Summary
NR1 alt birim NMDA reseptör karşı otoantikorlar ile otoimmün ensefalit şüphesi hastaların kan algılamak için antijen olarak insan embriyonik hücreleri (HEK293) yeşil flüoresan protein tagged NMDA reseptör ectopically dile getirdi. Bu basit yöntem klinik ayarları, amacıyla filtreleme için uygun olabilir.
Abstract
Anti-NMDA reseptör antikor varlığı çeşitli nöropsikiyatrik belirtiler etkilenen hastalarda anti-NMDA reseptör otoimmün ensefalit olarak adlandırdığı, neden olabilir. NMDA reseptör kan veya beyin-omurilik sıvısı (bos) karşı belirli antikor tespiti bu durumun doğru tanı için önemlidir. NMDA reseptör iki zorunlu NMDA reseptör alt birim 1 (NR1) ve bir ya da iki NMDA reseptör dahil olmak üzere dört alt birimleri içeren bir iyon kanal karmaşık proteindir alt birim 2A (NR2A), NMDA reseptör alt birim 2B (NR2B), NMDA reseptör alt birim 2C (NR2C), veya NMDA reseptör alt birim 2D (NR2D). Anti-NMDA reseptör antikor epitope bir NMDA reseptör NR1 alt birimi hücre dışı N-terminal etki mevcut olduğu bildirildi. Bu çalışmanın amacı bir tarama testi klinik ve temel araştırma kolaylaştırmak için kanda NR1 alt birim NMDA reseptör karşı otoantikorlar olup olmadığını belirlemek için kullanılan bir basit hücre tabanlı ayirt tahlil geliştirmektir Anti-NMDA reseptör otoimmün ensefalit.
Introduction
Anti-NMDA reseptör otoimmün ensefalit her yaştaki hastalarda gelişebilir ve ağırlıklı olarak kadın hasta1,2etkiler bir yeni tanınan hastalığı varlıktır. Ensefalit3ilk bilinmeyen etiyolojisi olan hastalarda en sık tanı konmuş ensefalit biridir. Hastalar genellikle Anti-NMDA reseptör ensefalit ile etkilenen bir baş ağrısı ya da ateş, bilinç düzeyini değiştirmek ve ajitasyon, sinirlilik gibi akut nöropsikiyatrik belirtiler çeşitli hızlı geliştirme tarafından takip prodromal belirtiler var , anksiyete, uykusuzluk, Varsanılar, sanrılar, saldırganlık, tuhaf davranışlar, hareketi anormallikleri, otonomik bozukluk ve nöbet saldırıları4,5. Bu koşul ve immünoterapi ile zamanında tedavi erken tanınması daha iyi sonuç ve etkilenen hastalar6bile tam kurtarma için önemlidir. Bu nedenle, bu anti-NMDA reseptör otoimmün beyin iltihabı akut veya yeni başlangıçlı psikotik özellikler7,8ile başvuran hastaların önemli bir ayırıcı tanı olarak düşünülmesi gereken önerilmektedir.
Klinik özelliklerin yanında hafiye-in kan veya CSF NMDA reseptör karşı antikor anti-NMDA reseptör otoimmün ensefalit9doğru tanı için önemlidir. Anti-NMDA reseptör antikor algılamaya immünolojik testler çoğu birkaç araştırma laboratuvarları10,11' kullanılabilir ve tek bir piyasada bulunan hücre tabanlı ayirt tahlil için tarama olduğunu Anti-NMDA reseptör otoantikorlar12. Bu çalışmanın amacı uygun laboratuvar olarak anti-NMDA reseptör klinik araştırma kolaylaştırmak için anti-NMDA reseptör otoantikorlar varlığı ekran için kullanılan basit içi hücre tabanlı ayirt tahlil geliştirmektir Otoimmün ensefalit. NMDA reseptör özellikle beyin ve ifade bir heterotetramer iyon kanal protein kompleksi var. Bu iki zorunlu NR1 alt birimleri ve NR2A, NR2B, NR2C veya NR2D13bir ya da iki alt birimleri ile birlikte yapılır. Bir önceki çalışma antikorlar tarafından hedef ana epitope NR1 alt birim5ekstraselüler N-terminal etki olduğunu bildirdi. Bu nedenle, bu iletişim kuralı, biz insan rekombinant NR1 alt birim proteini insan embriyonik böbrek epitel hücre satırı (HEK293) yeşil flüoresan protein (GFP) tagged NMDA reseptör hızlı ve algılamak için bir hücre tabanlı ayirt testi geliştirmek anti-NMDA reseptör otoantikorlar kan IgG sınıf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma kurumsal inceleme kurulu, Chang Gung Memorial hastanede Linkuo, Taoyuan, Tayvan (102-2577A3) tarafından kabul edildi.
1. NR1-GFP ifade plazmid hazırlanması
- NR1-GFP plazmid Mix 10 ng ile 100 µL Escherichia coli yetkili hücreleri zorlanma DH5α steril bir 1,5 ml tüp, damlalıklı karışımı yavaşça kadar santrifüj kapasitesi ve aşağı 4 - 6 kez ve buz için 20 dk metroyla kuluçkaya.
- Tüp bir su banyosunda 1 dk 42 ° C'de kuluçkaya, su banyosundan tüpü çıkarması, 1 mL lysogeny suyu (LB) orta tüpün içine ekleyin ve tüp 37 ° c için 1 h sallayarak ile bir kuluçka kuluçkaya.
- 50 µL Ampisilin (0.1 mg/mL) içeren bir LB agar plaka üzerine karışımı spread ve LB agar plaka bir kuluçka 37 ° C'de gecede kuluçkaya.
- Bir koloni steril ucu kullanarak gecede LB agar plaka almak ve belgili tanımlık uç girdap bir 5 mL LB orta ve Ampisilin (0.1 mg/mL) de içeren bir bakteri kültürü tüp. Gecede sallayarak ile bir kuluçka 37 ° C'de tüp kuluçkaya.
- Aliquot 3 mL 250 mL steril LB orta ve Ampisilin (0.1 mg/mL) içeren bir 500 mL şişe içine gecede bakteri kültürü. Şişeye 37 ° C'de sallayarak ile kuluçkaya. Dalga boyu 600 adlı bakteri kültürü optik yoğunluk (OD) düzenli olarak kontrol OD600 0,6-1.0 ulaşıncaya kadar bir Spektrometre kullanılarak nm.
Not: gece bakteriyel kültürünün de 800 µL gliserol hisse senedi hazırlamak ve gliserol hisse senedi altında-80 ° C ileride kullanmak üzere saklamak için 200 µL gliserol ile karıştırın. - Nr1-GFP ifade plazmid ile 250 mL bakteriyel kültür hazırlamak
- Santrifüjü 6.000 x g 4 ° C'de 15 dakika de tarafından hücreleri toplamak
- Bakteri Pelet RNase A içeren 10 mL resuspension arabellekte resuspend; hiçbir yığın iyice görmüş kadar girdap.
- 10 mL lizis arabellek bakteriyel süspansiyon eklemek, hafifçe karışım 4 - 6 kez ters ve lysate, oda sıcaklığında (RT) 5 min için kuluçkaya.
- 10 mL önceden soğutulmuş yağış arabellek için lysate ekleyin, 4 - 6 kez karışımı yavaşça tersine çevirin.
- Lysate kapaklı bir filtre kartuşu varil içine dökün; RT, 10 dk bekleyin
- Kartuş çıkış meme kapağını çıkarın, bir dalgıç kartuşu takın ve pistonu hafifçe bastırın. Filtre uygulanmış toplamak bir 50 mL tüp içine lysate.
- Tüpü yaklaşık 10 kat ters çevirme tarafından karışımı karıştırın ve karışımı 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya 2.5 mL özel arabelleğe üretici süzülmüş lysate ekleyin.
- Filtre uygulanmış lysate karışımı ile 10 mL denge tampon ön dengelenmiş bir filtre sütun uygulanır. Yerçekimi tarafından boşaltmak sütun izin.
- Sütun 30 mL yıkama arabellek ile iki kez yıkayın, sonra 15 mL elüsyon tampon kullanarak sütundan DNA elute.
- 10.5 mL (0.7 birimler) isopropanol eluted DNA arabelleğe ekleyin, karıştırın ve 20.000 x g 4 ° C'de 30 dk için karisimin santrifüj kapasitesi
- Süpernatant özenle dikkatle boşaltmak, DNA Pelet 5 mL endotoksin-Alerjik % 70 etanol ile bir kez yıkama ve 20.000 x g 10 dk de santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant dikkatle boşaltmak, 5-10 dk bir kimyasal başlıklı Pelet Makinası ve 300-500 µL endotoksin-Alerjik arabelleği Pelet geçiyoruz.
- Belgili tanımlık eriyik vasıl bir Spektrofotometre kullanarak UV 260/280 nm emilimini ölçerek plazmid konsantrasyonu belirlemek.
Not: ifade plazmid aynı iletişim kuralını kullanarak GFP hazırlık.
2. transfection HEK293 hücre NR1-GFP ifade plazmid ile
- Aliquot 200 µL % 2 jelatin çözüm her bir 48-şey kültür tabak iyi ve plaka için en az 30 dk. 37 ° C'de kuluçkaya.
- 200 µL % 10 fetal sığır serum (FBS) her iyi içeren hücre kültür ortamının iyi ve tohum 5 x 104 HEK293 hücrelerinde jelatin çözümden Aspire edin. Gecede %5 CO2 ile sağlanan bir oksijen kuluçka 37 ° C'de plaka kuluçkaya.
Not: Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayıldı. - Ertesi gün, taze kültür orta % 10 içeren 200 µL ile harcanan kültür orta yerine FBS iyi başına.
- Her, tek şey, hazırlamak çözüm A 100 karıştırılarak NR1-tGFP plazmid 20 µL kültür orta ve 0.8 µL transfection reaktif 20 µL kültür orta ile karıştırma tarafından çözüm B ng. Toplam hacim her deneme için hazırlamak için gerekli olan kuyu sayısını çarpın.
- Çözüm C çözüm A ve çözüm B karıştırarak hazırlayın ve RT karisimin 20-30 dk için kuluçkaya.
- Her şey HEK293 hücreleri içeren için çözüm C aliquot 40 µL plaka yavaşça girdap ve plaka gecede %5 CO2 ile sağlanan bir oksijen kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya.
- Ifade NR1-GFP rekombinant protein 40 X-200 X büyütme ile floresan mikroskop altında ana bilgisayar hücrelerdeki kontrol (uyarma/emisyon: 482/502 nm) ve hücre tabanlı ayirt tahlil için devam edin.
Not: aynı iletişim kuralını kullanarak HEK293 hücre içine ifade plazmid GFP Transfect.
3. hücre tabanlı ayirt tahlil
- Kuyulardan harcanan orta Aspire edin, sonra yıkama her şey ile fosfat 200 µL serum fizyolojik (PBS) üç kez arabelleğe alınmış.
- Her şey için 200 µL % 4 paraformaldehyde çözüm ekleyin; RT plaka 15dk için kuluçkaya.
- Paraformaldehyde çözüm kuyulardan Aspire edin ve her yıkama PBS 200 µL ile üç kez iyi.
- PBST içinde 200 µL % 10 yağsız süt ekleyin (% 0,1 ara-20 PBS) her şey ve RT plaka nazik sallayarak ile 1 h için kuluçkaya çözüm.
- % 10 yağsız süt kuyudan PBST çözümünde Aspire edin, sonra 200 µL PBST Wells'le bir kez yıkayın.
- Nazik RT için 1 h sallayarak ile birincil antikor olarak seyreltilmiş plazma (1: 100 PBST içinde) Wells'le kuluçkaya.
Not: Otoimmün beyin iltihabı için şüpheli hastaların kan plazma elde edilir. - Kuyulardan seyreltilmiş plazma Aspire edin ve her yıkama PBST 200 µL ile üç kez iyi.
- Keçi Anti-insan IgG Alexa Fluor 594 (1:1, 000 seyreltme PBST) ile her şey için Birleşik 200 µL ekleyin ve nazik için 1 h sallayarak ile kültür plaka RT, kuluçkaya.
- IgG Birleşik Alexa Fluor 594 Çözümle keçi Anti-insan Aspire edin ve her yıkama PBST 200 µL ile üç kez iyi.
- 100 µL gliserol çözüm (PBS ve 1:100,000, 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) % 50 gliserol) her şey için ekleyin.
- Gözlemlemek ve hücreleri kullanarak bir 10 X mercek ve 4 X, 10 X ve 20 X hedefleri floresan mikroskop altında görüntü.
Not: her boya için doğru filtre kullanın: NR1-GFP için (uyarma/emisyon 482/502 = nm), Alexa Fluor 594 için (uyarma/emisyon 561/594 = nm), DAPI için (uyarma/emisyon 358/461 = nm). GFP aynı şekilde ifade HEK hücreleri kullanarak negatif kontrol kuralları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ortalama olarak, biz 200-300 µg endotoksin ücretsiz ifade plazmid NR1-GFP ve GFP 250 mL bakteriyel kültüründen Protokolü'nün 1 bölümünde açıklanan yordamı edinebilir. Bir miktar 100 ng/iyi ifade plazmid 48-şey plaka protokol 2 bölümde açıklandığı gibi kültürlü HEK293 hücre transfection için kullanıldı. 24-30 h transfection sonra hücreleri NR1 GFP ifade ve GFP rekombinant proteinler floresan mikroskop altında tespit edilemedi. Şekil 1A şekil 1 d GFP ifade hücreleri gösterirken NR1-GFP, hızlı ana hücreleri görüntüsünü gösterir. Yeşil sinyal tahlil kalite denetleyicisi olarak kullanılabilir: hücreleri yaklaşık % 30 floresan mikroskop altında yeşil sinyalleri vardı. Şekil 1A ve 1B NR1 GFP hızlı konak hücreleri görüntüsünü göster. Yeşil sinyal tahlil kalite denetleyicisi olarak kullanılabilir: hücreleri yaklaşık % 30 floresan mikroskop altında yeşil sinyalleri vardı. Nr1-GFP ifade hücreleri anti-NMDA reseptör otoantikorlar insan plazma örnek varlığı için eleme.
İletişim kuralı 3 bölümde açıklandığı gibi hücre tabanlı ayirt assay olarak olumlu örnek kontrol (ticari bir kaynaktan elde edilen, Tablo malzemelerigörmek) için havuza alınan plazma 1:10 eklendi göre seyreltme prosedürü yerine getirin. Havuza alınan plazma 5 Yetişkin erkek ve 5 Yetişkin kadın hazırlanmıştır. 1e rakam olumlu denetimi örneğini Alexa Fluor-594 görüntü hücre ifade GFP ile kuluçka sonra iken şekil 1B Alexa Fluor-594 olumlu denetimi örneğini kuluçka hücreleri ifade NR1-GFP, ile sonra görüntüsüdür. Şekil 1 c bir birleştirilmiş görüntü şekil 1A ve şekil 1B: yeşil sinyalleri ve aynı hücrede kırmızı sinyalleri NR1-GFP co lokalizasyonu ve NMDA NR1 altbirim karşı antikor gösteren önemli programların çakışmasını vardır reseptör (oklar). 30 %'den büyük gösteren bir plazma örnek yeşil ile çakışıyor ve kırmızı sinyalleri olumlu olarak bu durumda yorumlanır. Şekil 1F şekil 1 d ve negatif kontrol şekil 1 ciçin hizmet verdiği rakam 1E birleştirilmiş görüntüdür. Zayıf kırmızı renk arka plan Floresans Alexa Fluor-594 resmin var. Anti-NMDA reseptör antikor rekombinant protein karşı hiçbir bağlama gösteren yeşil ve kırmızı sinyallerin küçük örtüşme vardır.
Plazma numuneleri test edildi zaman deneysel prosedürler kurulması sırasında biz bir düşük sinyal-gürültü oranı Alexa Fluor-594 gözlenen. Plazma formu 1:10, 1:50, 1: 100, seri bir seyreltme yaparak sinyal-gürültü oranı en iyi duruma getirmek için çalıştı ve 1: 200 ve Alex Fluor-594 farklı konsantrasyonlarda test ikincil 1:500 1:2, 000 antikor etiketli. O 1: 100 seyreltme Alexa Fluor-594 plazma ve 1:1,000 veya 1:2,000 seyreltme, verilerin yorumlanması için uygun koşulları bulunmuştur.
Şekil 1: anti-NMDA reseptör antikor algılamak için hücre tabanlı ayirt testin temsilcisi görüntüler. (A)görüntü NR1-GFP hızlı HEK293 hücre. (B) olumlu denetim örneği ile kuluçka sonra a aynı alandan alınan Alexa Fluor-594 görüntü. Kırmızı sinyal anti-NMDA reseptör otoantikorlar HEK293 hücrelerde ifade NR1 için bağlama gösterir. (C) A ve Bbirleştirilen görüntü. Sarı renk NR1 co lokalizasyonu gösterir (yeşil sinyal) ve anti-NMDA reseptör otoantikorlar (kırmızı sinyal). Oklar co yerelleştirme NR1-GFP ve anti-NMDA reseptör otoantikorlar gösterilen bazı önemli hücre örnekleri gösterir. HEK293 (D) görüntü ifade NR1-GFP hücreleri. (E) olumlu denetim örneği ile kuluçka sonra D aynı alandan alınan Alexa Fluor-594 görüntü. Zayıf kırmızı sinyal Alexa Fluor-594 görüntünün arka plan gürültü gösterir. (F) D ve EBirleştirilen görüntüyü. Olarak küçük sarı sinyal gözlenen bu görüntü bir negatif kontrol hizmet vermektedir. Negatif kontrol görüntü anti-NMDA özel bağlayıcı reseptör antikorları NR1 GFP için tahlil gösterir. Tüm görüntüleri küçük 10 X gözü lens ve 20 X lens objektif alındı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Orada canlı hücre tabanlı ayirt tahlil11hücre tabanlı ayirt tahlil9 sabit, dahil olmak üzere literatürde bildirilen NMDA reseptör karşı otoantikorlar varlığı ekran için çeşitli hücre tabanlı immünolojik deneyleri , ve Akış Sitometresi tabanlı tahlil14. Canlı hücre tabanlı ayirt tahlil Akış Sitometresi tabanlı tahlil eğitimli personel ve özel ekipman gerekirken NR1 protein ectopically ifade hücreleri hazırlık kısa bir süre sonra yapılmalıdır. Bir sabit hücre tabanlı ayirt tahlil için klinik ayarları yapılabilir daha uygun bir tahlil olduğunu. Bu nedenle, birçok çalışma ticari dolaylı sabit hücre tabanlı ayirt tahlil ekran anti-NMDA reseptör antikor serum ve CSF numuneler12,15için kullanılır. Paketi kullanılan (bkz: malzemelerin tablo) rekombinant NR1 alt birim NMDA reseptör ectopically hızlı sabit HEK293 hücreler içeriyor. Tahlil içinde anti-NMDA reseptör IgG antikor serum ve CSF numuneler12hafiye mükemmel performansa sahip değerlendirilmiştir. NR1-GFP ifade plazmid kullandığımız dışında bizim iletişim kuralında, biz aynı yaklaşımı seti üreticisi tarafından önerilen olarak kullanılır. NR1-GFP protein transfection verimliliği ve dağıtım NR1 protein her denemede izlemek için kullanılabilir. Bu nedenle, tahlil kalite kullanılabilir.
NR1-GFP ifade plazmid transfection verimliliğini HEK293 hücre içine ayirt tahlil için yeterli burada anlatılan protokolündeki yaklaşık % 30 değil. Ancak, yeşil floresan yoğunluğuna eşit olarak transfected hücreler arasında dağıtılmış değil transfection veya ifade yeteneği bireysel hücrelerin verimliliğini farklılıkları düşündüren bulduk. Rekombinant NR1-GFP farklı hücrelerinde farklı ifade düzeyde hànzú yoğunluğu neden yeşil görüntü Alexa Fluor 594 kırmızı görüntü ile birleşti. IgG Alexa Fluor 594 ile Birleşik keçi Anti-insan ikincil antikor insan antikor IgG sınıfı olup olmadığını belirlemek için kullanıldı. Biz Alexa Fluor 594 parlaklığını yeşil flüoresan protein nispeten zayıf olduğunu fark ettik. Sinyal şiddeti IgG Alex Fluor 594 ile ancak, de arttı arka plan Birleşik Anti-insan konsantrasyonunu artırarak optimize etmek çalıştık. Bu nedenle, en iyi anti-IgG Alex Fluor 594 ile Birleşik insan için 1:1,000 bu laboratuvar bölgedir. Ayrıca, bazı plazma numuneleri önemli ölçüde yüksek bir arka plan vardı Alexa Fluor 594 resimdeki sinyal. Farklı dilutions plazma test edildi ve en az bir seyreltme 1: 100 örneklerin çoğu için temiz bir arka plan elde etmek gerekli bulundu. Bu nedenle, bu iletişim kuralı standart aşama olarak plazma 1: 100 seyreltme öneririz. Serum örneği kan örneği11,161:10 ve 1:20 seyreltme tespit edebilen diğer hücre tabanlı deneyleri ile karşılaştırıldığında, bu geçerli protokol düşük titresi anti-NMDA reseptör otoantikorlar algılamak için yeterli duyarlılığa sahip değil, Bu bir protokol kısıtlamasıdır.
Geçerli bir sabit hücre tabanlı ayirt tahlil protokolüdür. Kültür plaka fiksasyon ilâ 1 ay ile karşılaştırıldığında uzun süre saklanamaz canlı hücre tabanlı tahlil için daha sonra kullanmak sonra 4 ° C buzdolabında saklanabilir. Ancak, NR1 protein denatüre ve onun doğal uyum için anti-NMDA reseptör otoantikorlar bağlar epitope biçimi etkileyebilir fiksasyon işlemi sırasında kaybetmek. Bu nedenle, bazı çalışmalarda canlı hücre tabanlı immunofluorescene11,17kabul etmiştir. Bizim iletişim kuralı, eğer biz ilk canlı hücreler plazma örnekle kuluçkaya ve sonra hücreleri tamir NR1 proteinin doğal uyum korumak için canlı hücre tabanlı ayirt tahlil olmak için alternatif olarak değiştirilebilir. Böylece, deneme ihtiyacı karşılamak için iletişim kuralında esneklik vardır.
NMDA reseptör NR1, NR2A, NR2B, NR2C ve NR2D oluşan heterotetramer karmaşık bir proteindir. Geçerli protokol NR1 alt birim NMDA reseptör karşı antikor IgG sınıfının algılamak için tasarlanmıştır. Anti-insan IgG ikincil antikorlar ikincil antikorlar belirli diğer sınıfı tarafından değiştirilir sürece protokolü de otoantikorlar, farklı isotypes algılamak için değiştirilebilir. Ayrıca, geçerli protokol NR1-GFP ifade plazmid ile ilgili ifade plazmid, sırasıyla yerine NR2A, NR2B, NR2C ve NR2D, karşı otoantikorlar olup olmadığını belirlemek için değiştirilebilir.
Bu protokol için bir plazma örnek serum yerine, çünkü biz düzenli olarak çeşitli eğitim amaçlar için kan örneği ile Anti-koagulant toplamak, ancak protokol serum veya CSF numuneler için uygulayabilirsiniz kullandık. Plazma otoantikorlar titresi örnek seri seyreltme tarafından sayısal. Laboratuvarda da aynı iletişim kuralını kullanarak konak hücreleri Afrika yeşil maymun böbrek fibroblast benzeri hücre kültürünü (COS1) sınav. COS1 hücreleri HEK293 hücreleri daha biraz daha düşük bir transfection verimliliği sahip dışında aynı olan HEK293 hücreleri kullanarak sonuçlarıdır.
Anti-NMDA reseptör otoantikorlar varlığı tespit için bu kemirgen beyin dokuları kullanarak immünhistokimya gibi ek deneyler tahlil ve5 immunocytochemistry nöronlar olmak birincil kültürlü kemirgen kullanarak gerçekleştirilen önerilmektedir ,9. Bu nedenle, geçerli protokol yalnızca bir tarama yöntemi kabul edilebilir. Her ne kadar deneysel geçerliliğini olumlu denetimi örneğini kullanarak bu çalışmada, duyarlılık doğrulandı ve klinik ayarları bu testin özgüllüğü gerekir gelecekte kurulacak eğitim.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Chang Gung tıbbi Vakfı (grant numarası CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 ve CMRPG3E0633) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GRIN1 (GFP-tagged) - Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | mammalian vector with C-terminal tGFP tag |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) | Euroimmun AG, Lübeck, Germany | CA 112d-0101 | |
| Euroimmun Assay Kit |
References
- Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis. Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).
- Lancaster, E. The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis. J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).
- Pruss, H., et al. Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin. Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).
- Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. Autoimmune encephalopathies. Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).
- Chapman, M. R., Vause, H. E. Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment. Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).
- Gable, M., Glaser, C. Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project. Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).
- Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis. Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).
- Irani, S. R., et al. N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes. Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).
- Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay. Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).
- Mayer, M. L. Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes. Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).
- Ramberger, M., et al. Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay. PLoS One. 10 (3), e0122037 (2015).
- Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis. J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).
- Dahm, L., et al. Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease. Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).
- Jézéquel, J., et al. Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project. Biol Psychiatry. , (2017).
