Summary
In dieser Studie beschreiben wir den hinteren Semicircular Kanal-Ansatz als eine zuverlässige Methode für Innenohr-gen Lieferung bei neugeborenen Mäusen. Wir zeigen, dass gen-Lieferung durch den hinteren Semicircular Kanal in der Lage, das gesamte Innenohr durchspülen.
Abstract
Innenohr Gentherapie bietet große Versprechung als potenzielle Behandlung von Schwerhörigkeit und Schwindel. Der wichtige Determinanten für den Erfolg des Innenohrs Gentherapie ist eine Lieferung Methode zu finden, die konsequente Transduktion Effizienz der gezielten Zelltypen führt bei gleichzeitiger Minimierung der Hörverlust. In dieser Studie beschreiben wir den hinteren Semicircular Kanal-Ansatz als eine praktikable Methode für Innenohr-gen Lieferung bei neugeborenen Mäusen. Wir zeigen, dass gen-Lieferung durch den hinteren Semicircular Kanal in der Lage, das gesamte Innenohr durchspülen. Die leicht anatomische Identifikation des hinteren Semicircular Kanals sowie minimale Manipulation des Schläfenbeins erforderlich, machen diesem chirurgischen Ansatz eine attraktive Option für Innenohr-gen Lieferung.
Introduction
Innenohr Gentherapie ist ein sich rasant entwickelnden Gebiet der Untersuchung. Es wurde in verschiedenen Ausführungen der Tiere zu bekämpfen Ototoxizität, Lärm Trauma und erbliche Gehör Verlust1angewendet. Mehrere neuere Studien belegen funktionelle Erholung des Hörens und Gleichgewicht Funktionen mutierte Mäuse nach Innenohr Gen Therapie Lieferung2,3,4,5,6, 7. einer der wichtigsten Faktoren bei der Bestimmung der Erfolg des Innenohrs Gentherapie ist das chirurgische Vorgehen verwendet, um Zugriff auf das Innenohr. Im Idealfall das chirurgische Vorgehen wäre einfach durchzuführen, die anatomischen Landmarken wäre konsistent und leicht zu identifizieren, und die daraus resultierende Transduktion von gezielten Zelltypen wären hoch.
In einer aktuellen Studie haben wir gezeigt, dass bei viralen Gentherapie durch den hinteren Semicircular Kanal der Wirbler mutierte Maus (ein Modell der Hörverlust und vestibulären Dysfunktion) injiziert wurde, effizienten Transduktion von sensorischen Haarzellen in der vestibulären gesehen wurde auch Organe wie die Cochlea-5. Die hohe Effizienz der sensorischen Haarzellen Transduktion führte zu Verbesserung der auditorischen und vestibulären Funktionen in diesen mutierten Mäusen.
In diesem Artikel beschreiben wir ausführlich den hinteren Semicircular Canal Ansatz um die Neugeborenen Maus Innenohr gelangen.
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Protocol
Alle tierische Verfahren stimmten die Animal Care und Use Committee am nationalen Institut auf Taubheit und anderen Kommunikationsstörungen (NIDCD ASP1378-15).
1. Verfahren einrichten und Vorbereitung
- Sterilisieren Sie alle Instrumente von Ethylenoxid in den Beginn des Experiments. Zwischen Tieren reinigen Sie mit Wulst Sterilisation Instrumente.
- Laden Sie die Projektmappe mit viralen Gentherapie in einer Mikropipette auf dem Mikro-Injektor. Die viralen Vektoren, die in dieser Studie verwendet wurde AAV2/8-whirlin (1 x 1013 Genom Kopien pro Milliliter, siehe die Tabelle der Materialien).
Hinweis: In der Regel ist 1,1 µL Gesamtvolumen in die Mikropipette geladen.
(2) Anästhesie
Hinweis: In dieser Studie verwendete Maus-Stamm ist der Wirbler Maus. Reinerbige Mutanten (WhrnWLAN/wi) und heterozygote Wurfgeschwistern (Whrn+ / wi) dienten.
- Legen Sie die Mutter in einem separaten Käfig (getrennt aus dem Wurf).
- Legen Sie die Heimat Käfig mit dem Wurf (P0 - P5 Welpen) auf einem umlaufenden Wärmekissen (Set bei 37,5 ° C) um die Mäuse warm zu halten.
- Schneiden Sie den Daumen Teil eines Latex-Handschuh, und entgegenbringen Sie einen Welpen.
- Platzieren Sie den Welpen in Latex-Handschuh Daumen in einen Eimer mit Eis für ~ 2 min.
- Platzieren Sie den narkotisierten Hund auf einem großen quadratischen kommerziellen Kunststoff Einfrieren-Pack mit einem 4 "x 4" Gaze zwischen den Welpen und das Pack Oberfläche.
- Einen schweren Latex-Handschuh mit crushed Ice füllen und den Eis-Handschuh rund um die Welpen zu platzieren.
- Überprüfen Sie, ob der Welpe ausreichend durch das völlige Fehlen von jeder Reaktion auf verschiedene Reize (einschließlich einer festen Fuß Klemme) betäubt ist. Lassen Sie den Welpen auf das Packeis für die Dauer der Operation (ca. 5-10 min).
Hinweis: Wir empfehlen die Welpen auf das Packeis für nicht mehr als 15 min während der Operation.
3. chirurgische Vorgehen (Abbildung 1)
- Reinigen Sie die Haut hinter dem Ohr mit einer Jod-wischen und ein Alkohol abwischen, sobald das Tier betäubt ist.
- Machen Sie einen postauricular Schnitt ~ 2 mm hinter dem Ohr mit Mikro-Schere, und teilen Sie den sternocleidomastoideus-Muskel mit Mikro-Schere.
- Nervus facialis und die Bulla zu identifizieren. Die Bulla ist knorpelig und semi-transparent in diesem Alter und es liegt medial Nervus facialis. Die stapedial Arterie durch die Bulla in diesem Alter sehen, die ein nützliches Wahrzeichen ist.
- Nervus facialis zu folgen, souverän und nach hinten, die hinteren Semicircular Kanal (PSCC) zu finden. Entfernen Sie die Muskelfasern und Weichgewebe über den hinteren Semicircular Kanal mit Mikro-Schere.
Hinweis: In diesem Alter ist die PSCC knorpelig. - Dringen Sie die PSCC mit einem Glas Mikropipette (~ 10 μm Durchmesser) auf der Mikro-Injektor.
- Injizieren Sie virale Gentherapie in das Innenohr.
Hinweis: In der Regel insgesamt 20 Injektionen von 49 nL der Gentherapie werden geliefert in den hinteren Semicircular Kanal über ~ 40 s (Gesamtvolumen ~ 1 µL). Die virale Titer verwendet wurde 1 x 10-13 -Genom-Kopien pro mL. - Schließen Sie der Hautschnitt mit einem 5: 0 Polyglactin Naht.
4. postoperative Pflege
- Ort der Welpe auf eine wärmende Unterlage, um eine normale Körpertemperatur während der Wiederherstellung aus der Narkose mit konstanter manuelle Stimulation/Rollen mit behandschuhten Fingern menschlichen wiederherzustellen.
- Sobald der Welpe wach ist, legen Sie sie zurück in seine Heimat Käfig.
- Streicheln Sie jeder Welpe mit einem Wattestäbchen, das die Heimat Käfig Einstreu ausgesetzt worden ist.
Hinweis: Der Zweck davon ist, haben die Mäuse riechen wie sie es vor der Operation, das erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass die Mutter ihr Wurf nach der Operation wieder zu akzeptieren. Wenn möglich, kann Urin von der Mutter gesammelt und rieb auf die Welpen mit einem Wattestäbchen, um die Wahrscheinlichkeit einer Ablehnung weiter zu verringern. - Nase, die Mutter um ihre8desensibilisieren Mineralöl zuweisen und Wiedereinführung der Muttergottes in den Käfig zu Hause.
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Representative Results
Injektion von AAV8 whirlin Gentherapie in Neugeborenen Wirbler Mäuse durch den hinteren Semicircular Kanal führte zu whirlin Ausdruck (grün) in utricular Haarzellen (Abbildung 2), mit der Infektion Gesamtwirkungsgrad von 53,1 % (SD 38,1, n = 28)5 . Haarzellen ausgestrahlt hatte Stereocilia (rot) im Vergleich zu Haarzellen von kontralateralen nicht injiziert Ohren länglich (5,35 ± 2.11 µm vs. 3,20 ± 0,34 µm bzw.)5.
Posterior Semicircular Canal Injektion von AAV8 whirlin führte auch Transduktion von Cochlea-Haarzellen in den Wirbler Mäusen (Abbildung 3). Die durchschnittliche innere Haarzelle Infektion Effizienz war 77,1 % (SD 12,7, n = 8)5. Ausgestrahlt Haarzellen zum Ausdruck whirlin (grün) an Stereocilia Spitzen und hatte Stereocilia (rot) im Vergleich zu Haarzellen von kontralateralen nicht injiziert Ohren länglich (5.04 ± 0,72 µm vs. 1,01 ± 0,08 µm an der Cochlea-Spitze bzw.)5.
Abbildung 1 : Intraoperative Bilder.
Intraoperative Bilder zeigen chirurgische Zugang zu den hinteren Semicircular Kanal (PSCC) in einer P0-Maus. Das linke Ohr wird angezeigt. Die PSCC ist in schwarz gestrichelt dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Vestibulären Haarzellen sind ausgestrahlt mit PSCC gen Lieferung.
AAV8-whirlin über die PSCC geliefert Ansatz führte zu hohen utricular Haarzelle Infektion. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Cochlea-Haarzellen sind ausgestrahlt mit PSCC gen Lieferung.
AAV8-whirlin über die PSCC geliefert Ansatz führte zu hohen Cochlea Haarzelle Infektion. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Mehrere chirurgische Ansätze sind beschrieben worden, um Nager inneren Ohren zu gelangen. Cochleostomie und Rundfenster Ansätze werden am häufigsten verwendet Zugriff die Cochlea, während die hinteren Semicircular Canal und endolymphatic Sac Ansätze in der Regel die vestibulären Organe1Zugriff auf verwendet werden. In einer aktuellen Studie haben wir gezeigt, dass posterior Semicircular Canal, die hohe Effizienz der Haarzelle Transduktion in der vestibulären Organe und die Schnecke5Injektionen von viralen Gentherapie führte. In der Tat war Cochlea Haarzelle Transduktion höher über der hinteren Semicircular Kanal-Injektionen im Vergleich mit Rundfenster Injektionen in die gleiche Maus-Modell der erbliche Schwerhörigkeit und vestibulären Dysfunktion5,9. Angesichts der anatomische Nähe zwischen dem runden Fenster und der Cochlea, scheint es paradox, dass Rundfenster Injektionen zu niedrigeren Cochlea Haarzelle Transduktion im Vergleich zur hinteren Semicircular Canal Injektionen führen können. Dieser Befund kann durch die Tatsache erklärt werden, dass das Runde Fenster in der Nähe der Cochlea-Aquädukt befindet. Daher, wenn virale Gentherapie durch das Runde Fenster injiziert wird, kann seine Konzentration durch die cerebrospinale Flüssigkeit, die aus der Cochlea-Aquädukt10verdünnt werden.
Die Feststellung, dass die hinteren Semicircular Canal Injektion ergibt sich Cochlea und vestibulären Haarzellen Transduktion wurde auch durch andere Studien-11,-12berichtet. In der Studie von Okada Et Al.berichtete Transduktion von Cochlea und vestibulären Haarzellen durch AAV-GFP. Numerische Quantifizierung wurde jedoch nicht durchgeführt. Die Studie von Suzuki Et Al., berichtet hohe Niveaus der Cochlea und vestibulären Haarzellen Transduktion mit AAV-Anc80-GLP mit dem hinteren Semicircular Kanal-Ansatz bei Erwachsenen Mäusen. Bei Erwachsenen Mäusen ist Kanülierung des hinteren Semicircular Kanals mit einem kleinen Katheter vorzuziehen, da die knöcherne Bedeckung des hinteren Semicircular Kanals vollständig verknöcherten12. Katheterisierung des hinteren Semicircular Kanals bei Erwachsenen Mäusen kann helfen, Injektion Rückfluss, minimieren die Transduktion Effizienz verringern kann. Dieser Schritt ist nicht bei neugeborenen Mäusen erforderlich, da die knöcherne Bedeckung des hinteren Semicircular Kanals in diesem Alter noch knorpelig ist.
Einer der Nachteile der hinteren Semicircular Canal Injektion ist die Tatsache, dass man nicht sicher sein ob die injizierten Gentherapie in der Perilymphe oder Endolymphe geliefert wird. Trotz dieses Manko der hinteren Semicircular Kanal ist anatomisch leicht zu finden und erfordert minimale Manipulation des Schläfenbeins für seine Identifizierung. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit von Innenohr-Schäden durch chirurgische Trauma. Die hinteren Semicircular Kanal-Injektion ist eine attraktive Option für Innenohr-Gen-Therapie-Lieferung.
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Disclosures
Die Autoren haben keine entsprechenden Angaben zu machen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde mit Mitteln aus der NIDCD Abteilung der intramuralen Forschung /NIH (DC000082-02 bis W.W.C.) sowie DC000081, erweiterte Bildgebung Kern unterstützt. Wir sind dankbar für die NIDCD Tierhaus Mitarbeiter für die Pflege unserer Tiere.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI Pico ENT microscope. Other dissection microscopes would also work. | |
| Micro-forcepts | Fine Science Tools | 11251-10, 11295-51 | #5 and #55 Dumont |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Nanoliter2000 microinjector | World Precision Instruments | ||
| Heating pad | Mastex | Model 500/600 | |
| 5-0 vicryl sutures | Ethicon | ||
| AAV8-whirlin | Vector Biolabs | ||
| Glass pipette | Sutter Instruments | B100-75-10 | Borosilicate glass |
References
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