我们在人胚胎肾细胞（HEK293）中异位表达了绿色荧光蛋白标记的NMDA受体NR1亚基，作为抗原用于检测疑似自身免疫性脑炎患者血液中针对NMDA受体的自身抗体。这种简单的方法可能适用于临床环境中的筛查。
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摘要
摘要
抗NMDA受体自身抗体的存在可导致患者出现多种神经精神症状，称为抗NMDA受体自身免疫性脑炎。准确诊断该疾病的关键在于检测血液或脑脊液（CSF）中是否存在针对NMDA受体的特异性自身抗体。NMDA受体是一种离子通道蛋白复合物，包含四个亚基，其中包括两个必需的NMDA受体1亚基（NR1）以及一个或两个NMDA受体2A亚基（NR2A）、NMDA受体2B亚基（NR2B）、NMDA受体2C亚基（NR2C）或NMDA受体2D亚基（NR2D）。据报道，抗NMDA受体自身抗体的表位位于NMDA受体NR1亚基的胞外N端结构域。本研究的目标是建立一种简便的基于细胞的免疫荧光检测方法，可用于筛查血液中是否存在针对NMDA受体NR1亚基的自身抗体，从而促进抗NMDA受体自身免疫性脑炎的临床与基础研究。
引言
抗NMDA受体自身免疫性脑炎是一种新近被认识的疾病实体，可发生于所有年龄段的患者，且主要影响女性患者1,2。在病因初始不明的脑炎患者中，它是诊断频率最高的脑炎类型之一3。抗NMDA受体脑炎患者通常先出现头痛或发热等前驱症状，随后迅速出现意识水平改变以及多种急性神经精神症状，包括激越、易激惹、焦虑、失眠、幻觉、妄想、攻击行为、怪异举止、运动异常、自主神经功能紊乱和癫痫发作4,5。对该疾病进行早期识别并及时采用免疫治疗，对于改善患者预后甚至实现完全康复具有重要意义6。因此，建议将抗NMDA受体自身免疫性脑炎作为表现为急性或新发精神病性特征患者的重要的鉴别诊断之一7,8。
除了临床特征外，检测血液或脑脊液中抗NMDA受体的自身抗体对于准确诊断抗NMDA受体自身免疫性脑炎至关重要9。目前，大多数用于检测抗NMDA受体自身抗体的免疫学检测方法仅在少数研究实验室中可获得
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方案
该研究已获得中国台湾桃园市林口长庚纪念医院机构审查委员会的批准（102-2577A3）。
1. NR1-GFP 表达质粒的制备
- 在无菌的 1.5 mL 离心管中，将 10 ng NR1-GFP 质粒与 100 µL 大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α 感受态细胞混合，用移液器轻轻吹打混合液 4–6 次，然后将离心管置于冰上孵育 20 分钟。
- 将离心管在 42 °C 水浴中孵育 1 分钟，从水浴中取出离心管，向管中加入 1 mL LB 培养基（Lysogeny Broth），然后将离心管置于 37 °C 摇床中振荡培养 1 小时。
- 取 50 µL 混合液涂布于含氨苄青霉素（0.1 mg/mL）的 LB 琼脂平板上，将平板置于 37 °C 培养箱中过夜培养。
- 用无菌枪头从过夜培养的 LB 琼脂平板上挑取单个菌落，将枪头在含有 5 mL LB 培养基和氨苄青霉素（0.1 mg/mL）的细菌培养管中轻轻旋转混匀。将培养管置于 37 °C 摇床中振荡过夜培养。
- 将 3 mL 过夜培养的菌液转移至含有 250 mL 无菌 LB 培养基和氨苄青霉素（0.1 mg/mL）的 500 mL 三角瓶中。将三角瓶置于 37 °C 振荡培养。使用分光光度计定期检测菌液在 600 nm 波长下的光密度（OD），直至 OD600 达到 0.6–1.0。
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结果
按照本方案第1节所述步骤，从250 mL细菌培养物中平均可获得200–300 µg无内毒素的表达质粒NR1-GFP和GFP。根据方案第2节所述，将100 ng/孔的表达质粒用于转染培养于48孔板中的HEK293细胞。转染后24–30小时，细胞表达NR1-GFP，可在荧光显微镜下检测到GFP重组蛋白。图1A显示表达NR1-GFP的宿主细胞图像，而图1D显示表达GFP的细胞图像。绿色荧光信号可作为实验质量控制指标：在荧光显微镜下，约30%的细胞呈现绿色荧光信号。图1A和1D分别展示表达NR1-GFP的宿主细胞图像。绿色荧光信号可作为实验质量控制指标：在荧光显微镜下，约30%的细胞呈现绿色荧光信号。表达NR1-GFP的细胞用于检测人血浆样本中是否存在抗NMDA受体自身抗体。
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讨论
文献中已报道多种基于细胞的免疫学检测方法，用于筛查抗NMDA受体的自身抗体，包括活细胞免疫荧光检测11、固定细胞免疫荧光检测9以及基于流式细胞术的检测方法14。活细胞免疫荧光检测应在表达NR1蛋白的细胞制备后尽快进行，而基于流式细胞术的检测则需要经过培训的技术人员和特殊设备。固定细胞免疫荧光检测是一种更为便捷的方法，适用于临床检测环境。因此，许多研究采用商业化的间接固定细胞免疫荧光检测试剂盒，用于筛查血清和脑脊液样本中的抗NMDA受体自身抗体12,15。所使用的试剂盒（见材料表）包含已固定且异源表达NMDA受体重组NR1亚基的HEK293细胞。该检测方法在血清和脑脊液样本中抗NMDA受体IgG抗体的检测中表现出优异的性能12。在本实验方案中，我们采用了与试剂盒制造商推荐方法相同的操作流程，唯一区别在于我们使用了NR1-GFP表达质粒.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由长庚医学基金会资助（资助编号 CMRPG3C1771、CMRPG3C1772、CMRPG3E0631、CMRPG3E0632 和 CMRPG3E0633）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| GRIN1（GFP 标签）- 人类谷氨酸受体，离子型，N-甲基-D-天冬氨酸 1（GRIN1），转录变体 NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | 带有 C 末端 tGFP 序列标签的 NR1-cDNA 克隆 |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | 带有 C 末端 tGFP 标签的哺乳动物表达载体 |
| EndoFree 质粒大提试剂盒 | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Lipofectamine 2000 转染试剂 | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I 低血清培养基 | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM，高糖，含丙酮酸钠 | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| 经鉴定的胎牛血清，美国来源 | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| 山羊抗人 IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 594 标记 | Thermo Fisher | A-11014 | |
| 阳性对照：抗谷氨酸受体（NMDA 型） | Euroimmun AG, Lübeck, Germany | CA 112d-0101 | |
| Euroimmun 检测试剂盒 |
参考文献
- Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis. Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).
- Lancaster, E. The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis. J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).
- Pruss, H., ....
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重印与许可
