproducerbart sätt. Det kan vara tillämpliga på andra Histon ändringar ligger inom Histon kärnan och kan tillämpas på andra homogena celltyper i organismen. Eftersom H3K79me2 är en bevarade Histon ändring23, kan protokollet också vara lämplig att analysera H3K79me2 inte bara i möss men över olika arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen
Acknowledgments
Vi tackar Henriette Bertemes för att hjälpa till att upprätta protokollet CGN odling inom labbet. Denna metod papper stöddes av de DFG-finansierade CRC992 medicinsk epigenetik av finansiering till TV. Författarna erkänner stöd av Freiburg Galaxy Team: Pavankumar Videm, Björn Grüning och Prof. Rolf Backofen, bioinformatik, universitetar av Freiburg, Tyskland finansieras av Collaborative Research Centre 992 medicinsk epigenetik (DFG grant SFB 992/1 2012) och tyska förbundsministeriet för utbildning och forskning (BMBF grant 031 A538A RBC (de. NBI)).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GAPDH | Abcam | ab8245 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000 |
| Anti-H3 | Abcam | ab1791 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Anti-H3K79me2 | Diagenode | pAb-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP antibody |
| Anti-H3K79me2 | Abcam | ab-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000 |
| Anti-rabbit-IgG | Diagenode | C15410206 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody |
| Anti-Tubulin alpha | Abcam | ab108629 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Apo-Transferrin (1 mg/ml) | Sigma-Aldrich | T1147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| B27 Supplement (50x) | Life Technologies | 17504044 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Bioanalyzer | Agilent technologies | G2940CA | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin |
| Bioruptor NextGen | Diagenode | B01020001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Ultrasonicator |
| Boric acid pH 8.4 | Sigma Aldrich | B6768 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| CFX Connect RT PCR Detection System | Bio-Rad | 1855201 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR |
| DMEM-F12 | Life Technologies | 11320-033 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10001D | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP |
| EPZ-5676 | Selleckchem | S7062 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | SERVA | 39760.01 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: EDTA |
| Fetal Bovine Serum 10% (v/v) | Gibco | 10082147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Glutathione (1.25 mg/ml) | Sigma-Aldrich | G4251 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Glycine | Carl Roth | 3187 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For cell fixation |
| GoTaq mastermix | Promega | A6002 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-100 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: HBSS |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Lithium chloride | Sigma-Aldrich | L4408 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: LiCl |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| NanoDrop 3300 | Thermo Fisher | 3300 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification |
| NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645S | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | NEB | E7335 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| NP-40 Alternative | Calbiochem | 492016 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) | Life Technologies | 15640055 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010023 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation |
| PicoGreen Kit | Thermo Fisher | P11496 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma Aldrich | P3655 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Potassium chloride | Thermo Fisher | AM9640G | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: KCl, for CGM |
| Protease inhibitor | Roche | 4693159001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 3115879001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Qiagen MinElute | Qiagen | 28004 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification |
| RNAse | Sigma-Aldrich | R6513 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| SGC0946 | Selleckchem | S7079 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Sodium bicarbonate | Carl Roth | 8551.1 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: for Elution buffer |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Sodium dodecylsulfate | Carl Roth | 183 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP |
| Sonic hedgehock (SHH) | Sigma-Aldrich | SRP6004 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Superoxide dismutase (1mg/ml) | Sigma-Aldrich | S7571 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Carl Roth | 9090 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer |
| Triton X-100 | Carl Roth | X100 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) | Sigma Aldrich | 59417C | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation |
| Tween20 | Carl Roth | 28320 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For bead preparation |
| Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath | |||
| CCM: Cortical cell medium | |||
| CGM: CGNP cell culture medium |
References
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
- Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science. 290, 1113-1120 (2000).
- Götz, M., Sommer, L. Cortical development: the art of generating cell diversity. Dev. Camb. Engl. 132, 3327 (2005).
- Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. Epigenetic control of neural precursor cell fate during development. Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).
- Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372, 263-266 (1994).
- Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).
- McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254, 282-285 (1991).
- Desai, A. R., McConnell, S. K. Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development. Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).
- Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).
- Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
- Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).
- Sanders, S. L., et al. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell. 119, 603-614 (2004).
- Martin, C., Zhang, Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).
- Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).
- Ng, H. H., et al. Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association. Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).
- Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest. FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).
- Roidl, D., Hacker, C. Histone methylation during neural development. Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).
- Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure. Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).
- van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core. Cell. 109, 745-756 (2002).
- Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
- Woo Park, J., et al. RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20. Sci. Rep. 5, 12485 (2015).
- Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. , (2016).
- Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
- Feng, Y., et al. Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase. Blood. 116, 4483-4491 (2010).
- Cattaneo, P., et al. DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation. Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).
- Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
- Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).
- Roidl, D., et al. DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro. Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
- Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).
- Roidl, D. Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).
- Turner, B. ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , Institut national de la santé et de la recherche médicale. (2001).
- Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).
