Summary
ويصف هذا البروتوكول نظام تعبير بروتين الصدمة الناجمة عن حرارة (بدهسب/V5-صاحب/sf9 خلية النظام)، التي يمكن استخدامها للتعبير عن البروتينات الخارجية أو تقييم apoptotic مكافحة نشاط البروتينات الخارجية المحتملة وما مبتوراً الأمينية الأحماض في خلايا الحشرات.
Abstract
نظام التعبير الجيني عابر واحد من أهم التقنيات لإجراء تحليل وظيفي البروتين في منظومة الثقافة في المختبر باكولوفيروس الخلية. تم تطوير هذا النظام للجينات صريح الأجنبية الخاضعة لسيطرة المروج باكولوفيرال في التعبير عابر والبلازميدات. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذا النظام على مقايسة وظيفية للبروتينات الخارجية أو باكولوفيروس نفسها. تطوير نظام التعبير الجيني عابر المتاحة تجارياً وعلى نطاق واسع أكثر استناداً إلى مروج فوري مطلع الجينات (IE) بسيودوتسوجاتا أورجييا مولتيكابسيد نوكليوبوليهيدروفيروس (أوبمنبف). ومع ذلك، لوحظ وجود مستوى تعبير منخفضة من الجينات الأجنبية في خلايا الحشرات. ولذلك، شيد نظام تعبير الجيني عابرة لتحسين التعبير البروتين. في هذا النظام، وشيدت والبلازميدات المؤتلف تحتوي على تسلسل الهدف تحت مراقبة الحرارة المورفولوجية المروج (Dhsp70) صدمة 70. ويقدم هذا البروتوكول تطبيق هذه الحرارة المستندة إلى صدمة بدهسب/V5-صاحب (حانمه V5 مع الحامض الأميني 6)/فروجيبيردا سبودوبتيرا خلية النظام (الخلايا sf9)؛ يتوفر هذا النظام ليس فقط للتعبير الجيني ولكن أيضا لتقييم نشاط مكافحة apoptotic مرشح البروتينات في خلايا الحشرات. وعلاوة على ذلك، هذا النظام يمكن أن يكون أما transfected مع بلازميد المؤتلف واحد أو شارك transfected اثنين والبلازميدات المؤتلف معادية محتملة وظيفيا في خلايا الحشرات. البروتوكول يوضح كفاءة هذا النظام ويوفر حالة عملية لهذا الأسلوب.
Introduction
نظامان التعبير البروتين قد استخدمت عادة لإنتاج البروتينات: prokaryote البروتين التعبير (نظام التعبير الجينيالإشريكيّة القولونية ) والنظم eukaryote البروتين التعبير. نظام التعبير البروتين eukaryote شعبية واحد هو باكولوفيروس التعبير ناقل النظام (بيفس)1. واستخدمت باكولوفيروسيس أولاً كعوامل المكافحة البيولوجية في العالم الزراعية والغابات الآفات. في العقود القليلة الماضية، وضعت باكولوفيروسيس كأدوات التكنولوجيا الحيوية للبروتين، فضلا عن ناقلات التعبير. جينوم باكولوفيروسيس تتكون من DNA دائرية مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل والمغلفة نوكليوكابسيدس2. وحتى الآن، أكثر من ثمانية وسبعون باكولوفيروس قد يعزل التسلسل3. استناداً إلى تتالي الزمانية باكولوفيرال تعبيرات الجين في الخلايا المضيفة الحشرات، يمكن تصنيف النسخ الجيني في الشلالات الزمانية الأربعة، بمن فيهم فوري مطلع، الجينات تأخر-المبكر والمتأخر، ومتأخرة جداً4.
وتم تعيين بيفس حيث أن مروجي الجينات متأخرة جداً (أي، متعدد الوجوه أو p10 المروج) واستخدمت محرك الجينات المستهدفة، بينما باكولوفيروس المؤتلف تم إنشاؤها بواسطة جزئ مثلى. التعبير عن البروتينات الخارجية في خلايا الحشرات التي باكولوفيروس المؤتلف شبيه بالبروتينات الثدييات في التعديلات بوستترانسلاشونال (مناسبة لإنتاج بروتين سكري). وهكذا، تم باكولوفيروس تستخدم على نطاق واسع5،،من67. بيد أن القيد واحد هو وجود مسارات glycosylation ن مختلفة في خلايا الحشرات7.
ولذلك، تم وضع نظام جديد لتعبير باكولوفيروس، النظام الجينات عابرة، والتعبير. هذا النظام وتعرب عن الجينات الأجنبية تحت محرك أقراص المروجين فوري مطلع باكولوفيرال (أي 1 المروج) في خلايا الحشرات. باستخدام هذا النظام، البروتين المستهدف يمكن مباشرة التعبير عن تحت سيطرة المروج 1-أي أثناء تعديل مسار N-جليكوسيلاتيون في خلايا الحشرات، أسفر عن أفضل oligosaccharides ن مرتبط7. علاوة على ذلك، يتم نسخها من قبل الخلية المضيفة الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني الجينات فوري مطلع باكولوفيرال ولا تتطلب أي عامل فيروسي لتفعيل4. ولذلك، يمكن التعبير عن البروتينات الخارجية في خلايا الحشرات في فترة زمنية قصيرة. حتى الآن، عابرة نظام التعبير الجيني واحدة من أهم التقنيات لإجراء فحوصات البروتين الوظيفية في نظام الثقافة في المختبر باكولوفيروس الخلية. يمكن تطبيق هذا النظام لتحليل الدالة باكولوفيروس أو البروتينات الخارجية. أحد أنظمة تعبير الجينات عابرة المتاحة تجارياً يرتكز على مروجي الجينات فوري مطلع (IE) بسيودوتسوجاتا أورجييا مولتيكابسيد نوكليوبوليهيدروفيروس (أوبمنبف) (المروجين OpIE2 و OpIE1).
ومع ذلك، انخفاض مستوى تعبير الجينات الأجنبية في خلايا الحشرات لا تزال تمثل مشكلة عندما كان النظام تعبير الجينات عابرة المستندة إلى مروج OpIE تستخدم8،،من910. وهكذا، شيد نظام التعبير الجيني عابر آخر استناداً إلى مروج المورفولوجية الحرارة صدمة بروتين 70 (hsp70) الجينات8،9. مروج hsp70 يعمل أكثر كفاءة من مروج باكولوفيرال IE عند الناجمة عن صدمة الحرارة في خلايا الحشرات10. وأعرب عن الجينات المستهدفة في هذا النظام، تحت محرك الأقراص من المورفولوجية الحرارة صدمة 70 المروج (Dhsp70). يمكن بسهولة استنساخ جينات أجنبية إلى بلازميد التعبير الجيني عابر بأساليب الاستنساخ القائم على بكر. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يؤديها التحكم في توقيت للتعبير الجيني بالاستقراء صدمة الحرارة.
في هذا التقرير، اتبع النهج ونعرب عن ثلاثة ترونكيشنز مختلفة من الجينات باكولوفيرال (مثبط للمبرمج 3، iap3 من إكسيلينا ليمانتريا منبف) باستخدام نظام التعبير المستندة إلى صدمة بروتين عابر الحرارة و كذلك تنطبق هذه البروتينات أعرب في تحليل نشاط مكافحة--أبوبتوتيك. أما التعبير عن البروتينات الخارجية بسرعة هذا النظام أو تطبق كذلك على تقييم نشاط مكافحة أبوبتوتيك البروتين في الخلايا sf9، بينما أيضا وجود إمكانات ليتم تطبيقها على فحوصات نشاط البروتين الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الأعمال التحضيرية
- ثقافة الخلية الحشرات
- إعداد 50 مل من خلية الثقافة المتوسطة. للقيام بذلك، قم بإضافة 500 ميليلتر من المضادات الحيوية (الامفوتريسين B = 0.25 ميكروغرام/مل، البنسلين = 100 وحدة/مل، ستربتوميسين = 100 ميكروغرام/مل) و 5 مل مصل البقري الجنين إبطال الحرارة في الخلية خالية من المصل الثقافة المتوسطة (دون FBS أو المضادات الحيوية).
ملاحظة: الحرارة المصل البقري الجنين عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حمام مائي قبل الاستخدام. - الحفاظ على فروجيبيردا سبودوبتيرا (قشريات الجناح: Noctuidae)، خلايا الحشرات sf9. فصل ca. 80% الخلايا من 25 سم2 خلية ثقافة قارورة التي تهز قارورة والاختيار تحت المجهر الخفيفة. بعد ذلك، نقل 50% تعليق خلية جديدة 25 سم2 خلية ثقافة قارورة وتسمح الخلايا تعلق لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يستعاض عن المتوسط بالمتوسطة ثقافة الخلية الطازجة 5 مل وتنمو في حاضنة في 28 درجة مئوية. مرور خلايا كل 2 إلى 3 أيام تبعاً لنمو الخلايا.
- إعداد 50 مل من خلية الثقافة المتوسطة. للقيام بذلك، قم بإضافة 500 ميليلتر من المضادات الحيوية (الامفوتريسين B = 0.25 ميكروغرام/مل، البنسلين = 100 وحدة/مل، ستربتوميسين = 100 ميكروغرام/مل) و 5 مل مصل البقري الجنين إبطال الحرارة في الخلية خالية من المصل الثقافة المتوسطة (دون FBS أو المضادات الحيوية).
- إعداد والبلازميدات تعداء الخلايا
- إدراج أجزاء الحمض النووي المستهدف (مثلاً، ليمانتريا إكسيلينا منبف (ليكسيمنبف) iap3 الجينات وفي بنيات الحذف) في بدهسب/V5-صاحب ب أسلوب الاستنساخ المستندة إلى بكر11. تحقق نمو المستعمرات محولة من مستعمرة PCR باستخدام مزيج PCR ماجستير (2 X) والتمهيدي بدهسب-F2/Op--IE2R مجموعة. تأكيد تسلسل بلازميد بخدمة التسلسل التجاري.
ملاحظة: يسرد الجدول 1 الإشعال المستخدمة لبكر و بنيات المقابلة. - تحديد ثقافة واحدة متسلسلة البكتيرية المستعمرات، التي تتضمن الإنشاءات بلازميد الآنفة الذكر (الخطوة 1، 2) في 200 مل رطل المتوسطة التي تحتوي على المضادات الحيوية (50 ميكروغرام/مل)، على التوالي.
- استخراج البلازميدات من مثقف كولاي استخدام "طقم بلازميد ميدي" وفقا لإرشادات الشركة المصنعة12.
- إدراج أجزاء الحمض النووي المستهدف (مثلاً، ليمانتريا إكسيلينا منبف (ليكسيمنبف) iap3 الجينات وفي بنيات الحذف) في بدهسب/V5-صاحب ب أسلوب الاستنساخ المستندة إلى بكر11. تحقق نمو المستعمرات محولة من مستعمرة PCR باستخدام مزيج PCR ماجستير (2 X) والتمهيدي بدهسب-F2/Op--IE2R مجموعة. تأكيد تسلسل بلازميد بخدمة التسلسل التجاري.
- إعداد متوسطة الطلاء بخلط 1.5 مل من خلية الثقافة المتوسطة و 8.5 مل من مستنبت الخلية خالية من المصل.
- إعداد والاكيتنوميسين د (ActD) خلية الثقافة المتوسطة بإضافة 1.5 ميليلتر ActD المخزون (1 ملغ/مل) في 10 مل من خلية الثقافة المتوسطة (التركيز النهائي = 150 نانوغرام/مليلتر). مخزن في 4 درجات مئوية.
2-بروتين تعبير عابر
- خلية البذر
- حصاد الخلايا sf9 اهتزاز قارورة الثقافة والإطاحة وتقع تعليق خلية في أنبوب 50 مل ونقل 10 ميليلتر إلى هيموسيتوميتير بواسطة ماصة P10. حساب عدد الخلايا تحت مجهر خفيفة.
- لوحة 3 × 105 الخلايا sf9 في كل بئر في صفيحة 24-جيدا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يستعاض في المتوسط 0.5 مل من تصفيح المتوسطة...
- تعداء البلازميدات
- كاشف تعداء خلية مخفف: 8 إضعاف ميليلتر من كاشف تعداء الخلية في 100 ميليلتر الخلية خالية من المصل الثقافة المتوسطة ومزيج من قبل فورتيكسينج ل 1 s.
- إضافة 2 ميكروغرام من بلازميد الحمض النووي (pDHsp70-ميلان-P35/V5-صاحب أو pDHsp70-لي-IAP3/V5-صاحب أو pDHsp70-لي-IAP3-بير/V5-صاحب أو pDHsp70-لي-IAP3-خاتم/V5-صاحب) إلى 100 ميليلتر من مستنبت الخلية خالية من المصل ومزيج من فورتيكسينج ل 1 ثانية (الشكل 2).
- الجمع بين الحمض النووي بلازميد المخفف وكاشف تعداء الخلايا المخفف (210 ميليلتر)، ومزيج من فورتيكسينج إينكوباتي س. 1 لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 210 ميليلتر من خليط كاشف تعداء الحمض النووي دروبويسي على الخلايا بواسطة ماصة P1000. تبني في 28 درجة مئوية ح 5.
- استبدال المتوسطة الطلاء مع 0.5 مل مستنبت الخلية استخدام ماصة P1000. إغلاق لوحة 24-جيدا مع الشريط واحتضان الخلايا عند 28 درجة مئوية ح 16.
- صدمة الحرارة transfected الخلايا: وضع اللوحة في حمام مائي 42 درجة مئوية (تطفو على سطح الماء). الحرارة لمدة 30 دقيقة والعودة لوحة 24-جيدا للحاضنة 28 درجة مئوية.
- الكشف عن البروتين التعبير
- بعد ح 1 أو صدمة الحرارة ح 5، غسل الخلايا مع 0.5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت بإيجاز ثلاث مرات.
ملاحظة: تمييع 10 × برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت إلى 1 × المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني عن طريق إضافة 1 مل من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني 10 x إلى 9 مل تعقيم ddH2س - الخلايا مع 40 ميكروليتر 1 × صبغ تحميل الحزب الديمقراطي الصربي من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
ملاحظة: تمييع 4 × صبغ تحميل الحزب الديمقراطي الصربي بخلط 30 ميليلتر من 1 × المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني و 10 ميليلتر من 4 × المخزن المؤقت لنموذج صحيفة بيانات السلامة. - الحرارة عينات البروتين عند 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في كتلة حرارة وتدور إلى أسفل لمدة 1 دقيقة ووضعت على الجليد لتحليل لطخة غربية.
- الغربية لطخة الإنزيم
اتبع الإجراء لتحليل لطخة غربية من إسلامي ولوجان13. تشغيل الهلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة14: جل واحد تعرض لأخذ الأزرق تلطيخ (تحميل عنصر التحكم للتحقق من أن كمية البروتين عينات تم تحميلها في كل جيدا المساواة في مقدار) وأخرى تعرض للغربية لطخة المقايسة، وفقا لاسلامي ولوجان13 . - الكشف عن البروتينات الانصهار معلم V5 مع الأضداد المضادة-V5 أرنب (5 ملغ/مل) (تمييع بينها في المخزن المؤقت تبسة إلى العمل بتركيز 1 ميكروغرام/مل) والماعز الأرنب المضادة IgG-الفجل البيروكسيديز (HRP) المتقارن (0.8 mg/mL) (تمييع 1:10000 في المخزن المؤقت تبسة للعمل تركيز 0.08 ميكروغرام/مل).
ملاحظة: ضبط النسبة المئوية ل polyacrylamide إلى 17.5 في المائة عند الوزن الجزيئي البروتين يكون < كاتشين 17.
- بعد ح 1 أو صدمة الحرارة ح 5، غسل الخلايا مع 0.5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت بإيجاز ثلاث مرات.
3-مكافحة-apoptotic نشاط الإنزيم
- استموات الخلايا المستحثة بالجينات: تكرار الإجراء المذكور أعلاه من 2.1 إلى 2.3. شارك ترانسفيكت 1 ميكروغرام من بدهسب/د-امتاز/العلم-صاحب بلازميد الحمض النووي (التي تحتوي على الجينات محفز المبرمج) مع 1 ميكروغرام من بلازميد الحمض النووي [pDHsp70/V5-صاحب المتجهات (المراقبة السلبية)، pDHsp70-ميلان-P35/V5-صاحب (مراقبة إيجابية)، pDHsp70-لي-IAP3/V5-صاحب، pDHsp70-لي-IAP3-بير/V5-صاحب أو pDHsp70-لي-IAP3-خاتم/V5-صاحب، على التوالي.]. في العلاج بالصدمة بعد الحرارة ح 5، إجراء فحص صلاحية الخلية (الشكل 2).
- استموات الخلايا الناجمة عن المواد الكيميائية: تكرار الإجراء المذكور أعلاه من 2.1 إلى 2.3. في خطوة 2.1.2، لوحة 1 × 106 الخلايا sf9 في كل بئر في لوحة 6-جيدا. ترانسفيكت 4 ميكروغرام من بلازميد الحمض النووي [pDHsp70/V5-صاحب المتجهات (المراقبة السلبية)، pDHsp70-ميلان-P35/V5-صاحب (مراقبة إيجابية)، pDHsp70-لي-IAP3/V5-صاحب أو pDHsp70-لي-IAP3-بير/V5-صاحب pDHsp70-لي-IAP3-خاتم/V5-صاحب، على التوالي.]. ح 5 الحرارة ما بعد الصدمة، يعامل الخلايا sf9 مع 2 مل من أكتد خلية الثقافة المتوسطة ح 16 وإجراء فحص صلاحية الخلية (الشكل 2).
ملاحظة: حجم الحد الأدنى لتغطية بئر واحدة للوحة 6-جيدا 1 مل. - القيام بتجارب المقايسة نشاط مكافحة apoptotic أعلاه، بما في ذلك 3.1 و 3.2 في تريبليكاتيس.
4-خلية جدوى الفحص
- تغسل الخلايا المعالجة بإضافة 1 مل من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني x 1 لمدة 1 دقيقة 3 مرات. ريسوسبيند الخلايا التي بيبيتينج 1 x 1 مل برنامج تلفزيوني مخزن يحتوي على 0.04% تريبان الأزرق ووصمة عار لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نقل تعليق خلية في microtube 1.5 مل.
ملاحظة: تمييع الحل تريبان الأزرق 0.4 في المائة بخلط مل 9 1 x برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت ومل 1 0.4% الحل تريبان الأزرق. - نقل 10 ميليلتر تريبان تعليق خلية ملطخة باللون الأزرق إلى هيموسيتوميتير مع ماصة P10 وعد الخلايا سليمة قابلة للاستمرار تحت مجهر خفيفة.
- التحليل الإحصائي
- حساب البيانات المسجلة وتقديمها كوسائل ± التنمية المستدامة لجميع التهم الموجهة إليه.
- تحليل البيانات باستخدام الطالب ثنائي الطرف اختبار t قبل مع Microsoft Excel. تعريف البيانات إحصائيا فقيمه < 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
طول كامل وغيرها truncations اثنين (المجالات بير وخاتم) من IAP3 لي من ليكسيمنبف كانت أوفيريكسبريسيد في الخلايا sf9، استناداً إلى الحرارة المستندة إلى صدمة بدهسب/V5-صاحب/فروجيبيردا سبودوبتيرا خلية النظام (الخلايا sf9). الواردة بدهسب/V5-صاحب المورفولوجية حرارة صدمة بروتين مروج، الذي يدفع التعبير الجيني المصب عند درجة حرارة 42 درجة مئوية شرط باستخدام عوامل النسخي الخلوية و نظام (الشكل 1) ترجمة8 ،،من911. المخطط الانسيابي التكنولوجية كله يرد في الشكل 2. بعد ح 1 أو صدمة الحرارة ح 5، تفكيك مع المخزن المؤقت للعينة البروتين الخلايا وتعرض لتحليل لطخة غربية لتأكيد التعبير البروتين. وبينت النتائج أن البروتينات كاملة الطول، AC-P35 ولي-IAP3 ولي-IAP3-بير ولي-IAP3-خاتم، يمكن أن يتم الكشف في transfected الخلايا في صدمة الحرارة بعد 1 ح أو ح 5. وعلاوة على ذلك، تم العثور على تراكم البروتين في ح 5 الحرارة ما بعد الصدمة (الشكل 3). وهكذا، وفقا للبيانات، تم إجراء المقايسة الوظيفية البروتين عند نقطة وقت التعبير البروتين كحد أقصى (ح 5 الحرارة ما بعد الصدمة).
استموات الخلايا المستحثة بالجينات والمبرمج الخلية الناجمة عن المواد الكيميائية يمكن تكييفها وفقا لهذا النظام لتقييم نشاط مكافحة--أبوبتوتيك (الشكل 2). استموات الخلايا المستحثة بالجينات، ثوابت اثنين (المبرمج محفز والهدف ثوابت بلازميد الجينات) كانت transfected اشترك في الخلايا sf9 ثم الحرارة صدمة للتعبير الجيني النشاط. وعلاوة على ذلك، البروتين apoptotic مكافحة التيار المتردد-P35 (المراقبة الإيجابية) وبروتين محفز المبرمج (د-امتاز) أبديت أيضا استخدام هذا النظام تعبير عابر صدمة الحرارة.
بعد صدمة الحرارة، بدأ كلا الجينات يكون أعرب وترجمتها إلى بروتينات. بالمقارنة مع ناقل/د-امتاز، أظهرت مراقبة إيجابية (Ac-P35/د-امتاز) apoptotic مكافحة عالية النشاط، التي تم التوصل إليها تصل إلى 80 في المائة معدل البقاء. من نتائج بقاء الخلية بنيات أخرى، يمكن مقارنة الباحثون النشاط apoptotic المضادة لبعضهم البعض أو مراقبة إيجابية (الشكل 4 أ). للمبرمج الخلية الناجمة عن المواد الكيميائية، تم transfected بناء واحد فقط في الخلايا sf9. بعد صدمة الحرارة بعد ح 5، أضيفت المواد الكيميائية (أكتد)، وتم قياس جدوى الخلية بعد ح 16 (الشكل 2). مقارنة مع تلك السيطرة الإيجابية (AC-P35) أو مراقبة سلبية (ناقلات)، أظهرت كل بناء آثار مختلفة على نشاط مكافحة--أبوبتوتيك (الشكل 4 باء).
الشكل 1: رسم تخطيطي والنوكليوتيدات تسلسل ly-iap3 بنيات بلازميد النسبي استناداً إلى ناقل بدهسب/V5-صاحب. كودون ابدأ (ATG) يظهر بخط غامق. يشير التسطير إلى مواقع قطع إنزيم التقييد (هندالثالث باللون الأحمر؛ بامهي باللون الأزرق)؛ التسلسل في اللون الأخضر يشير إلى منطقة المروج Dhsp70. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الرسم البياني لصدمة الحرارة الناجمة عن نظام التعبير البروتين (بدهسب/V5-صاحب/sf9 خلية النظام)- استموات الخلايا المستحثة بالجينات وعلاج استموات الخلايا الناجمة عن المواد الكيميائية أشير إلى الخطوة الأولى (تعداء المشارك مع بلازميد الجينات محفز المبرمج) أو إلى خطوة لاحقة بعد صدمة الحرارة (المبرمج الناجمة عن المواد الكيميائية)، على التوالي، فحص مكافحة المبرمج. تعديل الشكل وأسطورة مستنسخة بإذن من سبرينغر11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: Overexpression من التيار المتردد-P35، IAP3 لي، ولي-IAP3-بير و Ly-IAP3-خاتم استخدام الحرارة الصدمة الناجمة عن نظام التعبير البروتين (بدهسب/V5-صاحب/sf9 خلية النظام)- في 1 ح أو ح 5 وظيفة صدمة الحرارة، تحصد ليساتيس الخلية وتعرض لتحليل لطخة غربية، والحزب الديمقراطي الصربي/صفحة. (أ) الفحص لطخة غربية مع جسم α-V5، والحزب الديمقراطي الصربي (ب)/صفحة ملطخة باللون الأزرق أخذ كعنصر تحكم تحميل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: فحوصات السلامة د-امتاز أو المبرمج التي يسببها والاكيتنوميسين د. الخلايا sf9 (A) تم transfected مع ناقل pDHsp70/V5-صاحب (ناقل فقط) وشارك ترانسفيكتيد pDHsp70/دربر/العلم-صاحب مع ناقل pDHsp70/V5-صاحب pDHsp70/Ac-P35/V5-صاحب pDHsp70/لي-IAP3/V5-صاحب، pDHsp70/لي-IAP3-بير/V5-صاحب،، pDHsp70/ Ly-IAP3-خاتم/V5-صاحب، على التوالي. الاختلافات بين P35 والمتجهة والمتجهات ولي-IAP3 معتدا به إحصائيا (t-اختبار؛ ف < 0.05). (ب) sf9 تم transfected الخلايا مع أما ناقل pDHsp70/V5-صاحب أو pDHsp70/Ac-P35/V5-صاحب pDHsp70/لي-IAP3/V5-صاحب، pDHsp70/لي-IAP3-بير/V5-صاحب، pDHsp70/لي-IAP3-خاتم/V5-صاحب، على التوالي، في ح 5 بعد صدمة الحرارة، أضيف ActD وح 16 في وقت لاحق، وتم قياس جدوى الخلية. الفرق بين ناقل و P35 يعتد به إحصائيا (t-اختبار؛ ف < 0.05). تعديل الشكل وأسطورة مستنسخة بإذن من سبرينغر11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الاسم | تسلسل |
| بدهسب-IAP3-هنديي-F | زز 5´آجكتتأككاتجاكجاكجاكجاكجكاج-3´ |
| بدهسب-IAP3-بامهي-R | 5´--GCجاتكككجاتجتاجاكاككتجا-3´ |
| iap3-بير-بامهي-r | 5´--CGجاتكككجكاجاتكجككجككجكجا-3´ |
| iap3-خاتم-هيندييي-F | زز 5´آجكتتأككجاجكتكاتااااجكككجت-3´ |
| pDhsp70-F2 | 5´-كتجكاكتاكتجااتكاككاج-3´ |
| البروتوكول الاختياري--IE2R | 5´-جاكاتاكااكتاجاتتاجتكاج-3´ |
الجدول 1: مجموعات التمهيدي المستخدمة لأسلوب الاستنساخ المستندة إلى PCR. * وأشارت إلى أزواج قاعدة الحمض النووي أكدت مواقع إنزيم التقييد. قائمة معدلة التمهيدي مستنسخة بإذن من سبرينغر11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ووصف مفهوم النظام القائم على صدمة خلية بدهسب/V5-صاحب/sf9 الحرارة أولاً كليم et al. في عام 19948. أظهرت مقارنة باكولوفيرال الجينات المروج (IE1) و المورفولوجية hsp70 أن hsp70 كان مستوى أعلى من كفاءة في البعوض خلايا10. وعلاوة على ذلك، بسبب تحريض صدمة الحرارة، يمكن التحكم توقيت التعبير البروتين تحديداً بعد العلاج بالصدمة الحرارة. ثم طبق هذا النظام لفحوصات البروتين وظيفية من الجمبري ونوكليوبوليهيدروفيروس (NPV) الأكاديميات البروتينات9،11. واستخدمت في هذا البروتوكول، ما مجموعة 6 بلازميد الإنشاءات: ثلاثة (بدهسب/V5-صاحب، بدهسب/Ac-p35/V5-صاحب وبدهسب/د-امتاز/العلم-صاحب) قدمت "ليو" جيان-Horng9، والإنشاءات الثلاثة الأخرى (بدهسب-iap3/V5-صاحب، بدهسب-iap3-بير/V5-صاحب، وبدهسب-iap3-خاتم/V5-صاحب) شيدت بناي et al., 201611. ويبدو أن هذا المروج في الحشرات الخلايا يعمل أكثر كفاءة من مروجي الجينات باكولوفيرال. ومع ذلك، خلال التلاعب بهذا البروتوكول، هناك العديد من النقاط التي يتعين النظر فيها. قبل بلازميد تعداء، التحقق من إدراج تسلسل الحمض النووي مهم للتعبير الجيني؛ وهكذا، يجب أن تنصهر فيها مع حانمه V5 لتشكيل بروتين معلم V5 انصهار في نهاية تسلسل الهدف. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا تصميم العلامات الانصهار مختلفة (أي، حانمه العلم) في ناقلات القائم على بدهسب في المختبر بروتين ملزمة مقايسة. وسيساعد هذا الإجراء تمديد مواصلة التحقيق تفاعلات البروتين البروتين9. ولذلك، يمكن استخدامها في الجسم [بولكلونل] V5 التجارية للكشف عن البروتينات. وينبغي اختبار نسبة تعداء في خلايا الحشرات مختلفة قبل التجربة. قد يؤدي انخفاض معدلات تعداء غير القابلة للاكتشاف من البروتين التعبير؛ وهكذا، ناقل بدهسب التي تحتوي على جين تقرير مناسب (أي، الأخضر فلوريسسي الجينات) يمكن أن ترانسفيكتيد في خلايا الحشرات لتقييم كفاءة تعداء.
وهو الحد الرئيسية من هذا المنبر التعبير صدمة الحرارة مستوى التعبير البروتين. وفي بعض الحالات، تم العثور على مستوى تعبير بروتين منخفضة. وفقا لدراسة تجريبية، كان هناك أي تأثير تعتمد على الجرعة الكبيرة التي حدثت عندما كان transfected أكثر بلازميد الدنا في الخلايا sf9 (البيانات لا تظهر). وهكذا، قد يكون سبب هذا التأثير في مسار بروتوزوم أوبيكويتين (UPP) أو آليات غير معروفة أخرى11. ينبغي دراسة الباحثين تعبير البروتين حضور المانع بروتوزوم (أي، مغ-132) لتوضيح وريكولفي هذه المسألة11. القيد الأخرى أنه لا يمكن تحقيق الإنتاج المستدام للبروتينات المرتبطة بالفيروسات المؤتلف. وبالتالي، تحقيق الاستقرار وكمية البروتين التعبير هي أيضا الشواغل المتعلقة بهذا النظام. ولذلك، ينبغي أيضا اختبار دورة وقت لإنتاج البروتين بتحليل لطخة غربية قبل التحليل الوظيفي. في هذا البروتوكول، مقارنة مع اثنين من النقاط الزمنية (1 و 5 ح بعد صدمة الحرارة)، ولاحظت تراكم إنتاج البروتين المستهدف من ح 1 إلى ح 5. ويقترح زيادة في النقاط الزمنية بغية تحديد توقيت أفضل الظروف للمقايسة الوظيفية البروتين.
للبروتين والمقايسة الوظيفية، البروتين apoptotic مكافحة التيار المتردد-P35 (المراقبة الإيجابية) وبروتين محفز المبرمج (د-امتاز) أبديت أيضا استخدام هذا النظام تعبير عابر صدمة الحرارة. توصف هذه البروتينات هما الخصوم الفنية9،،من1115. ولذلك، ناقلات/د-امتاز التيار المتردد-P35/د-امتاز يمكن أن يفيد كعنصر تحكم السلبية ومراقبة إيجابية، على التوالي. باستخدام هذه المقارنة، يمكن تحديد النشاط apoptotic المضادة للبروتينات المستهدفة.
قدم البروتوكول يمكن أن توفر منبرا للتعبير عن البروتينات الخارجية بسرعة أكبر أو يمكن أن تطبق كذلك على تقييم نشاط مكافحة أبوبتوتيك البروتين في خلايا الحشرات. وبمجرد الباحثين الحصول على النتائج الأولية لوظيفة البروتين، يمكن استخدام هذا النظام لإجراء المزيد من الدراسات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
ونحن نشكر الدكتور جيان-Horng لوي من المعهد "علم الأحياء البحرية"، جامعة المحيط تايوان الوطنية لتوفير 3 بلازميد الإنشاءات. وأيد هذا البحث بمنحه 106-2311-ب-197-001-من وزارة العلوم والتكنولوجيا (معظم).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
References
- Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
- Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).
- Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).
- Friesen, P. D. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. Miller, L. K. , Plenum Press. New York. 141-170 (1997).
- Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
- Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
- Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
- Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
- Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
- Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
- Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
- Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from: http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf (2017).
- Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017).
- Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).
