Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Yalıtım ve sinirsel ataları Kromatin-Immunoprecipitation Histon 3 lizin 79 Dimethylation Mark tarafından takip tarımı

Published: January 26, 2018 doi: 10.3791/56631
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Institute for Anatomy and Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg

Summary

Biz yalıtmak ve nöral progenitör hücreler embriyonik ve postnatal beyin dokusundan Kromatin immunoprecipitation (ChIP) Histon 3 lizin 79 dimethylation (H3K79me2) - içinde yer alan bir Histon işareti için kültür için etkili ve tekrarlanabilir bir yöntem mevcut Histon 3 küresel etki alanı.

Abstract

Beyin gelişimi temporo-kayma bir şekilde morfojenlerdeki ve farklı transkripsiyon programları gradyanlar tarafından kontrol edilir karmaşık bir süreçtir. Ayrıca, gibi Histon metilasyonu, epigenetik Kromatin değişiklikler kurulması ve belirli hücre kaderi bu işlemde sürdürmek için önemli bir role sahiptir. Histon metilasyonu büyük çoğunluğu Histon değiştiriciler, silgi ve Histon okuyucu proteinlerin erişilebilen esnek Histon kuyruk üzerinde oluşur. Buna ek olarak, H3K79 metilasyonu Histon 3 küresel etki alanında bulunan ve farklı gelişim işlevlerinde karıştığı. H3K79 metilasyonu örümceklerle korunmuş ve türlerin geniş bir Homo sapiens Saccharomyces cerevisiaeiçin bulunabilir. Farklı hücre popülasyonlarının sinirsel ataları da dahil içinde değişiklik oluşur. Histon 3 küresel etki alanında H3K79 metilasyonu konumunu değerlendirmek zorlaştırır. Burada, biz izole etmek için yöntemler mevcut ve embriyonik kortikal beyin dokusu (E11.5-E14.5) veya serebellar taneli nöron ataları (CGNPs) Doğum sonrası doku (P5-P7) ve verimli bir şekilde immunoprecipitate (TBM) kültür kortikal progenitör hücre Kantitatif PCR (qPCR) ve genom çapındaki sıralama için H3K79me2.

Introduction

Beynin duyusal, motor ve Bilişsel işlevler son derece karmaşık ve fiziksel ve çevresel değişikliklere duyarlı. Beyin üç genel parçalar hind-, orta-ve ön, hangi derin bağlı oluşur. Ön içinde telencephalon dorsal telencephalon (DT) ve ventral telencephalon (VT) bölünmüş olabilir. DT farelerin, E11.5 ve E18.5 arasında bir "Inside-out" şekilde1' de kurulan altı kortikal Katmanlar oluşur. VT ganglionic efendiler gelişmede, daha sonra Bazal gangliyon2,3formu içerir. Çeşitli hücre tiplerinin nöronlar, astrocytes veya oligodendrocytes4, gibi memeli merkez sinir sisteminde temporo-kayma şekilde5' te geliştirmek sınıflandırılabilir. İlk olarak, nöral progenitör hücre (NPCs) nöronlar, interneurons VT ve projeksiyon nöronların farklı türde DT ve daha sonra üzerine gliyal hücreler (örneğin, astrocytes6) ortaya çıkmasına. Sırasında kortikal gelişim, en yüzeysel Katmanı (katman ben), hangi Cajal Retzius hücreleri içeren ilk oluşturulur. O zaman, E12.5 ve E14.5 arasında NPCs derin nöronal katmanları (VI, V) iken üst katmanı (IV-II) nöronlar7,814.5 ve 16.5, ataları vermek yükselişi arasında oluşturmak. Nöronal kimlik farklı morphogen kaynaklı temporo-kayma transkripsiyon program tarafından ve ayrıca epigenetik programları2tarafından belirtilir.

Motor koordinasyon içinde karıştığı, beyincik, arka beyin içinde yer alan ve E10 ve kabaca P20 arasında fare9' geliştirir. Serebellar korteksin ve serebellar çekirdeği10içerir. Yetişkin serebellar korteksin üç kat, en dıştaki moleküler katmanı, Purkinje hücre katmanı ve taneli nöronlar10içeren en içteki taneli katman oluşur. Serebellar granül hücre en küçük nöronlar vardır ve tüm omurgalı beyin11nöronlarda yaklaşık % 80'i temsil eder. Onlar üzerinden dış germinal bölgede bulunan öncüleri geliştirmek ve onların hedef12Purkinje hücre katmanı üzerinden göç. Telencephalon, beyincik geliştirilmesi birkaç önemli morfojenlerdeki tarafından düzenlenmiştir gibi hangi-si olmak belirli zaman ve uzay bağımlı görev ve başlatmak transkripsiyon programlar10tanımlı.

Kortikal ve serebellar katmanları gelişimi belirli morfojenlerdeki transkripsiyon ifadesi tarafından ve böylece, DNA'ın Kromatin devlet tarafından kontrol edilir. Basitleştirilmiş bir görünümde, Kromatin Birleşik transcriptionally etkin olarak euchromatin ve heterochromatin transcriptionally sessiz bölgeleri olarak ayrılabilir. Kromatin temel birim olarak nucleosome her çekirdek Histon H2A, H2B, H3 ve H4, DNA13147 baz çifti tarafından çevrili iki kopyasını içerir. Histon metilasyonu, asetilasyon, fosforilasyon, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, Deaminasyon ve prolin isomerization14,15tarafından son derece post-translationally değiştirilir. Histon lizin metilasyonu transkripsiyon, çoğaltma, Rekombinasyon16, DNA hasarı yanıt17ve genomik sürecinden18denetler en istikrarlı Histon değişiklik olarak kabul edilir. Lysines mono-, di- veya üç metillenmiş19 olması ve sadece erişilebilir Histon kuyrukları üzerinde aynı zamanda Histon20küresel etki alanı içinde görünür. H3K4 ve H3K36 belirli methylations euchromatin ile ilişkili, belirli methylations H3K9, H3K27 veya H4K20-esas olarak bulundu heterochromatic bölgelerde, her ne kadar tüm artıkları Histon kuyruk14içinde, yer alan 19,21. H3K79 metilasyonu Histon küresel etki alanı içinde yer alan ve transkripsiyon etkinlik, ama aynı zamanda transcriptionally etkisiz genomik bölgeleri22ile ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Maya, buzağı timus, tavuk ve insan23gözlenmiştir beri değişiklik örümceklerle korunmuş. H3K79 mono, di ve trimethylation (H3K79me1, me2, me3), Histon methyltransferases DOT1L24,25 ve26nükleer SET etki alanını içeren Protein 2 (Nsd2) tarafından katalize. DOT1L nükleer silahların yayılmasına karşı DNA tamiri ve27REPROGRAMING hücresel karıştığı. Dot1l kaybı farelerde çevresinde gelişimsel sahne E10.528,29doğum öncesi bir ölüme yol açar. Kalp Geliştirme sırasında ve myocardiocyte ayrımında DOT1L gen ifade Yönetmeliği30için esastır. Merkezi sinir sistemi DOT1L işlevi Nöral tüp geliştirme31' karıştığı, Tbr1bastırmak ilgilenmektedir-ön geliştirme32sırasında ifade ve ER-stres yönetmelikte çalışmayabilir Yanıt genler33. İçerik bağımlı etkinleştirme veya özellikle merkezi sinir sistemi gelişimi gibi vivo içinde durumlar ile H3K79me, bastırmak eylem için kısmen32anladım sadece tarihidir. H3K79 metilasyonu Histon 3 küresel etki alanında bulunduğundan, bu sterically daha az esnek Histon kuyrukları23değişiklikler ile karşılaştırıldığında erişilemez. H3K79 metilasyonu işlevini anlamak için güvenilir ve tekrarlanabilir analiz yöntemleri konumu ve genomik çevre belirlemek için gereklidir. Bu yöntemleri yazıda, biz izolasyon yöntemleri farklı sinirsel ataları (korteks için TBM'ler) ve CGNPs için beyincik, etkili DOT1L inhibitörü tedavisi ve bir çip yöntem H3K79 metilasyonu yolu ile qPCR ya da sıralama farklı zamanda analiz etmek için mevcut Puan kortikal ve serebellar geliştirme sırasında. Protokol ve olanakların genel bakış için bkz: şekil 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvan refahı Komiteler Freiburg Üniversitesi ve yerel yönetimler aşağıdaki iletişim kuralında belirtilen tüm hayvan deneyleri (G12/13, G16/11) onayladı.

1. hazırlıkları

  1. TBM yalıtım hazırlıkları
    1. (E11.5-E14.5 arası) korteks gelişiminin farklı aşamalarında embriyo elde etmek için çiftleşme Zamanı ayarlanmış kurmak. En az 8 hafta eski olan fareler baskı NMRI (deniz Tıbbi Araştırma Enstitüsü) kullanın. Çiftleşmeden sonra erkeğini, olumlu bir vajinal tak E0.5 de göz önünde bulundurun.
    2. Yeterli malzeme için bir H3K79me2 küçük parça--dan cortices E12.5 veya E14.5 için bir çöp NMRI farelerin kullanın. Daha sonra embriyonik aşamaları için bir çöp daha fazla çip analizleri için kullanın (ortalama çöp büyüklüğü NMRI: 10 embriyo).
    3. Hank´s dengeli tuz çözüm (HBSS) ve fosfat tamponlu tuz (PBS) 4 ° c (uzun dönemde veri RT at) precool.
    4. Equilibrate 4 ° C tripsin-EDTA depolanan (% 0.05 w/v) 37 ° c
    5. Hazırlama kortikal hücreli orta (CCM): (Bkz. Tablo reçetesi) nöronlar için orta %2 (v/v) B-27 ek 5 µg/mL Apo-Transferrin, 1 µg/mL glutatyon, 0,5 mM L-glutamin, 0.8 µg/mL süperoksit dismutaz ve %1 (v/v) son konsantrasyonları ile ek Penisilin-streptomisin-paromisin antibiyotik karışımı. 4 ° C'de depolayın Deneme için orta 37 ° c olarak equilibrate
    6. Fetal buzağı serum (FCS), aliquot çözülme bu (50 mL her) ve 37 ° c (uzun süreli depolama-20 ° c) bir aliquot equilibrate.
    7. Dnaz 1 (10 mg/mL) hisse senetleri H2O hücre kültürü için hazır olun. Aliquots-20 ° C'de depolayın
    8. Gerekirse, belirli DOT1L inhibitörleri EPZ-5676 veya SGC0946 DMSO içinde hisse senedi toplama 100 mm için geçiyoruz. 1-5 µM son konsantrasyon hücrelere 0 gün uygulayın ve engelleyici her iki günde yeniden uygulayın.
    9. TBM ekimi için hücre kültür tabak (6 iyi veya 12 iyi) en az 1 h RT için Poli-L-ornithine hydrobromide (1 mg/mL 150 mM Borik asit pH 8.4) ve daha sonra laminin (1 mg/mL) ile 37 ° C'de CCM ortamda gecede kat.
  2. CGNP yalıtım hazırlıkları
    1. P5-P7 hayvanlar beyincik (ChIP ve koşul başına 3-5 hayvanlar) yalıtım için oluşturmak için fare bir uygun çiftleşme düzenleyin.
    2. HBSS/glikoz 6 mg/mL ekleyerek glikoz HBSS arabellek için hazırlayın.
    3. CGNP hücre kültür orta (CGM) % 1 (v/v) N2 ek, DMEM-F12 için % 1 ' (v/v) penisilin-streptomisin-paromisin, 25 mM KCl ve % 10 FCS ekleyerek hazırlayın. CGNP ekimi CGM orta olmadan FCS ama 0.6 µg/mL sonic kirpi (SHH) (CGM-ŞŞŞ) dahil olmak üzere hazırlamak ve gerektiğinde 37 ° C ile equilibrate.
    4. 6-iyi hücre kültür pilakalar ve 100 µg/mL Poli-D-lizin RT 1-2 h glia hücreli kaldırılmak için kat. Daha sonra iki kez steril GKD2ile O yıkama ve kuru plakaları izin. En fazla bir hafta 4 ° C'de plakaları depolamak
    5. CGNPs kat 6-şey hücre kültür pilakalar ve poli-L-Ornitin (0.1 mg/mL) 4 ° C'de tarımı için bir gecede. Daha sonra iki kez ile H2O hücre kültürü için yıkama ve kuru plakaları izin.
      Not:-Ebilmek var olmak stok plakaları 4 ° C'de en fazla bir hafta için
    6. % 0,025 tripsin (w/v) HBSS/glikoz hazırlamak ve gerektiğinde 37 ° C ile equilibrate.
  3. H3K79me2 çip hazırlıkları
    1. PFA (PBS, pH %8 1) taze crosslinking Kromatin önce hazırlayın. Hazırlamak için İngiltere'de yılın ısı 50 mL PBS mikrodalga ile en fazla 65 ° c Sırasında sürekli karıştırmaya 0.5 mg PFA PBS için eklenir. Daha sonra 50 µL ekleyin 10 M NaOH ve İngiltere'de yılın eriyene kadar bekle. Daha sonra 42,5 µL eklemek HCl (% 37 v/pH 8 değeri almak için v). PH yeniden doğrulamak ve sonra izin % 1 İngiltere'de yılın çözüm ulaşmak RT.
    2. Hisse senetleri hazırlamak RNase (1 mg/mL) ve İndinavir K (20 µg/µL) ayrı ayrı içinde steril GKD2O. aliquots-20 ° C'de depolayın
    3. Aşağıdaki arabellekleri ve Kimyasalları hazırlamak: %0,02 içeren PBS ara, lizis arabellek, glisin, seyreltme arabellek, arabellek 1, ChIP tampon 2, ChIP tampon 3 ve TE tampon ChIP ve 4 ° C'de saklamak Elüsyon arabellek taze her zaman hazır olun.
      1. %0,02 içeren PBS hazırlamak ara. Çoğu bir haftalık 4 ° C'de için mağaza
      2. 50 mM Tris pH 8.0, 10 mM EDTA, %1 (w/v) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) ve 1 x proteaz inhibitörü kullanarak lysis arabellek hazırlayın.
      3. 2.5 M glisin hazırlayın.
      4. Seyreltme arabelleği (v/v) Triton X-100 20 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, % 1'i kullanarak, %0.25 (w/v) SDS ve 1 proteaz inhibitörü x hazırlamak.
      5. ChIP tampon 1 (v/v) Triton X-100 20 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, kullanımı % 1 ve % 0.2 (w/v) SDS hazırlayın.
      6. ChIP tampon 2 (v/v) Triton X-100 %1 20 mM Tris pH 8.0, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, kullanımı ve % 0.2 (w/v) SDS hazırlayın.
      7. ChIP tampon 3 (v/v) NP-40-%1 20 mM Tris pH 8.0, 250 mM LiCl, 2 mM EDTA, kullanımı ve %1 (w/v) SDS hazırlayın.
      8. TE arabelleği 20 mM Tris pH 8.0 ve 2 mM EDTA kullanarak hazırlayın.
      9. %1 (w/v) SDS, 100 mM NaHCO3içeren taze elüsyon arabellek hazırlayın.

2. nöral progenitör yalıtım beyin dokusunun

  1. Yalıtım ve isteğe bağlı TBM'leri tarımı
    1. Hamile hayvanlar tarafından servikal çıkığı ötenazi ve buz gibi HBSS için embriyo transfer.
    2. Makasla kafatasını ve beyin izole, o zaman mümkünse küçük forseps ve küçük forseps kullanarak dürbün kapsamı altında diğer tüm beyin parçaları kaldırarak her iki hemisferlerin ayrı tut cortices (bütün, DT veya VT) ile ve meninkslerde kaldırmak gerekirse, küçük makas. İzole cortices 5 mL HBSS arabellek 15 mL tüp içinde 4 ° C'de depolayın.
    3. İzole beyin malzeme 1.000 x g ve 4 ° c'de 5 dk santrifüj kapasitesi
    4. Cortices 5 mL ile yıkayın buz gibi HBSS ve onları yukarı ve aşağı pipetting 1 mL pipet ucu ile homojenize. Gerekirse, pipet ucu ucu kesilmiş.
    5. Homojenize örnek için 1000 x g ve 4 ° c'de 5 dk santrifüj kapasitesi HBSS kaldırın.
    6. 3 mL tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 5 min için örnek kuluçkaya
    7. 1 mL FCS, 5 mL CCM ve 30 µL Dnaz 1 için örnek ekleyin ve dikkatlice yukarı ve aşağı pipetting tarafından örnek bir 5 mL cam pipet ile homojenize.
    8. 1000 x g ve 4 ° c, izole hücreler için 5 dk santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak, 5 mL CCM ekleyin ve tekrar örnek homojenize.
    9. Bir aliquot örnek sulandırmak ve bir Neubauer sayma-odası ile saymak. 4.5 x 106 hücre başına embriyo bir ortalama tutarı bekleniyor. İzole TBM'leri ekimi için adım 2.1.10 ile devam edin. Çip için hemen adım 3 ile devam edin.
    10. Ekimi, plaka TBM'leri Poli-L-Ornitin (0.1 mg/mL) ve laminin (1 mg/mL) kaplı bir yoğunluk arasında 8 x 104 ve 2.5 x 105 hücreleri/cm2 CCM orta'yemekleri ve 37 ° C, % 5 CO2ve %100 bağıl nem kuluçkaya.
    11. Hücre kültürü nöronların içine (yaklaşık 4 gün sonra) ayırt etmek TBM başlatmak beri diseksiyon tarihi gün vitro 0 (0 gün) olarak düşünün. Daha uzun yetiştirme açısından orta yarısı dördüncü hergün taze CCM orta ile değiştirin.
    12. 1-5 µM uygulamak SGC0946 ya da EPZ5676 gün 0 (4-5 h hücre izolasyon sonra), DMSO içinde çözünmüş ve iki günde yenileyin. DMSO bir denetim tedavi olarak kullanın. Gerekirse inhibitörü tedavisi ile standart immunoblot yöntemleri, etkinliğini test.
  2. Yalıtım ve isteğe bağlı CGNPs tarımı
    1. P5-7 hayvanlar makas kullanarak işten çıkarma tarafından ötenazi. Kafa derisi deri kaldırmak, kafatası açın ve küçük makas ve forseps kullanarak beyin çıkarın. Beyincik yalıtmak ve buz gibi HBSS/glikoz için transfer. Ve soğuk HBSS/glikoz ile dolu 15 mL tüpler içine cerebella transfer tüm zarları ve kan damarları çıkarın.
    2. Cerebella 10 mL ile üç kez yıkayın buz gibi HBSS/glikoz (onları toplamak Santrifüjü 650 x g 4 ° C'de 5 min için de tarafından) ve cerebella daha sonra yavaşça yukarı ve aşağı 1 mL pipet ile pipetting tarafından homojenize (en fazla 2 - 3 kez) 0.5-1 almak için mm3 parçaları.
    3. HBSS/glikoz % 0,025 tripsin 5 mL ekleyin ve 5 mL CGM de ekleyerek 15 dk. Stop sindirimi için 37 ° C su banyosunda sürekli karıştırma altında doku kuluçkaya ve doku tarafından Santrifüjü 650 x g 4 ° C'de 5 min için de toplamak
    4. Ve 1 mL damlalıklı bahşiş 1 ml CGM dokuyla triturate ve yeni bir 15 mL tüp transfer süpernatant çıkarın.
      Not: Hava kabarcıklarını önlemek önemlidir.
      1. 5 mL CGM ekleyin ve karışımı doku kalıntıları yerleşmek için buz üzerinde 2 min için kuluçkaya. Süpernatant yeni 15 mL tüp içine aktarın. 2 mL CGM kalan doku ekleyin ve toz yordamı yineleyin.
    5. Supernatants (olmadan doku kalıntıları, toplamda yaklaşık 10 mL) havuz ve 650 x g 4 ° C'de serebellar hücreleri toplamak için 5 min için de santrifüj kapasitesi. Pelet 10 mL CGM resuspend.
    6. Astrocytes daha hızlı ve daha güçlü Poli-D-lizin CGNPs daha uygun beri 100 µg/mL Poli-D-lizin kaplı 6-iyi-tabaklar hücrelerdeyse plaka (ilâ 4 mL iyi başına) ve 37 ° C'de astrocytes kaldırmak için 20 dk için kuluçkaya.
    7. Plaka sallamak ve süpernatant toplamak. O zaman vasıl 650 x g 15 mL tüp içinde 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi. Pelet 10 mL CGM resuspend ve hücreleri bir Neubauer odası sayma saymak.
      Not: CGNPs küçük yuvarlak, ve faz kontrast mikroskobu kullanarak yansıma bir hale göstermek.
    8. Eğer gerekli, tohum 37 ° C hücrelerinde CGM Poli-L-Ornitin-kaplamalı plakalar (6-şey başına 3 x 106 hücre) üzerinde önceden ısıttı ve 37 ° C, % 5 CO2 ve %100 bağıl nem kuluçkaya.
      Not: tohum gerçekleştirilmez, 3.1 adıma geçin.
      1. 6-12 h sonra orta olarak CGM-ŞŞŞ değişimi. İzole CGNPs 6 h tedavi (ya da CGM-sus için değişen) yalıtım DOT1L inhibitörü ve DMSO ile sonra kontrol ve her iki günde (2.1.12 ile karşılaştırın) yenilemek. Gerekirse inhibitörü tedavisi standart immunoblot yöntemleri ile etkinliğini test. Küçük parça için adım 3.3 ile devam edin.
        Not: CGM plakalar üzerinde (ve o FBS) bırakarak CGNPs ayrımında serebellar taneli nöronlar (CGNs) içine neden olur.

3. hücre ve Kromatin yamultma fiksasyonu

Not: hücreleri değil kültürlü 3.1 ve 3.2 adımları gerçekleştirin, onlar ise 3.3 adıma geçin.

  1. Santrifüjü 4 dk 1000 x g de tarafından hücreleri toplamak ve 1.3 mL PBS ekleyin. Örnek bir 1,5 mL tüp aktarın. 1000 x g 4° C'de, 4 dk santrifüj Örnek 1.3 mL PBS ile iki kez yıkayın.
  2. Kritik adım: 350 µL % 1 eklemek PFA örnek ve 22 ° C'de 5 min için kuluçkaya Reaksiyon durdurmak için 18,4 µL glisin ve 1 mL PBS ekleyin. Örnek için 1000 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi
    1. Örnek iki kez buz gibi PBS ile yıkayın. Santrifüjü 1000 x g de 5 min ve 4 ° c için tarafından sabit hücreleri toplamak Buz üzerinde örnekleri şu andan itibaren devam et.
      Not: En iyi sonuçları elde etmek için tam 5 dk fiksasyon zaman olması gerekir. Farklı hücre sayıları zaman uyarlamalar gerektirir.
  3. Kritik adım: Kültürlü CGNPs (TBM'ler), ilâ 1 mL % 1 ekleme PFA doğrudan hücre kültür plaka wells için. Sonra 5 dk kuluçka 22 ° c, glisin ve PBS uygun bir miktarda ekleyin ve hücreleri hücre sıyırıcı hasat.
    1. Hücreleri 1,5 mL tüpler içine aktarmak ve örnek için 1000 x g ve 4 ° c'de 5 dk santrifüj kapasitesi Örnek iki kez buz gibi PBS ile yıkayın. Tarafından Santrifüjü 5 minat 1000 x g 4 ° C'de sabit hücreleri toplamak Buz üzerinde örnekleri şu andan itibaren devam et.
  4. Kritik adım: 700 µL lizis arabellek (+ proteaz inhibitörü) ekleyin ve örnek 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya Girdap örnek her 5 dk. lysed hücre sonicator (30 s darbe, 30 s Duraklat) maksimum güçte 3 x 10 dk Kromatin kesme.
    1. Birimin tüp başına 350 µL aşmaz olun. Girdap örnekleri her 10 dk. faz kontrast mikroskopla lysate kalan çekirdeklerin için kontrol edin.
      Not: Daha sonraki analizler için en uygun kesme sonuçları ( 1B rakamile karşılaştırın) elde etmek önemlidir. Kromatin yamultma için diğer yöntemleri kullanarak durumunda, 200-500 bp arasında boy Kromatin parçaları için kesme optimize edin.
  5. Hücre kalıntıları 10 dk, 13.000 x g, 4 ° c için cips Süpernatant preclearing adım 5.2 için kullanın. -20 ° c daha sonra kullanmak örnek gerekirse dondur.

4. boncuk ve Preclearing hazırlanması

  1. 45 µL manyetik boncuklar ChIP/protein A ve 20 µL manyetik boncuklar/örnek %0.02 içeren 1 mL buz gibi PBS ile yıkayın üç kez manyetik bir stand kullanarak ara. Sonra buz gibi PBS 1 mL boncuk için ekleyin.
  2. 1 mL buz gibi PBS ve 45 µL boncuk/ChIP, antikor/Chip (H3K79me2 ya da tavşan IgG) 3 µg ekleyin. Örnekleri boncuk için antikorlar bağlamak için bir rotator üzerinde 4 ° C'de 2 h için kuluçkaya. Antikor bağlı olarak ~ 3 µg antikor/ChIP kullanın.
  3. Antikor bağlı boncuk üç kez %0.02 içeren 1 mL buz gibi PBS ile yıkayın ara. (Kullanılan manyetik boncuklar hacmi başlayarak) uygun boncuk birim buz gibi PBS yıkanmış antikor-birleştiğinde-boncuklar için ekleyin.
  4. (Toplam hacim 1,320 µL) preclearing için örnek 600 µL seyreltme arabelleği ve yıkanmış manyetik boncuklar 20 µL ekleyin ve bir rotator üzerinde 4 ° C'de 2 h için kuluçkaya. Manyetik bir stand kullanarak boncuk kaldırın. %5 (33 µL) giriş örnekleri olarak lysates almak ve bunları-20 ° C'de dondurmak

5. Kromatin Immunoprecipitation

  1. Precleared özü iki tüpler (yaklaşık 643.5 µL) içine bölmek, aynı hacmi seyreltme arabellek ve antikor-bağlı-boncuk (45 µL/örnek; Ekle H3K79me2 veya tavşan IgG). Gecede bir rotator üzerinde 4 ° C'de örnekleri kuluçkaya.
  2. Bir rotator üzerinde 4 ° C'de boncuk buz gibi ChIP tampon 1, ChIP arabellek 2 ve 10 min için ChIP tampon 3 ile yıkayın. Daha sonra üç kez TE arabellek bir rotator üzerinde 4 ° C'de 5 dakika yıkayın.
  3. Boncuk oda sıcaklığında bir shaker 1400 rpm'de 1 h için elüsyon arabellek ile elute.
  4. 10 µg RNase çip örnek başına (1 mg/mL) ve 5 µg giriş örnekleri ekleyip örnekleri 30 dk 37 ° C'de (1400 rpm) için kuluçkaya.
  5. 100 µg İndinavir K ekleyin (20 µg/µL) başına ChIP örnek ve giriş başına 50 µg ve gecede 1400 rpm'de 65 ° C'de kuluçkaya.

6. arıtma yonga örnekleri

  1. ChIP ve DNA arıtma ile giriş örnekleri arındırmak ( Tablo malzemelerigörmek) kit kılavuzuna göre. DNA'ın 5'ten fazla µg beklendiğinde daha fazla arıtma sütunları kullanın. 2 x 15 µL kit ile sağlanan DNA elüsyon arabelleği ile örnek elute.
  2. Miktar (kullanmak 1 µL) örneklerinin görüntülenmesi bir fluorophore ve bir fluorospectrometer kullanarak gerçekleştirmek ( Tablo malzemelerigörmek).

7. analiz yonga örnekleri ile qPCR

  1. QPCR analiz için astar tasarım için bütünleştirici genomik Viewer (IGV) tarayıcı34genom dizileri ilgi almak. H3K79me2 orada bulunduğu büyük olasılıkla bu yana astar çevresinde bir gen, transkripsiyon başlangıç sitesi (TDH) tasarlayın. Bir denetim olarak kodlamayan genomik düşünün bölgeler ve bölgeler 10 Kb akıntıya karşı TSS veya transkripsiyon sonuna 10 Kb aşağı sitesi (TES).
    1. Astar https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 70 ve 200 bp arasında bir ürün boyutu kullanarak oluşturun ve en uygun bir sıcaklık 60 ° c önceden Deneme amaçlı, astar genomik bölgelerin Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3 ve Npm1 Tablo 1' de listelenen kullanın.
  2. Aşağıdaki qPCR programı, ana mix ve 58 ° C ve 63 ° C arasında bir tavlama sıcaklığı degrade ile yeni tasarlanmış astar test ve tavlama sıcaklığı en yüksek ürün miktarı ve kalite ile seçin.
    1. Beklenen ürün boyutunu denetlemek için DNA Jel Elektroforez uygulamak. QPCR analiz için gerçek zamanlı PCR algılama sistemi kullanın (bkz. Tablo malzeme).
    2. 10 µL DNA polimeraz ana mix, 0.5 µL astar ileri (10 µM), 0,5 µL astar ters (10 µM), 4 µL nükleaz ücretsiz su ve 5 µL DNA ana karışımının hazırlamak (1 ng/µL).
    3. 2-adım qPCR programı aşağıdaki gibi kullanın: 5 min 95 ° c, 50 x (30 s 95 ° c, 30 s 58 ° C - 63 ° c) ve sürekli 4 ° C'de denatürasyon gradyan
  3. Genomik, yamultulmuş, saf DNA örnekleri (2 ng/µL, 1 ng/µL, 0,5 ng/µL, 0,25 ng/µL ve 0,125 ng/µL) seyreltme serisi oluşturmak ve 5 µL qPCR kullanarak bir verimlilik testi için kullanın. Standart eğrinin eğimini belirlemek ve astar verimliliği aşağıdaki formülle hesaplar:
    Verimlilik (%) = (10^(-1/slope)-1) * 100.
    1. Astar ile verimliliği % 90 ve %105 ideal bir durumda ya da arasında kullanın en az % 85 ve % 115 arasında verimliliği ile.
  4. ChIP ve giriş örnekleri analiz uygulamak 0.1-1 ng çip DNA'ın karışık ile ilgili ileri ve geriye doğru astar, nükleaz ücretsiz su ve DNA polimeraz master mix 20 µL her qPCR reaksiyon için son bir hacim içinde.
  5. ChIP ve giriş örnekleri eşik döngüsü (Ct) değerlerini belirlemek ve zenginleştirme (% giriş) aşağıdaki formül ile hesaplamak için giriş Ct değerleri için Ct örnek normalleştirmek. Arka plan düzeyini belirlemek için IgG denetiminden elde edilen kullanım Ct değerler.
    % giriş = 100-2^(döndük giriş − norm. ChIP)
    norm. giriş Ct (giriş) − günlük2(seyreltme faktörü) =
    norm. Çip Ct (ChIP) − günlük2(seyreltme faktörü) =
    Not: norm. = Normalleştirilmiş

8. analiz yonga örnekleri sıralama yoluyla

  1. Yonga örnekleri (giriş ve immunoprecipitated DNA örneği) bir sıralama tesisine transfer.
  2. Bir uygun Kütüphane hazırlık ( Tablo malzemelerigörmek) kiti ve 2 dönüştürmek bir kütüphane önceden, kullanım hazırlamak için ng giriş DNA immunoprecipitated DNA dizin oluşturulmuş kitaplıklar için en yakın üretme içine her şeyi üzerinde sıralama multiplex ve Platform göstermiştir ( Tablo malzemelerigörmek).
  3. Kritik adım: Kiti yönergeleri izleyerek sıralama adaptörler (15 µM bir çalışma konsantrasyonu ile) tamir ve dA kuyruklu DNA parçalarının sonuna kadar ligate. Sıralama adaptörleri ve PCR için astar uygun oligos ( Tablo malzemelerigörmek) kullanın. Giriş DNA bu miktar için 6-9 PCR döngüleri bakmaksızın adaptör DNA parçalarının zenginleştirmek için kullanın.
    Not: Normalde, o bir boyut seçim bakmaksızın adaptör DNA'ın gerçekleştirmek gerekli değildir. Birçok PCR güçlendirme devir sonucu PCR çoğaltmaları ve yüksek bir GC önyargı beri mümkün olduğunca az PCR döngüleri kullanmak en iyisidir.
  4. Son Kütüphane için uygun bir aygıt üzerinde boyut dağılımını görselleştirmenizi analiz için toplam reaksiyon 0.5 µL çek ( Tablo malzemelerigörmek). Miktar için bir fluorospectrometer ya da diğer yöntemleri ( Tablo malzemelerigörmek) ile birlikte görüntülenmesi bir boya kullanın.
  5. H3K79me2 daha büyük genomik bölgeler üzerinde geniş yayılmış bir Histon değişiklik gibi görünüyor bu yana örnekleri eşleştirilmiş-son okuma uzunluğu 50 sıra bp ve 75 Mio okuma sıralama derinliği olan.
  6. Galaxy/Uni Freiburg sunucu (galaxy.uni-freiburg.de) ile ChIP-seq veri analiz.
  7. Kalite kontrol FastQC ile elde edilen ChIPseq ile gerçekleştirmek ve uygunsa, doğrudan Bowtie2 sürümü 2.2.035 veya düzeltme olmadan ile eşleştirin. Genom derleme başvurmak mm9 veya en yeni sürüm mm10; ve 79 Ensembl FTP başvuru ek açıklama bırakın.
  8. İsteğe bağlı: Kaldır Picard MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard) kullanarak Yinelenenleri tepe aramadan önce okuyun.
  9. Tepeler için H3K79me2 'geniş' seçeneğini kullanarak MACS2 sürüm 2.1.036 ile çağırın.
  10. Oran her iki örnekleri arasında ChIP ve giriş örnek, okuma, okuma sayısı günlük2 günlük2 oranı elde etmek için BamCoverage ve BamCompare kullanın.
  11. DeepTools2 sürüm 2.3.5 veya 2.4.137, çip tahmin etmek için kapsama parça dosyaları (bamCoverage) yongası yalnızca, bamCompare çip karşılaştırma için giriş için oluşturmak için Yani tüm diğer derinlemesine ChIP-seq belirli bir analiz için geçerlidir performans plotFingerprint ve genel bir bakış oluşturmak için computeMatrix, plotHeatmap kullanır. K-computeMatrix işlemi sırasında kümeleme H3K79me2 dağıtım göre genomik bölgeleri kümelemek için ortalama seçin.
  12. Kullanım H3K79me2 E14.5 NCBI deneme amaçlı yatırılır DT olarak ChIP-seq veri yayınlandı (üyelik numarası: SRP057733).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nöral progenitör yalıtım, ekimi, H3K79me2 ChIP ve çipi analiz yöntemleri genel düzeni: H3K79me2 çip kortikal progenitör hücre embriyonik beyin gelişimi sırasında farklı zaman noktalarda veya serebellar taneli nöron ataları, postnatal aşamalarında gerçekleştirmek için bir akış şeması şekil 1 gösterir. Bir ilk adım olarak beyin izole olmak zorunda ve telencephalon (E11.5-E14.5 arası) veya beyincik (P5-P7) alınması gerekir. DT ve VT. bölerek telencephalon farklı bölgelerinde analiz etmek mümkündür Daha sonra doku homojenize ve sinirsel ataları ayrılmış. Şimdi, progenitör hücre kültür ve onları DOT1L inhibitörleri ile tedavi mümkündür. Başka bir olasılık ataları doğrudan tamir ve onları çip yordamına tabi olmaktır. Çip için Kromatin 200-500 bp parçalara nın yaşadığı ve daha sonra H3K79me2 karşı antikor manyetik boncuklar birleştiğinde ile inkübe. Boncuk yıkama ve DNA alma sonra zarlarını DNA sıralama veya qPCR (şekil 1A) tarafından çözümlenebilir. Parça boyutu DNA Jel Elektroforez ile veya diğer yöntemleri (örnek şekil1b) ile kontrol etmek için tavsiye edilir böylece kesme sonra iyi boyutu dağıtım Kromatin parçalarının olması esastır. Genom çapındaki sıralama seçerken, ChIP-seq-okuma H3K79me2 doluluk için bir fastq dosyası olarak daha ayrıntılı bir çözümleme için (şekil 1 c) sağlanacaktır. Nasıl yapılacağını kalitesini FastQC uygulama tarafından değerlendirilmesi gereken okur ve gerekirse, fastq dosyaları TrimGalore kullanarak kesilmiş olabilir. Eşleme Mus musculus genom mm9 veya mm10 Bowtie2 ile gerçekleştirilen ve PlotFingerprint yolu ile kontrol. MarkDuplicates Yinelenenleri kaldırmak için ve BamCoverage tarafından okuma normalize etmek ve giriş örnekleri çip BamCompare ile karşılaştırmak için tavsiye edilir. ChIP-seq okuma görüntülenmeyecektir genom geniş heatmaps veya gene-wise bütünleştirici genomik Viewer (IGV) tarayıcı oturumları daha sonra olabilir.

TBM kültür ve DOT1L inhibisyonu: TBM izole ve gün 0 ve 2 gün 5 µM DOT1L inhibitörü SGC0946 ile tedavi edildi. Solvent DMSO bir denetim olarak kullanıldı. 3. gün, TBM'leri hasat edildi, protein izole, sayısal ve immunoblot (şekil 2A) yolu ile analiz. Şekil 2A H3K79me2 seviyeleri etkili TBM kültür ve DOT1L inhibisyon bir etkili önleyici tedavi şeması sağlanması üç gün sonra azalma gösterir. H3, GAPDH veya tübülin-Alfa denetimleri yükleme olarak hizmet veren protein miktarı böylece zayıflatmak değildi. Apoptozis ve HuC/D nöronal hücre görüntülenmesi için algılamak için active caspase 3 (CASP3 +) karşı antikor ile sabit TBM'leri Immunostaining TBM'leri bu tedavi ile kültür, üç gün sonra artan hücre ölümüne yol açtı DOT1L inhibitörü gösterildiği gibi gösterilir şekil 2B. Miktar CASP3 olan hücrelerin +/ DAPI + ya da HuC/D + / DAPI + TBM kültür içinde ortaya programlanmış hücre ölümü üzerine DOT1L inhibisyon açığa CASP3 + hücre önemli bir artış. HuC/D-pozitif nöronlar, sayısı ancak değişmeden (şekil 2C) kaldı.

H3K79me2 ChIP-qPCR, Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3 ve Npm1 TBM'leri üzerinden DOT1L inhibitörü ile tedavi: DOT1L SGC0946 inhibitörü tedavisi verimli ve H3K79me2 bir azalma, özel led olsaydı sınamak için genler, qPCR 3 gün boyunca tedavi TBM ardından bir çip çözümleme yapılır. Tavşan IgG çip denetimi olarak kullanıldı. Bu H3K79me2 de, nükleer taşıma gen Npm133,38endoplasmatic stres yanıt veren genler Aft4, Ddit3, Scd1 ve Aft3 yer alır bilinmektedir beri kullandığımız qPCR astar kaplama TSS, TES ve gen organları içinde genomik bölgeler H3K79me2 dağıtım DOT1L inhibisyon (şekil 3A) sonra farklılıkları belirlemek için. Böylece üç gün DOT1L inhibisyonu için önemli bir yol Atf4, Ddit3 ve Npm1 inhibitörü tedavisi için en duyarlı gibi genlerin H3K79me2 düzeyi yüksek olan H3K79me2 ilk etapta azaltın. Atf3 ve Scd1, gibi daha düşük bir H3K79me2 kapsama ile gen H3K79me2 seviyelerinde hiçbir önemli değişiklik gösterdi.

H3K79me2 genel bakış ChIP-seq analizi: Genom çapında çözümleme TBM'leri üzerinden gerçekleştirilen ve sunulan şemaları ve iletişim kuralları (şekil 1) göre analiz E14.5, H3K79me2 düzeyleri çok yüksek kaliteli çip ortaya. Oysa onların frekans parmak izi leke (şekil 4A), giriş okur sıralanır dönüştüm sayıları eşit olarak dağıtılmış olup, H3K79me2 sayıları başarılı görüntüler zenginleştirme, belirli bölgeler (depo) 1 ile sıralanır, gösterdi Kromatin parçaları H3K79 değiştirilme tarihi birikimi. H3K79me2 bir heatmap genler kendi TSS ve onların TES arasında ve 10Kb akış yukarı veya aşağı akım +/-boyunca o H3K79me2 doruklarına TSS çevresinde (şekil 4B) gösterir ve doğru TES genel olarak azalmıştır. Tamamen H3K79me2 ile kaplıdır, genler ve TSS bölge içinde yalnızca bir tepe var gen vardır. Endoplasmatic-stres ile ilgili genler gibi Atf4, Ddit3 ve nucleophosmin Npm1 Limanı, örneğin, bir H3K79me2 düzeyi yüksek (şekil 4 c) bütün gen vücut sadece biraz azalmış TSS. Buna karşılık, Scd1 TSS ve hiçbir H3K79me2 gen bünyesinde düşük bir H3K79me2 oda vardır. Atf3 son bir örnek olarak farklı keskin ve düşük düzey H3K79me2 doruklarına gen vücut boyunca vardır.

Figure 1
Şekil 1: H3K79me2 çip Protokolü izole TBM'ler veya CGNPs ve akış sıralama analiz düzeninin. Sunulan Protokolü'nün (A) genel bakış. TBM yalıtım, ilk E14.5 beyin izole olacak ve cortices DT ve VT, gerekirse ayrılabilir. CGNPs için cerebelli P5-P7 fareler alınması gerekecek. Doku olacak homojenize, ataları ayrılmış, ve sonra hücreleri olabilir kültürlü ve uygun bir inhibitörü ile tedavi veya doğrudan küçük parça için kullanılan. Çip için Kromatin fiksasyonu kesme ve immunoprecipitation bir anti-H3K79me2 antikor ve tavşan IgG ile denetimi olarak izler. DNA arıtma sonra yonga örnekleri kitaplığı hazırlık ve sıralamanın yolu ile çözümlenebilir veya qPCR yolu ile çözümlenebilir. (B) uygun ve uygun olmayan kalite Kromatin örnekleri. DNA parçası dağıtım bpgösterilir. (C) ChIP-seq sonuçları Freiburg/gökada sunucu üzerinde bir analiz boru hattı için tabi. Sonra bir kalite kontrol (FastQC), okuma TrimGalore ile kesilmiş ve ardından fare genom (içinde sunulan durumlarda mm9) için Bowtie2 ile eşlenebilir. PlotFingerprint çip kalitesini değerlendirir. Tanımlanacağını doruklarına H3K79me2 için MACSpeaks uygulanabilir. Normalleştirme BamCoverage ve giriş BamCompare karşılaştırma için kullanılabilir. Sonuçları IGV görselleştirmek için tarayıcı ve heatmaps uygundur. Beklenen formatlar italik. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: kortikal yaratıcı kültür ve DOT1L inhibisyon. (A) DOT1L inhibisyon 3 gün sonra H3K79me2 düzeyleri E14.5, TBM gösteren Immunoblots (günde 3, n = 3-11) ile karşılaştırıldığında DMSO denetim. H3, GAPDH ve tübülin Alfa denetimleri yükleme olarak kullanılmıştır. (B) Immunocytological bir TBM kültür gün 2 ve 3 boyama. Caspase 3 (CASP3 yeşil) aktif-pozitif hücreler ve nöronlar (HuC/D: kırmızı) lekeli. DAPI (mavi) hücre çekirdeği görselleştirmek için kullanıldı. Ölçek çubuğu: 100 µm. immunostainings (C) miktar sundu (B). CASP3 için pozitif hücrelerinin oranını +/ DAPI + ya da HuC/D + / DAPI + yüzde cinsinden verilir. İstatistiksel analiz için unpaired bir öğrenci t-testleri yapıldı. p < 0,01 **. Bu rakam Roidl ve ark. güncellenmiştir 33 , 38 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: H3K79me2 ChIP-qPCR, Aft4, Ddit3, Aft3, Scd1 ve Npm1 TBM'leri üzerinden DOT1L inhibitörü ile tedavi. (A) E14.5 elde edilen TBM 5 µM DOT1L inhibitörü 4-5 h ile tedavi sonra yalıtım ve kültür 2 günde bir ikinci kez. TBM Kromatin ayıklama, ChIP deney ve qPCR izledi gün 3, tespit edildi. Sonuçları giriş (+ /-SEM) ortalama % gösterilir (n = 3). IgG negatif bir denetim olarak kullanıldı. IgG düzeyi ortalaması Kesikli çizgi tasvir edilir. İstatistiksel analiz için iki yönlü ANOVA uygulandı. p < 005 *; p < 0,01 **, p < 0,001 ***; TSS transkripsiyon başlangıç sitesi, TES transkripsiyon sona sitesi. Bu rakam Roidl ve ark. güncellenmiştir 33 , 38 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: H3K79me2 ChIP-seq analiz bakış. (A) H3K79me2 parmak izi ChIP-seq üzerinden giriş göre E14.5 elde edilen TBM'leri yüksek çip seq kalitenin korunmasını sağlamaya DNA parçalarının H3K79me2 için bir zenginlik gösterir. (B) H3K79me2 ChIP-seq sonuçları bir heatmap çizilen. Güçlü zenginleştirilmiş genomik bölgeler mavi olarak sunulmaktadır. 0 (Bordo) - ölçekleme 45 (koyu mavi). H3K79me2 TSS doruklarına ve TES için 3´ yönde azalır. (C) H3K79me2 ChIP-seq okuma mm9 genom eşlenen ve bütünleştirici genom viewer (IGV) ile görüntülenir. Bir genin H3K79me2 doluluk log2 kilobaz başına giriş okur arasındaki çip okuma oranı sayısı olarak görüntülenir milyon (ölçekleme: -10-10). Kırmızı bir kutu TSS dahil olmak üzere ilk exon gösterirken Refseq gen yapısı gösterilir. Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3 ve Npm1 genler gösterilir. Karşılaştırma için bir H3K4me3 sinyal aynı genomik bölgesinin görüntülenir. TSS transkripsiyon başlangıç sitesi, TES transkripsiyon sona sitesi. Bu rakam Roidl38güncellenmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Gen Bölge Astar ileri 5' - 3' Astar ters 5' - 3'
Aft4 TSS GGACGATCTCTAACGCCACA GCCCTAAACCCGCCCTTTAT
Aft4 TSS + 1500 CTCCCGAATATGACATGAACCG TCCATTCGAAACAGAGCATCG
Aft4 TES CCGTAATAGGGTAGTCAGGTGC AAAGAATGACACTGAAAACCCACA
Ddit3 TSS GTACTGGCTCCGTCTAACCC CAAGAGAGGGCCTGTAAGCA
Ddit3 TSS + 2500 TCAAGCAGCCGGTCTCATAG CTCAGATCCCCCAATGGCTT
Ddit3 TSS + 4500 GAGCTGGAAGCCTGGTATGA TCACCTCTTCGTTTCCTGGG
Ddit3 TES CACCAAGCATGAACAGTGGG GTACCGTCTATGTGCAAGCC
Aft3 TSS AACTGAGAGCGCAACTCCTC GCTGCCGTTCTTAGCTGGTA
Aft3 TES CTGTTGGCACAAAGTGGCTC GGGATCTGCCATGGTGGAAA
Scd1 TSS TAGTGACCACACACAAAAGCTC CCCAAGTGTAATTTGGATGATTTCC
Npm1 TSS TCCCCCTCCAGTCAGTTACC CGTCCTTTCCTTGGCGTGA
Npm1 TES AGGGACATACTTAAGACAAGCCAG AGGATTGAGGCAGACTGTCAAT
TSS: transkripsiyon başlangıç sitesi
TES: transkripsiyon sona sitesi

Tablo 1: ChIP-qPCR için kullanılan astar listesi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Histon değişiklikler, transkripsiyon faktörleri, Histon Kodu okuyucular, yazarlar veya silgi genomik doluluk algılamaya Kromatin immunoprecipitation gerçekleştirmek için iki ana yolu vardır. Bir sindirilmiş, nükleaz için immunoprecipitation, yerel Kromatin kullanarak yerel çip yöntem ve diğer içinde oluşturarlar ve diğer DNA bağlı proteinler kovalent DNA'yı bağlı olduğu İngiltere'de yılın sabit, yamultulmuş Kromatin kullanarak sunulan yöntemdir 39. yerli küçük parça ile yüksek antikor algılama oranını Histon metilasyonu Kromatin beri için geçerli olması gerektiğini ve Histon methylations çip nispeten istikrarlı. Ama malzeme başlayan büyük bir miktar gereklidir beri nerede fare beyin hücreleri sayısı genellikle sınırlıdır kortikal veya serebellar geliştirme, eğitim için geçerli değil. Her ne kadar antikorlar genellikle sabit olmayan malzeme karşı yetiştirilir, antikor özellikle belirli bir azalma H3K79me2 sinyali çip qPCR analiz ve immunoblots (şekil 2A götürür DOT1L inhibisyonu beri H3K79me2 algılar kanıtlayacağız ve şekil 3A). Çapraz bağlı malzeme kullanarak çip verimsiz olabilir, ama sunulan Protokolü qPCR ve sıralama analizi için yeterince özellikle zenginleştirilmiş malzeme sağlar.

SDS proteinler denatures ve onları antikor bağlama için erişilebilir yapar etkili bir çip için lizis arabellek SDS konsantrasyonu çok önemli, olabilir. Bu özellik, Histon 3 küresel etki alanındaki ve Kromatin'ın en küçük birim22nucleosome çekirdek içinde yer alan bir Histon değişiklik olduğu H3K79me2 için özellikle önemlidir. Böylece, H3K79me2 için SDS yoğun (yaklaşık % 0,3 w/v) tahlil sırasında en uygun antigene erişilebilirlik sağlamak için gereklidir. Bu SDS konsantrasyon ile biz son derece H3K79me2 IgG denetimleri (şekil 3) ve giriş (şekil 4) zenginleştirmek. Bu nedenle, sıralama için ChIP malzeme kalitesi ve uygun ve zenginleştirme üzerinden giriş H3K4me3 karşılaştırılabilir (şekil 4). Biz aynı SDS konsantrasyon H3K79 mono veya trimethylation işareti küçük parça için gerekli olacaktır bekliyoruz. Genel olarak, daha sıkı çip arabellek, antikor kalitesini kullanılan deterjan tarafından etkilenmez daha az yanlış pozitif Kromatin parçaları immunoprecipitated. Gelecek için başka Histon değişiklikler Histon, küresel etki alanındaki sunulan iletişim kuralı uygulamak mümkün olabilir.

Antikorlar küçük parça için uygundur ve daha yüksek deterjan konsantrasyonları istikrarlı, protokol esas olarak iki kritik adımlar içermektedir. İlk olarak, hücreleri fiksasyonu ve sonraki Kromatin yamultma her hücre tipi ve her ultrasonicator için optimize edilmelidir. Uzun süreli cross-linking fiksasyon eserler yol açar ve antijenleri maskeli beri antikor tespit oranı azaltabilir. Kromatin kesme boyutu dağıtım DNA'ın 200 ve 500 bp (şekil 1B) arasında yol gerekiyordu. Oluşturarlar 147 içeren DNA'ın kan basıncı. Çok uzun Kromatin parçaları qPCRs yanlış pozitif sonuçlar sağlayacaktır. Genellikle sadece küçük parçaları değerlendirilir beri genom çapındaki sıralama sırasında yanlış negatif sonuçlar için bir boyutu yanlış dağıtım yol açacaktır. İkinci önemli adım genom çapındaki sıralama kitaplığı hazırlıktır. Bir DNA amplifikasyon adım 6-9 PCR-döngüleri kullanarak yapılması gerekiyor. Yüksek bir GC önyargı ve birçok PCR çoğaltmaları yol açabilecek birçok PCR döngüleri kaçınmak gereklidir. Sunulan protokolü ile gerekli PCR döngü sayısı düşük tutmak için yeterli DNA alınabilir.

Nöronlar, oligodendrocytes ve glia hücreleri4gibi hücre tipleri çok farklı bir miktarda, beyin dokusu oluşur. Geliştirme sırasında bu hücreler nöral kök hücrelerden türetilir ve bir saat ve konum bağımlı bir şekilde3beyinde belirli alanlarda inşa. Neurogenesis serebral korteksin mesela farelerde E11.5 ve E18.5 arasında yer alır. E11.5 ve E12.5 gibi daha önceki aşamalarında hemen hemen tüm hücreleri progenitör kimlik1, ama daha sonra hücresel farklılıkların dikkate alınması gerekir. Bu nedenle, E14.5, kortikal doku parçasının H3K79me2 veya herhangi bir diğer Histon değişiklik, o belirli bir zaman noktasında ortaya çıkarabilir ama hücre tipi özel Kromatin özellikleri görüntülenemiyor. Bu sorun belirli hücreleri zenginleştirme tarafından (FACS) sıralama Floresans aktif hücre ya da manyetik aktif hücre beyin homojenizasyon sonra mümkün olduğu40(Mac-ayırma), sıralama ile çözülebilir. Mac'ler sıralama ile nöral progenitör hücrelerin belirli hücre yüzey işaretleri taşıyan manyetik boncuklar ile etiketli ve manyetik stand40kullanarak izole. Daha sonra hücreler kültürlü veya doğrudan küçük parça için kullanılır. Sunulan Protokolü sadece nöral progenitör hücreler için aynı zamanda diğer homojen hücre popülasyonlarının için kullanılabilir. FACS veya Mac'ler eklenmesiyle, protokol bir organizma içinde tüm isolatable hücreler için uygulanabilir.

Birlikte ele alındığında, sunulan Protokolü kortikal serebellar geliştirme ve farklı zaman noktalarda Histon değişiklik H3K79me2 verimli ve tekrarlanabilir bir şekilde araştırmak olanak sağlar. Histon çekirdek içinde yer alan diğer Histon değişiklikler için geçerli olabilir ve diğer homojen hücre tipleri organizma içinde uygulanabilir. H3K79me2 korunmuş Histon değişiklik23olduğu için iletişim kuralı da H3K79me2 sadece fare ama farklı türler arasında analiz etmek uygun olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirmek

Acknowledgments

Henriette Bertemes laboratuar CGN ekimi protokolde kurmak için yardım ettiğin için teşekkür ederim. Bu yöntem kağıt DFG tarafından finanse edilen CRC992 tıbbi epigenetik tarafından TV için fon tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Freiburg Galaxy takım destek kabul: Pavankumar Videm, Björn Grüning ve Prof. Dr. Rolf Backofen, Biyoinformatik, Freiburg Üniversitesi, Almanya ortak araştırma merkezi 992 tıbbi epigenetik tarafından (DFG grant SFB 992/1 2012) finanse ve Alman Federal Bakanlığı Eğitim ve araştırma (BMBF grant 031 A538A RBC (de. NBI)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-GAPDH Abcam ab8245 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000
Anti-H3 Abcam ab1791 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Anti-H3K79me2 Diagenode pAb-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP antibody
Anti-H3K79me2 Abcam ab-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000
Anti-rabbit-IgG Diagenode C15410206 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody
Anti-Tubulin alpha Abcam ab108629 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml) Sigma-Aldrich T1147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
B27 Supplement (50x) Life Technologies 17504044 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Bioanalyzer Agilent technologies G2940CA Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin
Bioruptor NextGen Diagenode B01020001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Ultrasonicator
Boric acid pH 8.4 Sigma Aldrich B6768 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
CFX Connect RT PCR Detection System Bio-Rad 1855201 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR
DMEM-F12 Life Technologies 11320-033 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
Dynabeads Protein A Invitrogen 10001D Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP
EPZ-5676 Selleckchem S7062 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Ethylenediamine tetraacetic acid SERVA 39760.01 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: EDTA
Fetal Bovine Serum 10% (v/v) Gibco 10082147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM
Glucose Sigma-Aldrich G5767 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Glutathione (1.25 mg/ml) Sigma-Aldrich G4251 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Glycine Carl Roth 3187 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For cell fixation
GoTaq mastermix Promega A6002 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR
Hank’s Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-100 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: HBSS
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030081 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Lithium chloride Sigma-Aldrich L4408 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: LiCl
N2 supplement Life Technologies 17502048 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
NanoDrop 3300 Thermo Fisher 3300 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina NEB E7645S Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina NEB E7335 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation
Neurobasal medium Gibco 21103049 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
NP-40 Alternative Calbiochem 492016 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Paraformaldehyde Carl Roth 335 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation
Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) Life Technologies 15640055 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM
Phosphate buffered saline Life Technologies 10010023 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation
PicoGreen Kit Thermo Fisher P11496 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Poly-L-ornithine hydrobromide Sigma Aldrich P3655 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Potassium chloride Thermo Fisher AM9640G Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: KCl, for CGM
Protease inhibitor Roche 4693159001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Proteinase K Sigma-Aldrich 3115879001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Qiagen MinElute Qiagen 28004 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification
RNAse Sigma-Aldrich R6513 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
SGC0946 Selleckchem S7079 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Sodium bicarbonate Carl Roth 8551.1 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: for Elution buffer
Sodium chloride Carl Roth 9265 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Sodium dodecylsulfate Carl Roth 183 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP
Sonic hedgehock (SHH) Sigma-Aldrich SRP6004 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Superoxide dismutase (1mg/ml) Sigma-Aldrich S7571 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Carl Roth 9090 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer
Triton X-100 Carl Roth X100 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) Sigma Aldrich 59417C Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation
Tween20 Carl Roth 28320 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For bead preparation
Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath
CCM: Cortical cell medium
CGM: CGNP cell culture medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
  2. Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science. 290, 1113-1120 (2000).
  3. Götz, M., Sommer, L. Cortical development: the art of generating cell diversity. Dev. Camb. Engl. 132, 3327 (2005).
  4. Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. Epigenetic control of neural precursor cell fate during development. Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).
  5. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372, 263-266 (1994).
  6. Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).
  7. McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254, 282-285 (1991).
  8. Desai, A. R., McConnell, S. K. Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development. Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).
  9. Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
  10. Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).
  11. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  13. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  14. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  15. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  16. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).
  17. Sanders, S. L., et al. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell. 119, 603-614 (2004).
  18. Martin, C., Zhang, Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).
  19. Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).
  20. Ng, H. H., et al. Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association. Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).
  21. Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest. FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).
  22. Roidl, D., Hacker, C. Histone methylation during neural development. Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).
  23. Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure. Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).
  24. van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core. Cell. 109, 745-756 (2002).
  25. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
  26. Woo Park, J., et al. RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20. Sci. Rep. 5, 12485 (2015).
  27. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. , (2016).
  28. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
  29. Feng, Y., et al. Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase. Blood. 116, 4483-4491 (2010).
  30. Cattaneo, P., et al. DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation. Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).
  31. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  32. Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).
  33. Roidl, D., et al. DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro. Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).
  34. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  35. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).
  36. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
  37. Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).
  38. Roidl, D. Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).
  39. Turner, B. ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , Institut national de la santé et de la recherche médicale. (2001).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).

Tags

Neuroscience sayı: 131 serebellar hücre kültürü kortikal hücre kültürü korteks geliştirme serebellar geliştirme H3K79 metilasyonu DOT1L ChIP DOT1L inhibisyon
Yalıtım ve sinirsel ataları Kromatin-Immunoprecipitation Histon 3 lizin 79 Dimethylation Mark tarafından takip tarımı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bovio, P., Roidl, D., Heidrich, S.,… More

Bovio, P., Roidl, D., Heidrich, S., Vogel, T., Franz, H. Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark. J. Vis. Exp. (131), e56631, doi:10.3791/56631 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter