Hemos expresado ectopically subunidad NR1 del receptor NMDA etiquetada con proteína verde fluorescente en células embrionarias humanas (HEK293) como antígeno para detectar autoanticuerpos contra el receptor de NMDA en la sangre de pacientes con encefalitis autoinmune. Este sencillo método puede ser adecuado para la detección de propósitos en contextos clínicos.
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Artículo de método
Un análisis de la inmunofluorescencia celular Simple para detectar autoanticuerpos contra el Receptor N-metil-D-Aspartato (NMDA) en sangre
En este artículo
Resumen
Resumen
La presencia de anti-NMDA receptores autoanticuerpo puede causar diversos síntomas neuropsiquiátricos en los pacientes afectados, denominados encefalitis anti-NMDA autoinmune. Detección de los autoanticuerpos específicos contra el receptor NMDA en la sangre o líquido cefalorraquídeo (LCR) es esencial para la diagnosis exacta de esta condición. El receptor NMDA es un ion canal complejo de la proteína que contiene cuatro subunidades, incluyendo dos obligatorio NMDA receptor subunidad 1 (NR1) y uno o dos receptores NMDA 2A subunidad (NR2A), NMDA receptor la subunidad 2B (NR2B) subunidad del receptor NMDA 2C (NR2C), o del receptor NMDA subunidad 2D (NR2D). El epitopo del autoanticuerpo de anti-NMDA receptor se informó a estar presente en el dominio N-terminal extracelular de la subunidad NR1 del receptor NMDA. El objetivo de este estudio es desarrollar un análisis de la inmunofluorescencia celular simple que puede utilizarse como una prueba de cribado para detectar la presencia de autoanticuerpos contra la subunidad NR1 del receptor NMDA en la sangre para facilitar la investigación clínica y básica de encefalitis autoinmune anti-NMDA.
Introducción
Encefalitis anti-NMDA autoinmune es una entidad nuevamente reconocida de enfermedad que puede ocurrir en pacientes de todas las edades y afecta a pacientes predominantemente femenino1,2. Es una de la encefalitis más frecuentemente diagnosticada entre los pacientes con etiología desconocida inicial de encefalitis3. Los pacientes afectados con encefalitis anti-NMDA generalmente tienen síntomas prodrómicos de fiebre, seguida por el desarrollo rápido de cambio de nivel de conciencia y una variedad de síntomas neuropsiquiátricos agudos, como agitación, irritabilidad o dolor de cabeza , ataqu....
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Protocolo
El estudio fue aprobado por el institucional de Junta de Chang Gung Memorial Hospital en Linkuo, Taoyuan, Taiwán (102-2577A3).
1. preparación del plásmido de expresión de GFP NR1
- Mezcla 10 ng de plásmido NR1-GFP con 100 μl de cepa de células competentes de Escherichia coli DH5α de 1,5 mL estéril y centrifugar el tubo, pipetear la mezcla suavemente hasta 4 - 6 veces e incubar el tubo en hielo por 20 min.
- Incubar el tubo a 42 ° C por 1 min en un baño de agua, retire el tubo del baño María, añada 1 mL Lisogenia caldo (LB) medio en el tubo e incubar el tubo a 37 º C en una incubadora con agitación durante 1 hora.
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Resultados
En promedio, podríamos obtener 200-300 μg plásmido de expresión libre de endotoxina NR1-GFP y GFP de cultivo bacteriano 250 mL siguiendo los procedimientos descritos en la sección 1 del protocolo. Una cantidad de 100 ng/pozo del plásmido de expresión se utilizó para la transfección de las células HEK293, cultivado en la placa de 48 pozos, como se describe en la sección 2 del protocolo. 24-30 h después de la transfección, las células expresan el NR1-GFP y se pudieran detectar proteínas rec.......
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Discusión
Hay varios ensayos inmunológicos celulares para detectar la presencia de autoanticuerpos contra el receptor NMDA, divulgado en la literatura, incluyendo inmunofluorescencia celular vivo ensayo11, fijada de análisis de la inmunofluorescencia celular9 , y basados en la citometría de flujo ensayo14. El análisis de la inmunofluorescencia celular vivo debe realizarse poco después de la preparación de las células ectopically expresaban la proteína NR1, mie.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación médica de Chang Gung (número de licencia CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 y CMRPG3E0633).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| GRIN1 (marcado con GFP) - Receptor de glutamato humano, ionotrópico, N-metil D-aspartato 1 (GRIN1), variante de transcripción NR1-1 | Origene (Rockville, MD, EE. UU.) | RG219368 | clon de ADNc NR1 marcado con secuencias de tGFP C-terminal |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, EE. UU.) | vector | mamífero PS100010 con etiqueta tGFP C-terminal |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden, Alemania) | 12362 | |
| Lipofectamina 2000 Reactivo de transfección | Invitrogen (Carlsbad, CA, EE. UU. | )11668-019 | |
| Opti-MEM I Suero Reducido Medio | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, Alta Glucosa, Piruvato | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Suero Fetal Bovino Caracterizado, Origen en EE. UU. GE | Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Anticuerpo secundario anti-IgG (H+L) anti-humano de cabra, conjugado Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Control positivo: receptor anti-glutamato (tipo NMDA) | Euroimmun AG, Lü beck, Alemania | CA 112d-0101 | |
| ensayo Euroimmun |
Referencias
- Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis. Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).
- Lancaster, E. The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis. J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).
- Pruss, H., ....
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Reimpresiones y permisos
