Summary
本文描述了高脂喂养小鼠的生成和代谢特性, 作为饮食诱导的胰岛素抵抗和肥胖的模型。它还有详细的协议来执行口服葡萄糖耐受试验和胰岛素耐受试验, 监测葡萄糖代谢的全身变化在体内。
Abstract
肥胖是2型糖尿病发病的最重要的单一危险因素, 这种疾病的特点是抗胰岛素刺激的葡萄糖摄取和全身糖代谢的严重失代偿。尽管在了解葡萄糖代谢方面取得了相当大的进展, 但它在健康和疾病方面的调控的分子机制仍然 under-investigated, 而新的预防和治疗糖尿病的方法是迫切需要的。饮食衍生葡萄糖刺激胰腺分泌胰岛素, 这是主要调节器的细胞合成过程中的美联储状态, 从而平衡血糖水平保持系统的能量状态。慢性过度触发 meta-inflammation, 导致周围胰岛素受体相关信号的改变, 从而降低对胰岛素介导的葡萄糖处理的敏感性。这些事件最终导致空腹血糖和胰岛素水平升高以及葡萄糖耐受减少, 这反过来又成为胰岛素抵抗的重要指标。在这里, 我们提出了一个协议的产生和代谢特征的高脂饮食 (风) 喂养小鼠作为一个常用的模型, 饮食诱导胰岛素抵抗。我们详细说明了口服葡萄糖耐受试验 (OGTT), 它监测的周围处理的口服葡萄糖负荷和胰岛素分泌随着时间的推移。此外, 我们提出了一个协议的胰岛素耐受性测试 (ITT), 以监测全身胰岛素行为。这些方法和它们的下游应用代表了强有力的工具来表征小鼠的一般代谢表型, 以及专门评估葡萄糖代谢的变化。它们可能在胰岛素抵抗、糖尿病和肥胖的广泛研究领域中特别有用, 以便更好地了解发病机制, 并测试治疗干预的效果。
Introduction
在发达世界, 由于缺乏体力活动和加工食品的过量消费, 肥胖和糖尿病已经达到了流行病的程度, 这是由于迅速的城市化、工业化和全球化所造成的影响。虽然研究胰岛素抵抗和它的疾病, 如高脂血症和动脉粥样硬化, 已经在过去的几十年中获得突出, 复杂的生物机制, 调节代谢在健康和疾病仍然不完全了解, 仍然迫切需要新的治疗方法来预防和治疗这些疾病1。
胰岛素, 它的 counter-regulatory 激素胰高血糖素作为主要调节细胞能量供应和营养素平衡, 从而也保持适当的系统性血糖浓度2。葡萄糖本身是胰腺β细胞分泌胰岛素的主要刺激之一, 而其他营养素、体液因子以及神经输入则进一步改变了这种反应。胰岛素通过促进过剩的血糖扩散到肌肉和脂肪细胞, 并进一步激活糖酵解以及蛋白质或脂肪酸的合成, 从而触发了联邦政府的合成代谢过程。此外, 胰岛素抑制糖, 抑制肝脏葡萄糖的输出。慢性过量能量消耗和 meta-inflammation 导致高和周围胰岛素抵抗由于胰岛素受体表达的下调以及下游信号通路的改变, 从而导致受损对胰岛素介导的葡萄糖处理的敏感性以及对肝脏葡萄糖分泌不足的抑制作用3,4,5,6。
广泛的动物模型与遗传, 营养, 或实验性诱导疾病已被证明是优秀的工具, 研究胰岛素抵抗的分子机制和各种形式的糖尿病以及其伴随的疾病7.一个典型的例子是广泛使用, 并建立了良好的风诱导小鼠模型, 这是特点是快速体重增加, 由于饮食摄入与降低代谢效率相结合, 导致胰岛素抵抗8,9. 在动物模型和人类中, 空腹血糖和胰岛素水平的升高, 以及对葡萄糖管理的耐受性受损, 常被用于胰岛素抵抗和其他葡萄糖系统改变的指标代谢.因此, 监测血糖和胰岛素水平的基础状态或刺激后, 容易接近读数。
本议定书概述了风喂养小鼠的产生, 以及两种常用的方法, 口服葡萄糖耐受试验 (OGTT) 和胰岛素抵抗试验 (ITT), 这是有用的表征代谢表型和调查葡萄糖代谢的改变。我们详细地描述了 OGTT, 它评估了口服葡萄糖负荷和胰岛素分泌的处理时间。此外, 我们还提供了关于如何通过监测血糖浓度来对胰岛素的反应来检查全身胰岛素的行为的指导。本文中描述的协议已被广泛采用, 并已在多个研究中使用10、11、12。除了轻微的修改, 这可能有助于增加成功, 我们提供了实验设计和数据分析的指导方针, 以及有用的提示, 以避免潜在的陷阱。本文所描述的协议可以是非常强大的工具, 以研究遗传, 药理, 饮食, 和其他环境因素对全身葡萄糖代谢的影响, 并对其相关的疾病, 如胰岛素抵抗。除了刺激葡萄糖或胰岛素, 其他各种化合物可用于刺激, 根据个人研究的目的。虽然在这份手稿的范围之外, 许多其他下游应用可以在抽取的血样上进行, 例如对血糖和胰岛素以外的血液值进行分析 (例如、血脂和脂蛋白图谱) 以及详细代谢标志物的分析 (例如, 通过定量实时聚合酶链式反应 (PCR), 免疫印迹分析, 酶联免疫吸附试验 (ELISA))。进一步的流式细胞仪和荧光活化细胞分类 (组) 可用于研究不同单细胞种群的影响, 同时也可用于不分析。
总的来说, 我们提供了一个简单的协议来生成一个风诱导的小鼠模型, 同时进一步描述了研究全身代谢变化的两个强有力的方法, OGTT 和 ITT, 这可以成为有用的工具, 研究疾病的发病机制和开发新的治疗方法, 特别是在代谢相关疾病领域, 如胰岛素抵抗 & 糖尿病。
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Protocol
这里描述的所有方法都已得到维也纳医科大学动物护理和使用委员会的批准, 并根据欧洲实验动物科学协会联合会 (FELASA) 进行。请注意, 本议定书所述的所有程序都应在机构和政府批准之后以及在技术上精通的工作人员执行。
1. 风喂养小鼠
注意: 在12小时的光/暗循环中保持所有 C57BL/6J 小鼠, 可以免费获得食物和水。
- 在6周的年龄, 将老鼠放在风 (40-60% 脂肪卡路里) 上8-12 周以诱发肥胖, 同时喂养精益对照组低脂饮食 (LFD) (10% 脂肪卡路里)。
- 每周确定小鼠的体重。重量曲线应显示在两组相似的模式, 在风-美联储组更高的斜率。
2. OGTT
注: 如果在 OGTT 每15分钟内选择血液取样时间点, 则应同时执行最多15只小鼠的实验, 以便每只老鼠至少有1分钟的处理时间。
- OGTT 前一天的准备工作
- 将小鼠转移到一个有新鲜床上用品的笼子里, 在测试前一夜将它们快速送到 (14 小时), 同时确保小鼠能够获得饮用水 (例如, 在第二天早上下午6:00 将食物移除, 在上午8:00 开始时间)。
注意: 禁食小鼠过夜是标准的方法, 但较短的快速 (5-6 小时) 是更具生理作用的小鼠 (参见讨论了解详细信息)。
- 将小鼠转移到一个有新鲜床上用品的笼子里, 在测试前一夜将它们快速送到 (14 小时), 同时确保小鼠能够获得饮用水 (例如, 在第二天早上下午6:00 将食物移除, 在上午8:00 开始时间)。
- 实验当天的准备工作 (但在实验之前)
- 准备10毫升的20% 葡萄糖溶液 (溶解 d-(+)-葡萄糖在蒸馏水)。
注: 所有用于动物的试剂必须是药理级和无菌的。 - 为等离子收集准备一个96井板, 通过为每个取样时间点和每只老鼠填充一井, 与5µL NaEDTA (0.5 M EDTA, pH 8.0 在0.9% 氯化钠, 存贮在 RT)。在实验中, 把这个盘子储存在冰上。
注意: 有关详细的核对清单, 请参见补充图 1 。
- 准备10毫升的20% 葡萄糖溶液 (溶解 d-(+)-葡萄糖在蒸馏水)。
- 测量所有小鼠的体重并用永久性标记标记它们的尾巴, 以使小鼠易于区分 (例如, 鼠标 1 = 1 破折号, 鼠标 2 = 2 破折号,等)。
- 葡萄糖测量和血液取样 (图 2)
- 小心地用锋利的剪刀 (图 2中的 "变体 A") 切断 1-2 mm 的尾尖。在服用新的血液样本进行血糖测定之前, 一定要先清除掉第一滴血液以避免溶血或组织液的污染。画一个小的血液样本 (〜3µL) 的测量基础的血糖水平 (= 时间点 0) 与血糖。
注意: 检查并调整血糖上的测试条的电荷数。
注: 作为一种替代采血方法, 尼克在图 2中用锋利的手术刀刀片 ("变体 B") 的鼠标侧尾静脉。侧尾静脉通常是访问大约1/3 沿尾巴长度从尾巴尖端, 向基地的尾巴, 为多个样本。推荐使用局部麻醉膏。在动物被送回笼子之前, 至少三十年代在软组织上应用手指按压来阻止血液流动。 - 收集血液样本 (大约30µL) 使用新鲜毛细管 (保持毛细血管管水平)。用吸管把吸管顶端放在毛细管末端的顶部, 并小心地将收集到的血液放入96孔板的井中, 同时避免气泡, 从而清空毛细管管。对所有小鼠重复这个过程-一次一个。
注: 作为血液收集的替代品通过毛细管, 使用的吸管调整到正确的体积 (如, 30 µL) 收集血液, 或收集一滴血从尾部石蜡膜, 并吸管到 EDTA 溶液。严格避免石油果冻与血液或血糖试纸的接触, 因为它可能影响随后的葡萄糖和胰岛素测量。
注意: OGTT 对老鼠很有压力: 瘦老鼠在一夜之间会失去大约15% 的体重。此外, 不同时间点的血液取样会导致大量失血。为了便于采血, 可以用凡士林小心地按摩老鼠尾。
注: 机构指南可限制在规定时间内采集的血液的允许数量。取样量和 timepoints 应调整到不超过允许的最大值。应使用小鼠的体重来计算所允许的总血液提取量。
- 小心地用锋利的剪刀 (图 2中的 "变体 A") 切断 1-2 mm 的尾尖。在服用新的血液样本进行血糖测定之前, 一定要先清除掉第一滴血液以避免溶血或组织液的污染。画一个小的血液样本 (〜3µL) 的测量基础的血糖水平 (= 时间点 0) 与血糖。
- 根据体重计算葡萄糖溶液的体积 (1 克葡萄糖/千克体重; 这可以增加到3克/千克), 由口服胃对每只老鼠进行管理。例如, 一个体重为30克的老鼠需要150µL 20% 葡萄糖溶液来管理30毫克葡萄糖。
注: 以葡萄糖为基础的剂量对鼠标的重量是标准程序。如果身体成份数据是可利用的, 葡萄糖的剂量为 OGTT 应该根据稀薄的身体质量计算 (参见讨论为细节)。 - 葡萄糖管理
- 准备一切在整个实验期间 (定时器, 实验记录表, 葡萄糖监测和试纸, 毛细血管, 注射器, 葡萄糖溶液, 96-井板, 手术刀, 计算器, 平衡, 永久性标记, 工作台纸,吸管与小费, 和手套)。
- 对于葡萄糖的应用, 通过牢牢抓住它的颈背来抑制老鼠。对颈部周围的皮肤施加足够的硬度, 防止老鼠扭出束缚, 并适当地把头向后倾斜。还要确保鼠标能正常呼吸。
注: 一旦葡萄糖管理开始, 良好的时间管理是非常重要的。 - 小心地管理葡萄糖溶液 (基于步骤 2.5) 直接进入胃使用喂养针。小心地将喂食针通过口朝食道。让老鼠吞下针头: 针头完全下沉到小鼠的下食管/胃里。然后注入葡萄糖溶液 (图 3a)。
- 如果遇到任何阻力, 或如果动物立即挣扎, 撤回针, 并重新定位它。在第一次胃后立即启动计时器, 并在1分钟间隔内将葡萄糖管理给所有其他小鼠。
注意: 将一滴葡萄糖溶液直接从喂食针放到老鼠嘴里可能会有帮助, 这会刺激舔舐和吞咽, 从而方便插入针头。插入喂食针时不要施加压力, 因为这可能会严重伤害动物。
- 如果遇到任何阻力, 或如果动物立即挣扎, 撤回针, 并重新定位它。在第一次胃后立即启动计时器, 并在1分钟间隔内将葡萄糖管理给所有其他小鼠。
- 15分钟后, 测量血糖水平与血糖, 并另外采取血液样本 (〜30µL) (详见详细说明在步骤 2.4) 的每一个鼠标在相同的顺序, 因为他们被注射。
注意: 时间管理是非常重要的;尽可能使用与胃相同的时间间隔。让小鼠尽可能自由地移动, 并在整个过程中限制最小化以减少压力, 这可能会改变结果。用一只手的牛奶尾巴, 并收集与其他血液。 - 根据预期结果重复步骤 2.7 (例如, 在30、45、60、90、120、150和葡萄糖管理后180分钟)。如果选定的时间点超过120分钟, 确保小鼠能够获得饮用水。确保老鼠总是能接触到饮用水。当实验完成后, 将小鼠返回到装有食物和水的笼子里。
注意: OGTT 对老鼠来说很累人。因此, 在进行下一次代谢测试之前至少要等待1周, 例如 ITT。 - 实验后, 离心机血液样本在 2500 x g, 30 分钟, 4 ° c。将上清液 (等离子) 转移到板的空井, 并将其贮存在-20 ° c 直到分析。
- 如果存在, 则记录样本的溶血 (见3节)。
- 使用商业上可用的 ELISA 试剂盒确定血浆胰岛素水平 (请参见材料表), 按照制造商的说明进行操作。
注: 根据禁食状态以及对被调查小鼠的新陈代谢情况, 在这种化验过程中可能出现困难: 隔夜空腹胰岛素水平 (时间点 0) 非常低, 因此接近检测限度。为了避免这个问题, 建议的血浆体积的数量加倍, 相应地将 ELISA 法的结果减半。另一方面, 如果小鼠在 OGTT 时达到胰岛素峰值, 特别是在风喂养的小鼠, 胰岛素水平可能超过检测限度: 稀释样本 (例如, 10 倍与 0.9% NaCl) 和重复 ELISA 检测。血浆样品中的溶血可能导致胰岛素的降解, 导致读数值的减少。降解取决于样品中的时间、温度和血红蛋白浓度。始终保持溶血样品冷或冰, 以减少胰岛素的退化。
3. ITT
注意: 在执行 ITT 时, 同样的预防措施也必须适用于 OGTT (处理老鼠、血液、血糖和凡士林等)。例如, 所有的注射应在15分钟内进行1分钟的间隔, 如果15只老鼠进行并行测试。对于 ITT, 随后收集的血液样本毛细管管是可选的。
- 实验前的准备
- 在注射胰岛素前至少2小时的快速小鼠, 同时确保小鼠能够饮用饮用水 (例如, 在上午8:00 时取出食物, 在2-5 小时后测试小鼠)。
- 稀释胰岛素 1:1, 000 在0.9% 氯化钠 (股票: 100 u/毫升胰岛素; 工作浓度 0.1 u/毫升), 并准备20% 葡萄糖 (d-(+) 葡萄糖溶解在蒸馏水中), 以管理, 如果老鼠变得低血糖。
注意: ITT 通常是在短时间内进行, 以避免低血糖, 否则可能发生在夜间禁食动物。所有用于动物的试剂都必须是药理级和无菌的。
- 测量小鼠的体重, 标记尾巴, 用锋利的剪刀剪尾尖, 并测量2.4 步中 OGTT 的基本血糖水平。
- 胰岛素注射液
- 注射胰岛素腹腔 (0.75 U 胰岛素/千克体重, 预先计算), 用颈背法抑制小鼠。
- 使用新鲜的, 无菌27或30针为每种动物, 以避免不适和任何注射现场感染的风险。
注意: 皮肤的消毒可以延长胰岛素的持续时间, 因此会对动物造成额外的干扰。因此, 不建议这样做。 - 将小鼠头部向下倾斜, 露出动物腹侧。将无菌针放在动物腹部右下象限30°角的斜面上 (图 3b)。在第一个鼠标插入后立即启动计时器。
注: 低剂量 ITTs (0.1 U/千克) 可进行特别评估肝胰岛素敏感性。至于 OGTT, 根据体重计算注射量是标准的程序, 而根据瘦体质量的剂量是首选, 如果身体组成的数据是可用的。
- 测量所选时间点的血糖水平 (例如, 在15、30、45、60和90分钟之后)。
注: 由于胰岛素在小鼠13中有短时间的10分钟, 胰岛素治疗后的晚期差异 (如如, 2 小时后) 可能不反映胰岛素作用的直接作用。管理20% 葡萄糖溶液, 以防老鼠变成低血糖 (血糖水平低于35毫克/dL), 并有死亡的危险。 - 在最后的时间点后, 将小鼠放回他们准备好大量食物和水的笼子里。
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Representative Results
图 1说明了在饮食上对小鼠进行代谢分的示意图时间表。在大约6周的年龄, 老鼠应该放在一个风, 而 LFD 组可以作为对照组。重要的是, 体重应该每周确定, 以观察是否有预期的体重增加。任何形式的压力 (例如、噪音或攻击性的男性行为) 都会影响体重增加, 应立即消除。每组小鼠的饮食实验应包括至少10小鼠, 因为这些饮食-实验是耗时的, 和异常点频繁 (例如, 小鼠不增重或小鼠的葡萄糖或胰岛素水平异常)。在选定的时间段之后 (根据研究假设和预期变化的时间点), OGTT 和 ITT 可以进行葡萄糖耐受和胰岛素作用的评价。本文选择了代谢试验的晚期时间点。
重要的是, 应该有一个恢复时间至少1周之间的 OGTT 和 ITT, 因为这些实验导致了大量的失血, 因此对老鼠非常压力。如果血液收集量减少 (例如, 如果执行 ITT 没有额外的血液收集第一), 这一恢复期也可以缩短或省略, 符合指南的多血吸取动物的14, 15、16、17。
在这项大型研究中, 总共有 60 C57BL/6J 小鼠, 在6周 (n = 30/组) 的年龄, 一半的老鼠被设置在风或 LFD 上, 体重增加在饮食上监测16周。风的消耗导致体重显著增加, 如图 4所示。在6周的年龄, 两组的体重为20.2 克。而小鼠在 LFD 显示一个一致的, 略有增加的体重 (31.2 克± 2.7) 在观察期间, 小鼠对风迅速增加他们的体重, 特别是在第一周和达到他们的体重最大后, 16 周的饮食。虽然在实验中体重曲线显示出类似的模式, 但与 LFD 喂养的小鼠相比, 风组的小鼠的体重达到了1.5 到2倍的高 (44.4 克± 4.0)。
为了研究两个队列的代谢表型, OGTT (图 5) 和 ITT (图 6) 进行了测试。由于小啮齿类动物的血容量有限, 点 (POC) 检测糖尿病人 (血糖) 是用来监测血糖水平在这些代谢分实验。如图 2所示, 血糖监测器易于使用, 只需一小滴血, 并在几秒钟内显示血糖水平以供参考。图 5显示了在 OGTT 期间绝对葡萄糖 (图 5ab) 和绝对胰岛素 (数字 5c) 的时间过程。一般来说, 一个健康的小鼠与正常的葡萄糖耐受显示一个特征迅速上升的血糖, 达到峰值15-30 分钟后, 葡萄糖的挑战。
随后的葡萄糖摄取, 主要由肌肉, 脂肪组织, 和肝脏组织导致的血糖浓度逐渐下降。在所有的实验中, LFD 喂食小鼠作为葡萄糖耐受对照组, 并因此实现了预期的新陈代谢情况: 血糖水平达到240毫克/dL 的峰值, 葡萄糖管理后, 立即到达约15分钟其次是减少达到基本水平约60分钟后, 葡萄糖的挑战, 表明适当的葡萄糖消除。与此形成鲜明对比的是, 风小鼠在大约320毫克/dl-葡萄糖中达到峰值, 几乎没有葡萄糖的处理, 这表明葡萄糖的耐药性。当两组之间的血糖水平在禁食状态已经不同 (如本代表的例子) 时, 应执行曲线 (联合自卫队) 以上基线葡萄糖的计算, 以验证结果 (图 5a-b)。
此外, 循环血胰岛素水平是确定的使用胰岛素 ELISA 测试 (图 5c), 以提供更多的信息的基础病理生理学在这个模型。尽管对照组的胰岛素水平几乎没有变化, 喂食风的小鼠的空腹水平比对照组高出16倍, 而且胰岛素反应显著增加, 表明风诱导的代偿高为试图抵消减少的葡萄糖消除能力, 这可能是由胰岛素抵抗造成的。但是, 请注意不要诠释 OGTT 的结果, 因为这项测试不直接评估胰岛素的作用, 也不应用于总结胰岛素抵抗的声明。
为了测量风喂养小鼠的胰岛素敏感性, 在 OGTT (图 6a) 后的1周内执行了 ITT。在这种检测中, 胰岛素分泌后血糖浓度下降的程度代表了全身胰岛素作用的效率。风喂养的小鼠显示, 与 LFD 控制组相比, 在 ITT 的所有时间点, 血糖水平下降的减少, 从而提示胰岛素抵抗。ITT 的结果通常是作为葡萄糖水平的时间过程, 但此外, 在基线葡萄糖下面的逆联合自卫也可以显示在图 6b中。如果比较的组有类似的空腹血糖水平 (这不是本实验的情况), 在 ITT 期间的葡萄糖水平也可以显示为基础葡萄糖的百分比。和小鼠一样, 如果血糖水平低于80毫克/dL18, counter-regulatory 对胰岛素的反应就会被激活: 在特定的老鼠模型中, 这种 counter-regulatory 反应的缺陷可能被误解为胰岛素敏感性的增加。在 HFDs 和随后的代谢表型实验中, 异常可能经常发生。对风不增重的小鼠, 或那些表现出异常空腹血糖和/或胰岛素水平的老鼠, 应排除在分析之外。对于后两种方法, 可以分别对每个实验组执行异常值测试 (例如, 格拉布斯测试)
在本研究中, 我们展示和解释了代谢实验的数据在体内, 进行了小鼠饮食诱导肥胖, 葡萄糖不耐受, 胰岛素抵抗, 并与对照组与正常体重。与年龄匹配对照小鼠相比, 肥胖小鼠的糖耐量和高与胰岛素抵抗相一致;这是使用行之有效的, 可靠的, 时间和预算友好的方法发现的, 这是相对容易执行。糖耐量、胰岛素水平以及胰岛素敏感性的差异, 都是由 OGTT 和 ITT 所提出的方法所获得的, 通常有助于计划下一步的研究, 这可能包括更复杂的实验, 例如血糖或胰岛素钳, 以及实验与孤立的胰岛。
图1。示意性时间表的建议饮食制度和代谢实验在体内。为了研究风在小鼠体内的代谢作用, 实验组的动物被放置在风大约6周的年龄, 而对照组则接受 LFD。小鼠的体重应每周确定, 以评估适当的体重增加。在大约12星期节食 (或选择的时间点根据研究假说) 之后, 老鼠的新陈代谢的表型被评估由 OGTT 然后1星期恢复时间和随后一个 ITT。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。代谢实验中的血液取样方法.对于 OGTT 以及 ITT, 在这里需要反复采血, 我们建议用锋利的剪刀 (变体 a) 仔细切割一条1-2 毫米的尾巴尖端的血液, 然后用血糖和进一步收集血液与毛细管, 以确定胰岛素水平和其他相关的血液价值。另外, 血液也可以通过尾静脉 (变异 B) 或动脉插管 (未显示) 进行取样。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。口服胃葡萄糖 (a) 和腹腔内胰岛素注射液 (b).口服葡萄糖的代表性图像在 OGTT (a) 和腹腔注射胰岛素在 ITT (b) 期间使用喂养针。有关详细说明, 请参阅协议。请单击此处查看此图的较大版本.
图4。风喂养和 LFD 喂养的 C57BL/6J 小鼠体重增加.C57BL/6J 鼠要么设在60% 风, 要么 10% LFD 作为一个控制, 为期20周。而小鼠在风显示了预期的体重增加, 特别是在第一周的饮食, LFD 喂养小鼠显示几乎恒定的体重在观察期间。结果是平均± SEM. *p < 0.05, ** < 0.01, *** < 0.001。n = 每组30。方差分析和 Tukey 的post测试用于测试差异。请单击此处查看此图的较大版本.
图5。OGTT 在风喂养和 LFD 喂养的 C57BL/6J 动物中进行.(a) OGTT 期间的葡萄糖水平。在隔夜斋戒以后, 葡萄糖 (镁或 dL) 水平被测量在斋戒状态和 15, 30, 45 和60分钟在管理葡萄糖解答口头通过胃 (1 g 葡萄糖/公斤) 之后。风组的葡萄糖水平在禁食状态以及葡萄糖挑战后升高。在15分钟后, 增幅达到峰值, 其次是延迟和缓慢下降。结果是平均± SEM. *p < 0.05, **p < 0.01, **p < 0.001。n = 每组30。使用方差分析和 Tukey 的post测试来执行统计。(b) 在 OGTT 期间曲线下的葡萄糖区 (联合自卫队)。为了计算基线修正的联合自卫队, 基础葡萄糖水平 (时间点 0) 从所有后来获得的血糖水平分别减去每个小鼠, 然后计算个别 AUCs。在基线葡萄糖之上的联合自卫队显示了风喂养小鼠的葡萄糖抵抗。使用方差分析和 Tukey 的post测试 (葡萄糖水平) 或学生的两个尾端t测试 (联合自卫队) 进行统计。(c)OGTT 期间的胰岛素水平。在通过胃 (1 克葡萄糖/千克) 口服葡萄糖溶液后, 在4小时和15、30和60分钟的空腹时间内测定胰岛素 (ng/毫升) 水平。风喂养的小鼠不仅补偿了葡萄糖注射液的胰岛素水平增高, 而且还开始并结束了与对照组相比胰岛素水平升高的 OGTT。结果是平均± SEM. *p < 0.05, **p < 0.01, **p < 0.001。n = 每组30。使用方差分析和 Tukey 的post测试来执行统计。请单击此处查看此图的较大版本.
图6。ITTs 在风喂养和 LFD 喂养的 C57BL/6J 动物中进行.(a) 在 ITT 期间的葡萄糖水平。葡萄糖 (毫克/dL) 水平测量空腹状态和 15, 30, 45, 60 分钟后注射胰岛素腹腔 (0.75 U 胰岛素/千克)。在 ITT, 风喂养的小鼠表现出高血糖水平。胰岛素注射后, 风喂养小鼠血糖水平没有得到充分降低。结果是平均± SEM. *p < 0.05, **p < 0.01, **p < 0.001。n = 每组30。使用方差分析和 Tukey 的post测试来执行统计。(b) 在 ITT 期间, 曲线下的葡萄糖区 (联合自卫队)。为了计算基线校正的反相联合自卫, 基础葡萄糖水平 (时间点 0) 是从所有后来得到的血糖水平减去每个单独的鼠标。价值被倒置了 (增殖与-1), 跟随单独 AUCs 的演算。由于风喂养的小鼠在 OGTT 时血糖水平较高, 因此风喂养的小鼠与对照组相比, 基线矫正的反式联合自卫队更低, 这进一步提示胰岛素敏感性降低。使用方差分析和 Tukey 的post测试 (葡萄糖水平) 或学生的两个尾端的t测试 (反联合自卫队) 进行统计。请单击此处查看此图的较大版本.
补充图1。实验准备检查表.请单击此处下载此文件.
补充图2。ITTs 期间的胰岛素水平.两组胰岛素注射后, LFD 与风喂养组的血浆胰岛素水平呈相似的动态变化。与对照组相比, 风小鼠的基底胰岛素水平明显增高。此外, 风喂养的小鼠的胰岛素水平的增加是更强的, 这可能是部分原因, 如果注射胰岛素的数量是根据全身质量 (常规正常化方法) 计算的瘦体质量高估。在这个实验中进行。然而, 胰岛素反应在风-喂食组中受损 (血糖水平不足), 从而进一步强调了这些动物的胰岛素抵抗状态。结果是平均± SEM. *p < 0.05, **p < 0.01, **p < 0.001。使用方差分析和 Tukey 的post测试来执行统计。请单击此处下载此文件.
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Discussion
随着糖尿病和相关疾病在世界人口中的高患病率, 对疾病的分子机制、预防和治疗的研究有很强的要求19。该协议描述了建立风小鼠的成熟方法, 一种用于代谢研究的健壮动物模型, 以及 OGTT 和 ITT 的传导, 它们是评估全身代谢改变的有力工具。如胰岛素抵抗。本文所提出的方法可能有助于研究疑似基因、环境因素以及药理、膳食、物理或基因治疗对全身葡萄糖代谢的作用9,10。虽然葡萄糖是 OGTT 胰岛素分泌的主要刺激物, 但所提出的协议可能会被 (co) 应用于其他物质, 如其他的营养素和荷尔蒙, 这些药物可以改变胰岛素反应2。同样, 根据个别的研究问题, 可以通过 (共同) 应用其他物质 (例如、胰高血糖素或儿茶酚胺) 来修改 ITT 协议。所描述的 OGTT 和 ITT 协议的主要读数是血糖和胰岛素浓度;然而, 其他血液参数的测量, 如胰高血糖素, 脂肪酸, 和脂蛋白水平, 以及各种代谢标记的 mRNA 和蛋白质水平, 也可能是有用的, 这取决于研究的目的。
研究者应该知道, 低血糖、胰岛素分泌、胰岛素作用以及整体代谢表型的神经内分泌反应强烈依赖于小鼠的遗传背景10。在这里, 我们利用 C57BL/6J 基因背景下的小鼠作为风诱导的糖尿病模型, 由于在烟酰胺核苷酸 transhydrogenase 基因中自然发生的缺失, 在葡萄糖介导的胰岛素分泌中有部分损害20, 使其成为研究肥胖相关胰岛素抵抗的合适模型8,9。然而这里描述的协议也许也被使用到新陈代谢描述胰岛素抵抗和糖尿病的可选择的老鼠模型, 通常基于基因病症或在β细胞的化学破坏21,22,23. 实验设计中的预防措施包括测试年龄匹配的小鼠, 因为胰岛素敏感性随着年龄的增长而下降,24, 并进一步进行实验的小鼠从同性。由于基因突变和治疗可能导致不同的表型根据性别25,26, 也可能是可取的调查两性分开。
本议定书所描述的血液取样方法不需要麻醉, 这可能会影响心率、血流量和葡萄糖代谢, 产生 non-physiological 结果10。另外, 也可以植入动脉导管, 在实验过程中不需要处理压力就可以进行血管取样, 但也增加了努力、成本以及动物损失的风险。对于 OGTT, 老鼠通常在一夜之间禁食 (14-18 小时), 这在老鼠体内引发了一种分解代谢状态, 强烈消耗肝脏糖原。虽然这会降低基线血糖水平的变异性, 但长时间的快速降低了代谢率, 提高了小鼠的葡萄糖利用率, 这与人类的情况不同10,27。由于喂食模式的小鼠也不模仿人类的行为, 因此它可能是更具生理性的, 以执行 OGTT 后短快。由于昼夜节律对全身糖代谢有很强的影响28, 重要的是要考虑在一天中的什么时候进行这里所描述的实验。为了研究小鼠在活动期 (暗相中) 的代谢, 暗循环可能对产生更多的生理结果有价值。
所描述的管理路线也可能因所测试的特定假设而异。葡萄糖耐受试验时口服葡萄糖会导致更多可变的胰岛素分泌, 如胃排空, 胃肠动力, 激素 (incretins), 神经输入修改和延长胰岛素应答2, 10. 在被描述的 "肠作用" 期间, 葡萄糖的吸收从肚腑导致释放胃肠激素例如 GLP1, 加强口服葡萄糖被提供的胰岛素发行 "29。为了规避这些影响, 葡萄糖丸也可以静脉注射 (IVGTT) 或腹腔 (IPGTT)。根据选择的分娩路线, 葡萄糖和胰岛素的旅行都有明显的差异。与 OGTT 相比, 腹腔内葡萄糖的管理导致血糖水平的升高和延长, 而血浆中的胰岛素水平在延迟, 但更持久的时尚30。同样, 静脉注射葡萄糖管理的特点是延迟胰岛素反应31。胰岛素水平的急剧增加以及在 OGTT 期间获得的更健壮的联合自卫队胰岛素数据表明, 口服葡萄糖可能更敏感, 可以检测到喂食与风喂养小鼠的葡萄糖代谢的变化30,31. 在动物和技术困难的严重性方面, 胃和腹腔分娩都是相似的, 而静脉用药通常更困难, 对小鼠的压力也更大32。口服管理进一步消除了10-20% 的错误率在腹腔注射到肠腔或胃, 这可能会影响葡萄糖的传递率和再分配33,34。
虽然它是葡萄糖交付的最生理的路线, OGTT 是有限的在会计仅葡萄糖吸收, 而一顿全餐也包含蛋白质, 复杂碳水化合物, 油脂, 纤维和微量营养素。在 OGTT 期间的标准方法是以葡萄糖剂量为基础的体重的鼠标, 而通常1-3 克的葡萄糖/千克体重的管理35,36。在某些情况下, 可能需要较高的葡萄糖负荷超过1克/千克, 以揭示一个受损的葡萄糖耐受30。许多小鼠肥胖和糖尿病模型的特点是身体成分的改变, 特别是脂肪大量增加, 而瘦体重 (肌肉, 大脑和肝脏), 这是葡萄糖处置的主要部位不改变比例。传统的正常化方法, 体重将导致不成比例高剂量的葡萄糖, 其中瘦组织在肥胖的小鼠暴露与肥胖小鼠。这种偏倚随着葡萄糖用量的增加而升高30。因此, 如果身体成份数据是可利用的, 最佳葡萄糖 (OGTT) 的剂量和胰岛素 (ITT) 应该根据稀薄的身体质量被计算, 如果人体成分的资料是37。如果由于技术上的限制而无法评估身体成分, 则应根据体重 (补充图 2) 进行剂量测定, 而应用固定剂量, 如在人类 OGTT 中, 应是最后的手段, 如果在小鼠中执行这些测试10,35,36。在所提出的协议, 一个 hand-held 全血监测仪是用来测量血糖水平, 这是有利的测试, 如 OGTT 和 ITT, 需要多取样的小血容量。然而, 这些设备是为人的血液设计的, 有一个减少的动态范围。另外, 在常规实验室中, 通过全自动化学分析仪, 可以在收集的血浆样本中测量葡萄糖水平,例如。除了胰岛素外, C 肽可以被描述为一个更直接的β细胞分泌功能的指示物, 它不是由肝脏提取的与胰岛素的对比38,39。如果糖需要被评估, 丙酮酸耐受测试 (PTT) 也许被申请, 是这里被描述的协议的另一个变形, 监测血糖远足在丙酮酸丸的管理以后40。
这里描述的 OGTT 和 ITT 的方法通常可以解释观察到的糖耐量差异, 并可能进一步有助于建议下一步, 更复杂的实验应进行 (例如, 血糖钳或研究孤立的小岛)。总之, 我们提出了一个简单的协议, 生成一个风诱导的小鼠模型, 并进一步描述 OGTT 和 ITT, 这是强大的工具, 以评估代谢表型的变化在体内, 可能有助于研究代谢相关的疾病机制以及新的治疗方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了维也纳市市长的医疗科学基金和Österreichische 德国 Laboratoriumsmedizin 和 Klinische 瓦的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | LFD/HFD |
| Accu Chek Performa - Glucometer | Roche | 6870228 | OGTT/ITT |
| Accu Chek Performa - Strips | Roche | 6454038 | OGTT/ITT |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | OGTT |
| Actrapid - Insulin | Novo Nordisk | 417642 | ITT |
| Reusable Feeding Needles | Fine Science Tools | #18061-22 | OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice) |
| Omnifix-Fine dosing syringes | Braun | 9161406V | OGTT/ITT |
| Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm) | Braun | 304000 | ITT; lean mice |
| Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm) | Braun | 4657705 | ITT; mice on HFD |
| 96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible | Braintree Scientific, Inc. | SP0016 | OGTT |
| Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit | Crystam Chem | 90080 | OGTT |
| Rodent Diet with 60% kcal% fat | Research Diets Inc | D12492 | mice on HFD |
| Rodent Diet with 10% kcal% fat. | Research Diets Inc | D12450B | mice on LFD |
| BRAND micro haematocrit capillary | Sigma-Aldrich | BR749321 | OGTT/ITT |
| Vaseline - creme | Riviera | P1768677 | OGTT/ITT |
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