Summary
Dieses Protokoll zeigt die wichtigen aufeinander folgenden Schritte erforderlich, um die Relevanz der Überwachung Vitalität Parameter und DNA-Reparaturprozesse in Bacillus Subtilis Sporen nach der Behandlung mit Niederdruckplasma Wiederbelebung durch tracking Fluoreszenz-markierten DNA-Reparatur Proteine über zeitaufgelösten konfokalen Mikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie.
Abstract
Plasmasterilisation ist eine vielversprechende Alternative zu herkömmlichen Sterilisationsverfahren für Industrie-, klinische, und Raumfahrt. Niederdruck-Plasma (LPP)-Entladungen enthalten ein breites Spektrum an aktiven Spezies, die zu schnellen mikrobiellen Inaktivierung führen. Um die Effizienz und die Mechanismen der Sterilisation durch BVG zu untersuchen, verwenden wir die Testorganismen Bacillus Subtilis Sporen wegen ihrer außerordentlichen Widerstand gegen konventionelle Sterilisationen. Wir beschreiben die Herstellung von B. Subtilis Sporen Monolagen, die Sterilisation durch Niederdruck-Plasma in einem Doppel Induktiv gekoppelte Plasma-Reaktor, die Charakterisierung der Spore Morphologie mit Rasterelektronenmikroskopie (SEM), und die Analyse der Keimung und Auswuchs der Sporen durch live Zelle Mikroskopie. Ein wichtiges Ziel der Plasma-Arten ist genomic Materials (DNA) und Reparatur von Plasma-induzierten DNA-Läsionen bei Spore Wiederbelebung ist entscheidend für das Überleben des Organismus. Hier untersuchen wir die Keimfähigkeit der Sporen und die Rolle der DNA Reparatur während der Keimung der Spore und Auswuchs nach der Behandlung mit BVG durch die Verfolgung Eindringmittel gekennzeichnet DNA-Reparatur-Proteine (RecA) mit zeitaufgelösten konfokale Fluoreszenzmikroskopie. Behandelte und unbehandelte Spore Monolagen sind aktiviert für die Keimung und visualisiert mit einem invertierten konfokale live Zelle Mikroskop im Laufe der Zeit, die Reaktion der einzelnen Sporen zu folgen. Unsere Beobachtungen zeigen, dass der Anteil der Keimen und Sporen entwachsen abhängig von der Dauer der LPP-Behandlung ein Minimum erreichen ist, nach 120 RecA-YFP s. (gelbe Fluoreszenz Protein) Fluoreszenz wurde nur in paar Sporen erkannt und entwickelt in allen Zellen mit eine leichte Erhöhung im BVG-behandelten Sporen entwachsen. Darüber hinaus einige der vegetativen Bakterien aus BVG-behandelten Sporen zeigten eine Zunahme im Zytoplasma und tendenziell aufzulösen. Die beschriebenen Methoden zur Analyse der einzelnen Sporen könnte beispielhaft für das Studium anderer Aspekte der Spore Keimung und Auswuchs.
Introduction
Ein wesentliches Ziel der Weltraumforschung ist die Suche nach Signaturen von Lebensformen und Biomolekülen auf andere Himmelskörper und Monde in unserem Sonnensystem. Die Übertragung von Mikroorganismen oder Biomoleküle irdischen Ursprungs zu kritischen Bereichen der Exploration ist besonders gefährdet, Einfluss auf die Entwicklung und die Integrität des Lebens-Erkennung Missionen auf Himmelskörper wie Mars und Europa1. Die internationalen Richtlinien der planetaren Schutz, gegründet 1967 durch Ausschuss Space Research (COSPAR) strenge Vorschriften für die bemannte und unbemannte Missionen zu anderen Planeten, deren Monde, Asteroiden und andere Himmelskörper zu verhängen und regulieren die Reinigung und Sterilisation von ein Raumschiff und kritischen Hardwarekomponenten vor, um Verunreinigung irdische Mikroorganismen zu beseitigen und zu verhindern Kreuzkontamination von Himmelskörpern2zu starten. Im letzten Jahrzehnt hat die Anwendung von nichtthermischen Plasmen breite Aufmerksamkeit in der biomedizinischen und ernährungswissenschaftliche Forschung sowie in Raumfahrt-Anwendungen3,4,5gewonnen. Plasmasterilisation ist eine vielversprechende Alternative zu herkömmlichen Sterilisationsmethoden, da sie schnelle und effiziente mikrobielle Inaktivierung6, dabei sanft, sensibel und labil Materialien Wärme bietet. Plasma-Entladungen enthalten eine Mischung aus reaktiven Substanzen wie freie Radikale, geladene Teilchen, Neutral/aufgeregt Atome, Photonen im Ultraviolett (UV) und Vakuum-Ultraviolett (VUV) Spektrum führen zu schnellen mikrobiellen Inaktivierung3. In dieser Studie verwenden wir Niederdruckplasma erzeugt durch doppelte Induktiv gekoppelte Niederdruck-Plasma (DICP) Quelle7,8 , um Bacillus Subtilis Endosporen verteilt auf Test Glasoberfläche zu inaktivieren.
Gram-positiven Bakterien der Familie Bacillaceae sind weit verbreitet in natürlichen Lebensräumen von Böden, Sedimenten und Luft sowie in außergewöhnlichen Umgebungen wie Reinraumanlagen und der internationalen Raumstation ISS9,10 ,11. Das auffälligste Merkmal der Gattung Bacillus ist die Fähigkeit, hochresistente ruhende Endosporen (nachfolgend Sporen) zu bilden, um ungünstige Bedingungen, wie z. B. Nährstoffverarmung12zu überleben. Sporen sind in der Regel wesentlich widerstandsfähiger als ihre Gegenstücke der vegetativen Zelle zu einer Vielzahl von Behandlungen und Umwelteinflüsse wie Hitze, UV, Gammabestrahlung, Austrocknung, mechanische Störungen und giftige Chemikalien, wie z. B. starken Oxidationsmitteln oder pH-Wert-Änderung Agenten (rezensiert in Referenzen13,14) und sind daher ideale Objekte zur Prüfung der Wirksamkeit von mikrobiellen Inaktivierungsverfahren. Da genomischer DNA ein wichtiges Ziel der Plasmabehandlung von Bakterien15,16, die Reparatur von Plasma-induzierten DNA-Läsionen ist (z. B. DNA-Doppelstrang Brüche) auf Spore Revival ist entscheidend für das Überleben der Bakterien13, 17.
So, wir studieren die Keimfähigkeit der Sporen und die Rolle der DNA-Reparatur während der Keimung der Spore und Auswuchs nach der Behandlung der Sporen mit Niederdruck-Argon-Plasma durch folgende einzelne Sporen und ihren Ausdruck der Fluoreszenz-markierten DNA zu reparieren RecA-Protein mit zeitaufgelösten konfokale Fluoreszenzmikroskopie. Wir geben eine Schritt für Schritt Anleitung für die Zubereitung von B. Subtilis Sporen in Monolagen zur Erreichung reproduzierbare Testergebnisse, die Behandlung von Spore Monolagen mit Niederdruck-Plasma für die Sterilisation, die Vorbereitung von Plasma behandelt Sporen für Ultrastrukturforschung Auswertung über Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und live Zellanalyse Mikroskopie auf der Ebene der einzelnen Sporen im Konzert mit der Überwachung der aktiven DNS Reparatur Prozesse, die innerhalb der Zelle in Reaktion auf die Plasmabehandlung.
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Protocol
1. Bacillus Subtilis Sporen Herstellung und Reinigung
- Für die Produktion der Spore, übertragen eine 5 mL über Nacht Kultur des jeweiligen B. Subtilis -Stamm, ergänzt mit geeigneten Antibiotika, 200 mL Doppel-Stärke Schaeffer Sporenbildung Flüssigmedium (pro Liter 16 g Nährbouillon, KCl 2 g, 0,5 g MgSO 4* 7 H2O, 2 mL 1 M Ca (NO3)2, 2 mL 0,1 M MnCl2 * • 4 H2O, 2 mL 1 mM FeSO4, 2 mL 50 % (w/V) Glukose18) und kräftige Belüftung bei 37 ° C für 72 h oder bis > 95 % der Kultur zu pflegen hat haben. Die Sporen der folgenden Sorten verwendet: B. Subtilis PY79 (wild-Typ) B. Subtilis PY79ΔRecA:: Neo (mangelhaft DNA Reparatur Protein RecA) B. Subtilis PY79 RecA-Yfp:: Katze (RecA verschmolzen mit gelb fluoreszierendes Protein [YFP]19).
- Sporen durch Zentrifugation für 15 min bei 3.000 x g in 50 mL Röhrchen zu ernten und die Proben durch mehrmaliges Waschschritte (bis zu 15 Mal) mit sterilem destilliertem H2O und Check für Reinheit und Keimfähigkeit Status durch Phasenkontrast-Mikroskopie zu reinigen. Sicherstellen Sie, dass Spore Suspensionen bestehen aus Phase-hellen Sporen (> 99 %) und sind frei von vegetativen Zellen (Stangen), gekeimte Sporen (schwarz / grau aussehen) und Zellenrückstand, sonst weiter Mikroskopie Experimente gestört werden können. Waschen Sie die Probe, bis gewünschte Reinheit erreicht ist.
- Determinate der Spore-Titer durch Plattieren, 50 µL 10-divisibel Verdünnungsreihen auf LB-Agar (d.h.: Einsatz 30 µL Probe + 270 µL sterilem Wasser für eine 01:10 Verdünnung. Nehmen Sie 30 µL aus bestimmten Verdünnung 270 µL H2O für eine 1: 100 Verdünnung, usw.) für die Berechnung der KBE (Koloniebildenden Einheiten) und über Nacht die Platten bei 37 ° C inkubieren. Einstellen Sie nach CFU Entschlossenheit zu 109 Sporen pro mL Probe durch Konzentration oder Verdünnen mit sterilem Wasser.
2. Probenvorbereitung von Aerosol-hinterlegt Bacillus Subtilis Sporen
Hinweis: Ansammlung und Überlagerung von Sporen könnte zu Abschattungen während der Behandlung schließlich mit dem Ergebnis in gefälschten Inaktivierung Kinetik. Um dieses Problem zu minimieren, bereiten Sie Spore Proben um ein Aerosol-Abscheidung Technik20 vor. Kurz, Steuern Sie die Präzisions-zwei-Stoff-Düse mit einem elektrischen Timer, der Flüssigkeitsdurchsatz im Konzert mit dem Fluss des unter Druck stehenden Trägergas (hier N2) reguliert. Die injizierte flüssige Probe durch Düsenaustritt mit Stickstoff Gas Flow zu zerstreuen.
- Legen Sie einen Probenträger in Form von sterilisierten mikroskopische Dias (für Überleben Kinetik) oder rund 25 mm Deckgläsern (fluoreszierende Nachverfolgung der DNA-Reparatur Prozesse/cLSM; konfokale Laser-scanning-Mikroskopie) innerhalb der elektrisch betriebenen Aerosol Spritzen Einheit in Übereinstimmung mit der Düse. Die verwendeten Spore-Konzentration muss entsprechen eine Hundertfache des gewünschten Endkonzentration.
- 1 mL der Spore-Kultur auf der Düse Fluid Einlass übertragen und initiieren Spritzverfahren von 0,1 s bei einem Druck von 1,3 Bar. Die gespritzten Spore-Suspension (1 x 107) bildet einen dünnen Film auf der mikroskopischen Folie, die schnell trocknet innerhalb von Sekunden eine gleichmäßig verteilte Spore monomolekularen Film zu bilden. Lagern Sie die behandelten Probenträger in einen sterilen Behälter bei Raumtemperatur.
(3) Niederdruck-Plasma-Behandlung
- Bereiten Sie das Plasmasystem für die Behandlung von biologischen Proben und bedienen Sie das System auf 5 Pa mit Argon-Plasma bei 500 W für 5 Minuten. Dadurch werden alle Flächen im System gereinigt und erwärmt. Dadurch Verkleben der Moleküle aus der Umgebungsluft, nämlich Stickstoff, Sauerstoff und Wasser, während das System entlüften. Nach der Vorbehandlung des Systems Entlüften der Kammers und legen Sie die Proben vorsichtig in der Mitte des Reaktordruckbehälters mit Hilfe von Glasgestelle.
- Verwenden Sie mindestens drei biologische repliziert. Schließen Sie die Kammer und evakuieren unter 2 PA. Füllen Sie danach das Prozessgas in die Kammer. Regulieren den Druck im System auf 5 Pa.
- Schalten Sie nach der definierten Zeit den Strom und Gas Versorgung und entlüften Sie sorgfältig des Systems, um zu verhindern, weht die Proben aus dem Probenhalter. Entfernen Sie nach Belüftung die Proben und die Proben für den nächsten Parameter im System. Für Plasma-unbehandelten Kontrollen Proben nur Vakuum aussetzen (5 Pa) in Gegenwart des Prozessgases gleichbedeutend mit der längsten angewandte Plasma-Zeit.
4. Verwertung und Auswertung der Spore überleben
- Bereiten Sie eine Lösung von autoklaviert 10 % Polyvinylacetat (PVA) und decken die Probenträger sorgfältig mit ca. 500 µL und lassen Sie sie an der Luft trocknen für 4 Std. Streifen Sie den getrockneten PVA-Layer (jetzt mit der Spore-Probe) mit sterilen Pinzette und überträgt es auf 2 mL Reaktionsgefäß. Das Rohr 1 mL sterilem Wasser hinzufügen und Auflösen der PVA-Layer über aufschütteln. Dieses Verfahren führt zu > 95 % Wiederherstellung von Sporen und hat keinen Einfluss auf ihre Keimung Fähigkeit21.
- Verdünnen Sie die Probe seriell bei 01:10 in sterilem Wasser in eine 96-Well-Platte (d. h. 270 µL steriler H2O + 30 µL Probe/ehemalige Verdünnung). Platte aus 50 µL jeder Verdünnung auf Lysogeny Brühe Nähragar (LB), über Nacht die Platten bei 37 ° C inkubieren und Listen Sie die Anzahl der gewachsenen Kolonien (CFU).
5. live Cell Mikroskopie und Verfolgung von DNA-Reparaturprozesse in keimenden Sporen
- Für die Keimung Experimente, bereiten eine 1 mm Dicke 1,5 % LB-Agar-Pad, durch Kochen 700 µL Medium und Pipettieren es in eine Petrischale sterile Mikroskopie. Nach 10 min ein 8 x 8 mm x 1 mm LB-Agar-Pad mit einem sterilen Skalpell ausgeschnitten und transfer der Agar sorgfältig auf die Spore-Monoschichten die auf 25 mm Glasdeckgläser ruhen.
Hinweis: Dieser Schritt ist entscheidend für die Visualisierung der einzelnen Sporen und können nach ihrer Reaktion auf die Aktivierung der Keimung durch den Nähragar induziert. So, die LB-Agar dient zwei Zwecken, (1) die Sporen an der Oberfläche zu beheben die Relokalisierung entlang der Oberfläche und aus dem optischen Fokus vermeidet, und (2) für die Keimung die Spore zu aktivieren. - Nach dem abdecken der Probe mit Agar, übertragen die Glas-Deckglas schnell in einer bildgebenden Kammer und Mikroskop die Proben mit einem automatisierten konfokale Laserscanning-Mikroskop mit invertierten Optik mit einem 63 X / 1,3 Flugzeug apochromatische Öl eintauchen Ziel.
-
Führen Sie Bildgebung der Fluoreszenz (YFP) mit einer Erregung Wellenlänge von 514 nm und Emission zwischen 520 und 560 nm detektiert werden.
- Hellfeld Aufnahmen im scanning-Modus unter Verwendung eines Foto-Multiplikatoren (Durchlicht-Pfad).
- Zeitraffer-Serie mit einer Laserleistung von 2,6 % aufnehmen, und stellen Sie die konfokale Blende 5 luftigen Einheiten und bei einer Samplefrequenz von 1 Bild pro 30 s von 0 h bis 5 h, je nach dem Experiment. Es ist besonders zu beachten, dass hohe Dosen von monochromen-Beleuchtung bei 514 Laser nm vollständig hemmen Keimung (Abbildung 1A, B).
- Halten Sie die Proben bei 37 ° C (Umgebungsluft Feuchtigkeit) in eine Heizstufe während der gesamten imaging-Prozess. Verwenden Sie mindestens drei biologische Wiederholungen für jede Bedingung. Im Falle einer Spore Aggregation, vielschichtigen Spore Verteilung oder Kontamination durch Staubpartikel Sperrung der Plasmabehandlung ("shadowing") könnte auftreten und Keimung beschattet Sporen (Abbildung 1C, D) zu ermöglichen.
Abbildung 1: mögliche Probleme beim konfokale live Zelle Fluoreszenzmikroskopie von Plasma behandelt Sporen beobachtet. (A, B) Hemmung der Spore Keimung durch hohe Dosen von monochromatischen (514 nm) laser-Beleuchtung. (A) Übersicht (3 x 3 genähte Bilder) von B. Subtilis (LAS72, RecA-YFP) Sporen 180 min nach Beginn der Keimung. Der Rahmen in der Mitte in 30 s Intervallen zu hohe Dosen von Laserlicht (514 nm, 70 % Laserleistung) ausgesetzt war, während die umliegenden Regionen (= Frames) nicht beleuchtet waren (zusammengefügte Bild von Hellfeld Kanal und RecA-YFP Fluoreszenz; Strukturen wurden bestellt verursacht durch Verwendung von 35 mm Gerichte mit einem aufgedruckten 500 µm Raster imaging). (B) zeigt eine 4 X vergrößerte Ansicht der Grenze zwischen beleuchtete und unbeleuchtete Region zeigen, dass Sporen, die hohe Dosen von monochromatischen Laser Beleuchtung ausgesetzt wurden nicht keimen und wachsen, während Sporen unbeleuchtete Regionen erholen voll auf vegetative Bakterien helle RecA-YFP Fluoreszenz (grünes Signal) zum Ausdruck zu bringen. (C, D) Sporen fallenden Partikel Verunreinigung oder mehrere Schichten von Spore (Pfeile) scheint zu schützen zugrunde liegende Sporen vor Inaktivierung durch Plasmabehandlung und ermöglichen ihre Keimung und Auswuchs ("shadowing-Effekt"). (C) Sporen waren plasmabehandelte für 60 s und abgebildeten 180 min nach Beginn der Keimung oder (D) für 120 s und abgebildet nach 240 min. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
6. Rasterelektronenmikroskopie (SEM)
- Verwenden Sie Rasterelektronenmikroskopie, um über die Oberflächenmorphologie Plasma behandelt Sporen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen Ultrastrukturforschung Auskunft. Beschichtung von getrockneten Spore Monolagen auf Deckgläsern mit Gold-Palladium (3 nm) mithilfe eines Sputter Coater. Verwenden Sie ein Feldemission Rasterelektronenmikroskop für imaging-Proben, mit 5 kV Beschleunigungsspannung auch einen-Objektiv-Sekundär-Elektronen-Detektor, Topographie Kontrast zu offenbaren betrieben.
7. die Datenanalyse
- Bestimmen Sie die Spore Überleben aus der Quotient N/N0, wo N ist die durchschnittliche KBE behandelten Proben und N0 ist der Durchschnitt KBE der unbehandelten Vakuum Kontrollen. Plot-Spore Inaktivierung durch Argon-Plasma-Behandlung als Funktion der Zeit (in Sekunden). Bitte alle Daten als Mittelwerte und Standardabweichungen (n = 3).
- Analysieren Sie Bilder von live Cell Imaging über die imaging-Software. Den Anteil der Spore Keimung zu quantifizieren und entwachsen nach Plasmabehandlung, Graf Sporen in repräsentativen Rahmen zu Beginn des Experiments sowie nach 4 h. Zur Bestimmung der Bedeutung in Spore überleben Assays verwenden Sie One-Way ANOVA-Tests (Varianzanalyse) mit Statistiksoftware). P -Werte < 0,05 gelten als statistisch signifikant.
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Representative Results
Überleben der plasmabehandelte B. Subtilis Sporen
Plasmabehandlung von B. Subtilis Sporen verwendet in dieser Studie zeigen einen Rückgang der überleben mit zunehmender Dauer der Plasmabehandlung (Abbildung 2). Sporen des Stammes mit dem Ausdruck der RecA-gen verschmolzen, YFP zeigte Überleben Kurven ähnlich wie Sporen der Wildtyp-Stamm, darauf hinweist, dass die gentechnische Veränderung keinen signifikanten Einfluss auf die bakterielle Vitalität hat. Sporen des RecA-defizienten Stamm weisen eine höhere Empfindlichkeit gegenüber Plasma-Behandlung im Vergleich zu Sporen von der Wildtyp-Stamm, demonstrieren, dass das Vorhandensein des Gens RecA Plasma-induced Verlust der Vitalität reduziert. Vor allem kurze Plasmabehandlung von 15 s (P <0,003) und 30 s (P < 0,004) eine signifikante Abnahme der Vitalität bei RecA-defizienten Stämme im Vergleich zu Wildtyp und RecA-YFP Stämme verursachen. Nach 90 s der Plasmabehandlung, die Vitalität von allen Stämmen wird um ca. drei Größenordnungen reduziert.
Abbildung 2: Überleben von B. Subtilis Sporen aus verschiedenen Stämmen nach der Behandlung mit Niederdruck Argon Plasma. Überleben (mittlere KBE Plasma behandelt Sporen/Mittelwert KBE Vakuum behandelten Sporen; Fehlerindikatoren Standardabweichung vertreten) ist gegen die Dauer der Plasmabehandlung aufgetragen. PY79 (Wildtyp, geschlossene Kreise), LAS72 (RecA-YFP; grauen Kreisen) und LAS24 (ΔRecA; Kreise zu öffnen). Statistische Analyse ergab keine signifikanten Unterschiede in Spore Überlebensfähigkeit zwischen PY79 (unverändert RecA) und LAS72 (RecA-YFP-Fusion).
Ultrastrukturforschung plasmabehandelte Sporen von SEM-Analyse
Um eine Vorstellung der morphologischen Auswirkungen des Plasmas wurde Behandlung auf die Sporen, Rasterelektronenmikroskopie (SEM) zur Morphologie die Oberfläche Plasma behandelt Sporen im Vergleich zu Vakuum-behandelten Sporen (Kontrolle) zu analysieren. Die äußere Oberfläche des B. Subtilis Sporen zeigen charakteristische längs Grat-wie Strukturen, die in allen behandelten und unbehandelten Sporen (Abbildung 3) ständig sichtbar sind. Plasmabehandlung bis zu 30 s induziert keine signifikanten Veränderungen der Morphologie der Spore-Oberfläche im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 3A-C). Zunehmender Dauer der Plasmabehandlung (60-240 s) führt zu einer präziseren Spore-Oberfläche (Abbildung 3-D-F) und kleine Sprünge und Risse in Sporen behandelt für 120 oder 240 s beobachtet werden. Darüber hinaus entstehen kleine Kügelchen auf Spore Oberflächen (120 s und 240 s Behandlungen, Abbildung 3E, F), entstanden sind veröffentlichte Material aus dem Mantel, Kortex oder vom inneren Kern-22. Diese Kügelchen decken die ganze Spore und finden Sie auf der Vene-förmige Strukturen sowie auf mittleren Flächen.
Abbildung 3: SEM von B. Subtilis (LAS72, RecA-YFP) Sporen auf Glasdeckgläser nach der Niederdruck-Plasmabehandlung gesprüht. Sporen nur Vakuum ausgesetzt und nicht zum Plasma (Steuerung) werden im (A). (B-F) Sporen, die mit zunehmender Dauer plasmabehandelte waren (15, 30, 60, 120 und 240 s). Sporen die plasmabehandelte 60 s oder länger erscheinen eine feiner abgestufte an ihrer Oberfläche als Kontrolle Sporen oder Sporen die Plasma-behandelt wurden für 15 und 30 Risse s. und Fissuren (weisse Pfeile) sichtbar an der Oberfläche der Sporen plasmabehandelte für 120 oder 240 s. sind Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Leben der Zelle Mikroskopie von plasmabehandelte B. Subtilis Sporen
Live Cell Mikroskopie der Wiederbelebung Sporen von B. Subtilis Stämme mit dem Ausdruck der Fluoreszenz-markierten Reparatur Protein RecA (RecA-YFP) wird durchgeführt, um die Keimfähigkeit und der Ausdruck der RecA-YFP der einzelnen Sporen in analysieren Reaktion auf die Plasmabehandlung. Hier verwenden wir zeitaufgelösten konfokale Laser-scanning-Mikroskopie, um Keimung, Auswuchs und Fortschreiten ins Wachkoma plasmabehandelte Sporen (Abbildung 4) im Hinblick auf eventuell bekannte Probleme z. B. Abschattungen zu folgen oder die Hemmung der Keimung durch hohe Dosen von monochromen Laser-Beleuchtung (Abbildung 1). Sporen ausgesetzt nur (Vakuumregelung, Abbildung 4A-C), weisen einige fluoreszierende Signale während der frühen Staaten der Spore Wiederbelebung (0 - 65 min, nicht gezeigt). Eine Zunahme der Fluoreszenzintensität, wahrscheinlich aufgrund der Ansammlung von RecA-YFP wird bei ≥ 65 Min. beobachtet, wenn vegetative Zellen gebildet werden und die ersten Zellen beginnen sich zu teilen. Alle diese Zellen beherbergen ein Fluoreszenzsignal angesammelt in mindestens einer Position in jeder Zelle. Fast alle Sporen (98 ± 2 %; 589 ± 14, n = 4) mit Vakuum behandelt, wie ein Steuerelement Keimen und entwickeln eine stabförmige Zellmorphologie mit eine ziemlich einheitliche Länge der einzelnen Zellen (Abbildung 4B-C). Im Gegensatz zu Sporen im Vakuum Steuerelemente behandelt Sporen für 15 s mit Plasma zeigen bereits eine geringere Keimfähigkeit von weniger als 75 ± 4 % (197 ± 8 Sporen, n = 3, Abbildung 4D-F), darauf hinweist, dass die Plasmabehandlung Schäden in Sporen, induziert die Keimung verhindert. Darüber hinaus unterscheidet sich die Morphologie der Zellen heraus von der Morphologie der Zellen in Steuerelementen. Zellen wachsen entweder zu ausgiebig langen Stangen (länger als im Vergleich zu Kontrolle) oder bleiben klein und bleiben in der Spore-Mantel (Abbildung 4G-ich). Darüber hinaus lösen Sie meist längliche Zellen mit zunehmender Größe der Zellen (weißer Pfeil Köpfe, Abbildung 4F). Fluoreszenz-Signale der RecA-YFP innerhalb der Zellen scheinen im Vergleich zu den Signalen in Kontrollzellen (Abbildung 4C, F) leicht gesteigert werden, aber keine signifikanten Unterschiede beobachtet werden (nicht dargestellt). Sporen die Plasma behandelt für 30 s Keimen bis zu 25 ± 6 % (99 ± 4 Sporen, n = 3) und vegetative Zellen sind insbesondere verzögert in Wachstum im Vergleich zum Steuerelement Sporen und Sporen nach 15 s Plasma-Behandlung. Vegetative Zellen sind eher klein und stabförmige aber variieren in der Länge (Abbildung 4G-ich). Jedoch können Zellen aller Größen lösen Sie während längeren Inkubationszeiten wie für Proben nach 15 s Plasma-Behandlung. Nach 60 s Plasma-Behandlung von weniger als 2 ± 2 % (8 ± 8 Sporen, n = 3) Sporen sind in der Lage, vegetative Zellen (Abbildung 4J-L) zu bilden. Sporen die Plasma-für 90 behandelt werden, 120 oder 240 s analysiert werden kann, aber sie zeigen kein Auswuchs oder Änderungen im Fluoreszenz-Ebenen der RecA-YFP (nicht dargestellt).
Abbildung 4: Konfokale Laserscanning-Leben Zelle Mikroskopie von B. Subtilis Sporen aus einem Stamm RecA-YFP nach Plasmabehandlung und Beginn der Keimung zum Ausdruck bringt. Sporen folgten im Laufe der Zeit (ein Bild pro 30 s) und Bilder für Zeitpunkten 0, 2 und 4 h angezeigt werden. (A-C) Sporen mit Vakuum nur behandelt und nicht mit Plasma (Kontrolle) Keimen und wachsen zu vegetativen Zellen (B) und geben Sie exponentiellen Wachstumsphase (C). (D-L) Sporen für unterschiedliche Dauer mit dem Niederdruck Argon-Plasma behandelt zeigen signifikante Unterschiede in ihrer Auswuchs im Vergleich zu Sporen des Steuerelements (siehe Text für Details). (D-F) 15 s Behandlung (weißer Pfeil Köpfe repräsentieren vegetative Zellen, die vor kurzem lysiert), (G-ich) 30 s Behandlung (schwarzer Pfeil Köpfe visualisieren vegetative Zellen, die klein waren und bleiben in der Spore-Mantel) und (J-L), 60 s nach 0 h, 2 h, 4 h Spore-Recovery-Zeit. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Sterilisation von Oberflächen mittels Niedertemperatur-Niederdruck-Plasma ist eine vielversprechende Alternative zu eher konventionelle Sterilisationsverfahren wie die Behandlung mit ionisierender Strahlung, Chemikalien (z.B. Gase wie H2O2 oder Ethylenoxid) oder trockene und feuchte Hitze23. Gewöhnliche Sterilisationsmethoden bieten meist eine effektive Sterilisation, aber sie sind dafür bekannt, die Einfluss auf des behandelten Materials und stellen ein potenzielles Risiko für den Betreiber. Niederdruck-Plasma bietet eine schnelle und homogene biologische Inaktivierung Zusammensetzung aus mehreren Komponenten wie UV-Photonen, freie Elektronen, Ionen und Atome oder Moleküle (z. B. ROS) verlassen. Daher kann LPP, Hitze- und Korrosionsbeständigkeit empfindliche Materialien wie thermoplastische Polymere für Implantate, elektronischen Instrumenten oder komplexe 3D-Strukturen angewendet werden. In der vorliegenden Arbeit wir demonstrieren die Anwendung eines solchen Testsystems, in welche Monolagen gespritzte B. Subtilis Sporen20 behandelt werden in einem bestimmten Niederdruck-Plasma-Reaktor, die vor kurzem im Detail7beschrieben wurde. Hellfeld mikroskopische plasmabehandelte Sporen möglicherweise ausreichend für eine Gesamtschätzung der Sterilisation Effizienz zu erhalten. Jedoch sind wir interessiert an die zugrunde liegenden Mechanismen der Niederdruck-Plasma und seinen Einfluss auf Spore Inaktivierung auf molekularer Ebene. In Kombination mit Fluoreszenz-Tracking-Mikroskopie ermöglicht es uns, die Aufschluss über die Details dieser bestimmte molekulare Reaktion in plasmabehandelte Sporen und potenziell geben uns Einblicke in den Mechanismus der grundlegenden Inaktivierung von Niederdruck-Plasma.
Hier konzentrieren wir uns auf die Analyse der Plasmabehandlung Effizienz und Effekte mithilfe von live Zelle Mikroskopie, wodurch folgende einzelne Sporen nach Beginn der Keimung. Bemerkenswert ist, zeigt diesen Ansatz ein paar neue Ergebnisse, die durch die Revitalisierung der gesamten Spore Bevölkerung mit Bestimmung der Zellzahl oder KBE Messung gewährleistet werden kann. Vor allem wirkt sich Plasmabehandlung der Sporen nicht nur die Kapazität der Auswuchs in einer Dosis-abhängigen Weise erwartungsgemäß von der Messung des Überlebens durch Bestimmung der KBE, sondern auch die Morphologie der vegetativen Zellen, die oft nicht in der Lage große Stäbe zu entwickeln zum Formular Septen entsprechend korrekte Zellteilung zusammen mit kleinen Zellen stecken in der Spore (15 s Plasma-Behandlung) oder Zellen bei einer reduzierten Länge (30 s Plasma-Behandlung). Beobachtungen von Zellen mit reduzierter Länge zeigte keine Wiederherstellung auf normale Zelle Länge zu späteren Zeitpunkten. Darüber hinaus live Cell imaging zeigt, die in späteren Phasen der Beobachtung die meisten morphologisch veränderten Zellen lysiert. Dies bedeutet, dass Schäden, die durch die Sporen bei Plasma-Behandlung erworben in einem späteren Stadium der Spore Revitalisierung, vermutlich aufgrund von DNA-Schäden nur wirksam ist und die Maschinen für Keimung und Auswuchs robuster gegenüber Plasmasterilisation als ist die Maschinen für vegetatives Wachstum benötigt. Bemerkenswert ist, Ausdruck der DNA-Reparatur RecA-Protein scheint niedrig und fast abwesend in Sporen und entsteht bei der Auswuchs und vegetative Phase, wie durch eine Zunahme der RecA-YFP Fluoreszenz17angegeben. Allerdings hilft auch ein leicht erhöhter RecA Ausdruck in entwachsen plasmabehandelte Sporen, im Vergleich zur Kontrolle Sporen nicht Zellvitalität quantitativ zu retten, weil die meisten Zellen lysiert oder nach Auswuchs, vor allem nach mehr als 3 h platzen Inkubation. Dieser Effekt kann mit live Zelle Filme auf DVD von Zeitraffer Bilder von gekeimten Sporen visualisiert werden. Wir können nicht ausschließen, dass dieser Effekt durch den besonderen Anbau Zustand überbetont ist wo die Zellen in einem monomolekularen Film über eine dünne Folie der Agar gezwungen sind.
Ein weiteres Ergebnis der Analyse von live Zelle Mikroskopie ist, dass partikuläre Verschmutzungen (z. B. Staubpartikel, andere Sporen) auf der Spore Monolage Oberfläche, die zugrunde liegende Sporen vor den schädlichen Auswirkungen des Plasmas schützen können. In solchen Fällen scheint sogar noch länger Plasmabehandlung ineffizient sein. Da solche Verunreinigungen schwierig sind, vollständig zu vermeiden, sollten alternative Plasmabehandlung Strategien getestet werden wie die Verwendung von planetaren Drehung während der Plasmabehandlung in Verbindung mit längeren Dauer der Behandlung. Die Analyse von SEM zeigt, dass die Spore-Mantel mit erhöhten Plasma-Behandlungsdauer perforiert ist, die im Einklang mit der Theorie der Plasma-vermittelte Wirkungen auf Materie22,24. Eine über längere Zeit (> 240 s) Plasma könnte sogar durchlöchern die verunreinigende Partikel kann beschädigen und die zugrunde liegende Sporen zu inaktivieren.
Die vorgestellte Protokoll für live Cell Mikroskopie von Spore Keimung und Auswuchs kann für andere Studien sowie geeignet. Die Sporen mit einer dünnen Schicht des Nährbodens zwingt die Sporen in einer deutlichen optischen Ebene und seitliche Bewegung einschränkt. Beide Effekte garantieren, dass Sporen und entwachsen Zellen im ausgewählten bildgebenden Rahmen bleiben. Ähnliche Ansätze wurden vor25 beschrieben aber weniger flexibel als die Methode hier beschrieben die ermöglicht die Wahl fast jede Probenträger (z. B. einen Objektträger, Deckglas oder Petrischale) bieten. In unseren Händen könnten andere vegetativen Bakterien durch live Zelle Mikroskopie mit der Agar-Abdeckung-Methode analysiert werden). In jedem Fall sollten sorgfältige Experimente durchgeführt werden, um mögliche Auswirkungen von Foto Schaden während live Cell imaging, zu bewerten, weil wir beobachtet, dass hohe Dosen von monochromatisches Laserlicht komplett Spore Keimung hemmen. Neben der Verkürzung der Beleuchtung, d. h. durch die Erhöhung der Beobachtung Intervalle, kann dieses Phänomen durch Verringerung der Laserintensität bzw. Öffnen der konfokalen Blende (Lochkamera) verhindert werden.
Fazit: unter den Techniken verwendet für die Untersuchung der Effizienz der Plasmabehandlung im Modell des gespritzten B. Subtilis Spore Monolagen, live Zelle Mikroskopie bietet einzigartige Einblicke in zelluläre Ereignisse während der Spore Wiederbelebung und bietet die Möglichkeit um die Dynamik der Fluoreszenz-markierten Proteine zu analysieren. Darüber hinaus die besondere Probenvorbereitung, d.h. Verkleidung der Sporen mit einer dünnen Schicht des Nährbodens, paradigmatisch für die Bildgebung von anderen Mikroorganismen Leben Zelle Mikroskopie werden könnte.
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Disclosures
Keine Interessenkonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren danken Andrea Schröder für ihre hervorragenden technischen Betreuung während Teile dieser Arbeit und Nikea J. Ulrich für ihre Unterstützung während dem Videodreh. Wir möchten auch Danke Lyle A. Simmons für seine großzügige Spende der Bacillus Subtilis Sorten: LAS72 und LAS24. Diese Arbeit wurde in Teilen durch Zuschüsse von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon PAK 728), PA (AW 7/3-1) unterstützt und der RM (MO 2023/2-1) und das DLR gewähren DLR-FuW-Projekt ISS Leben, Programm RF-FuW, Teilprogramm 475 (F.M.F, M.R. und r.m.). F.M.F. wurde durch ein Promotionsstipendium der Helmholtz-Gemeinschaft Raum Life Sciences Research School (SpaceLife) am Deutschen Aerospace Center (DLR) in Köln, Deutschland, unterstützt von der Helmholtz-Gemeinschaft (Helmholtz-Gemeinschaft) über einen Zeitraum von sechs Jahren (finanziert wurde Grant Nr. VH-Ko-300) und erhielt zusätzliche Mittel von der DLR, einschließlich Luft-und Vorstand und dem Institute of Aerospace Medicine. Die Ergebnisse dieser Studie werden in der Dissertation von Felix M. Fuchs berücksichtigt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two substance nozzle (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter |
| Luria Bertani Medium | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| Tube connectors | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN Polyamid tube | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| Glass slides | VWR | 48300-026 | |
| Electric Timer 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor cell chamber | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d=25 mm, round |
| MgSO4*7 H2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 * 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H2O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| Glucose | Merck | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Nutrient Broth (NB) | Merck | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
| 96-wellplate | ThermoFisher | 243656 | |
| Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) | Systat GmbH, Erkrath, Germany | n/a | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom | ibidi | 81168 |
References
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