Summary
Ovogénesis en mamíferos es conocido por ser errores, particularmente debido a protooncogenes del cromosoma. Este manuscrito describe métodos de preparación de cromatina extensión de profase de ratón, metafase I y II etapas ovocitos. Estas técnicas fundamentales permiten el estudio de las proteínas de la cromatina-limite y morfología cromosómicas en mamíferos Oogénesis.
Abstract
Técnicas de propagación de cromatina se han utilizado ampliamente para evaluar la localización dinámica de proteínas diferentes durante la gametogénesis, particularmente para la espermatogénesis. Estas técnicas permiten para la visualización de patrones de localización de ADN y proteína durante eventos meióticas como cromosoma homólogo emparejamiento, synapsis y ADN reparación. Mientras que en la literatura se han descrito algunos protocolos, cromatina general técnicas de propagación utilizando ovocitos de mamífero profase son limitados y difíciles debido a la sincronización de la iniciación de la meiosis en los ovarios fetales. En comparación, espermatocitos de profase se pueden recoger en ratones machos menores con rendimientos más altos sin necesidad de microdissection. Sin embargo, es difícil obtener una población sincronizada pura de células en fases específicas debido a la heterogeneidad de las poblaciones de meiótica y posterior meiosis células germinales en el testículo adulto y juvenil. Para etapas posteriores de la meiosis, es ventajoso para evaluar oocitos en meiosis I (MI) o meiosis II (MII), porque grupos de ovocitos maduros pueden ser obtenidos de ratones hembra adultas y estimulados para reanudar la meiosis en la cultura. Aquí, métodos para preparaciones de meiosis cromatina extendida utilizando ovocitos disecaron de fetal, neonatal y adulto ovarios se describen con el acompañamiento de demostraciones en video. Eventos de protooncogenes cromosoma en ovocitos mamíferos son frecuentes, especialmente en MI. Estas técnicas pueden utilizarse para evaluar y caracterizar los efectos de diversas mutaciones o exposiciones ambientales en distintas etapas de la Oogénesis. Como hay diferencias distintas entre ovogénesis y espermatogénesis, las técnicas descritas son invaluables para aumentar nuestra comprensión de la Oogénesis mamíferos y las características de dimorfa sexual de cromosoma y proteína dinámica durante la meiosis .
Introduction
Durante la espermatogénesis, grandes olas semisincrónico de meiótica de las células germinales se rápidamente y continuamente reponen en el testículo en el inicio de la pubertad y a lo largo de la edad adulta1. En contraste con los varones, la meiosis de las hembras se inicia únicamente durante el desarrollo fetal. Después de nacimiento, ovocitos permanecen detenidos en una etapa prolongada dictyate de profase I con una vesícula germinal intacta (GV; envoltura nuclear) hasta la pubertad. En el inicio de la pubertad, un subconjunto de los ovocitos se seleccionan cíclicamente a experimentar crecimiento y maduración, marcando el inicio de la reanudación meiótica. Reanudación meiótica de ovocitos adulto se manifiesta por la desaparición de la GV en un proceso conocido como ruptura de vesícula germinal (GVBD). Entonces, el ovocito sufre cromosoma condensación y segregación, seguido por la protuberancia del cuerpo polar. Ovocitos pasan arrestados tras progresión a MII y son estimulados para completar la segunda y última división meiótica sólo después de la fertilización.
Fertilidad de la mujer depende el éxito de la profase meiótica I progresión. Clave para esto es la formación de un vínculo físico entre los cromosomas homólogos denominados quiasmas, que está mediada por la reparación de roturas de doble cadena inducida por ADN (distritales) via crossover recombinación2. Este proceso ocurre dentro del contexto de un andamio proteínico dinámico conocido como el Complejo Sinaptonémico (SC) que se forma entre los cromosomas homólogos para facilitar sus sinapsis3. El SC es una cremallera-como estructura tripartita que consta de dos elementos laterales paralelos conectados por las proteínas de la región central que posee homólogos juntos a lo largo de curso reparación del ADN. Antes de la sinapsis, precursores de los elementos laterales, llamados elementos axiales, forman entre cromátides hermanas. Las proteínas del Complejo Sinaptonémico como SYCP2 y SYCP3 forman elementos axiales que colocalize a los ejes de la hermana chromatid cohesión durante la profase temprana. Estos más adelante servir como sitios para la proteína del filamento transversal, SYCP1, que facilita el montaje del elemento central y sinapsis entre homólogos alineados4de Unión. En ovocitos de ratón, sinapsis completa se indican por la presencia de 20 completamente superposición de extensiones SYCP3 y SYCP1, que pueden visualizarse mediante el uso de cromatina difundir preparativos. Synapsis se ha completado al entrar en el subestadio de paquiteno, por el crossover maduro que está destinado a quiasmas forma entre homólogos está decorada con dímeros de mutL homólogo (MLH1/3) para promover su proceso exacto5,6 , 7. el mantenimiento estructural de complejos de cromosomas (SMC), incluyendo la cohesina, condensin y el SMC5/6 complejos, son importantes para la regulación de la dinámica del cromosoma y estructura a lo largo de la meiosis8,9, 10,11,12. Colectivamente, estos eventos aseguran bi-orientación adecuada de los cromosomas homólogos a polos de huso después de desmontaje de la SC. de oposición
El ciclo celular meiótico es un poderoso modelo para examinar los papeles de varias proteínas en el mantenimiento del genoma debido a la inducción programada y posterior reparación del ADN distritales. Además, mamífera meiosis es también un modelo relevante para el estudio de las modificaciones epigenéticas e impresión13. Sin embargo, es técnicamente difícil de evaluar estos acontecimientos durante la meiosis femenina, que tiene lugar en los ovarios fetales y neonatales en los mamíferos (figura 1). Profase I puedo se divide en 5 subetapas: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema y dictyate. Adjunto, describimos cómo aislar y distinguir entre ovarios fetales y neonatales y los testículos (figura 2). Adaptado de los métodos anteriormente descritos, este manuscrito describe también un protocolo (paso 1) con video de demostración para la preparación de la profase meiótica femenina la cromatina separa14,15,16,17 . Cuando se combina con immunolabelling, tal como se describe en los pasos 6 y 7, este protocolo permite análisis microscópico detallado de profase I eventos en ovocitos.
Ovogénesis son propenso, y eventos de protooncogenes del cromosoma durante la primera división meiótica representan la fuente más común de enfermedades genéticas en la progenie de18,19. En este manuscrito (paso 2 del Protocolo), se describe un protocolo que ovocitos maduros organizado por el GV se extraen preparados ovarios de ratones hembra adultos. Condiciones de apoyo, ovocitos adulto pasan por independiente de la hormona luteinizante reanudación de la meiosis después de aislamiento y la cultura20. Tras la reanudación meiótica, ovocitos progresan a través de la meiosis I y luego arrestan en metafase II. Ovocitos siendo arrestados en metafase II, a menos que fertilizan. En los pasos 2 – 5, nos adaptamos a protocolos previamente divulgados con video de demostración para describir cómo recopilar, cultura y preparar MI y MII ovocitos cromatina difundir preparativos21. Esta cromatina separarse técnica permite immunolabelling claro de proteínas relacionadas con los cromosomas. Además, este protocolo también puede utilizarse para distinguir entre los cromosomas bivalentes y univalentes y además puede resolver sola hermana chromatids para facilitar la evaluación de la ploidía de ovocitos. Por lo tanto, además de revelar patrones de localización de proteínas meióticas, este protocolo también puede servir como una valiosa herramienta para dilucidar las causas potenciales de protooncogenes cromosoma durante MI y MII.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad Johns Hopkins. Los experimentos fueron realizados en ratones C57BL/6J de tipo salvaje.
1. recolección de ovarios fetales o neonatales y la preparación de la profase la cromatina se separa
- Para extraer embriones en 14.5 – 19,5 días post-coitum (dpc) sacrificar hembras preñadas mediante dislocación cervical o CO2 asfixia según las pautas IACUC.
Nota: para el día postnatal 1 – 5 ovarios vaya directamente al paso 1.3. Figura 1 resume las etapas de la profase meiótica enriquecidas a diferentes edades embrionarias y postnatales. - Abrir la cavidad de abdominopelvic con tijeras estériles, haciendo una abertura en forma de V. Diseccionar hacia fuera el cuerno uterino materno, separar la placenta de los embriones y transferir los embriones en platos de petri de 35 mm que contiene 3 mL de precalentado 1 x solución salina buffer fosfato (PBS) a 37 ° C.
Nota: Puede utilizarse una fliptop la incubadora a 37 ° C para mantener la temperatura. Además, también puede utilizarse una platina de vidrio de temperatura regulada para mantener la temperatura durante la manipulación del ovario. - Tijeras quirúrgicas de 3,5 pulgadas, sacrificar embriones o crías mediante decapitación según las pautas IACUC. Colocar embriones decapitados o cachorros en PBS precalentada antes de la disección posterior.
- Diseccionar un embrión o cachorro a la vez en una placa Petri separadas 35 mm que contiene 3 mL de PBS precalentada a 37 ° C. Proceder con el corte a lo largo de la línea media ventral de la mitad posterior del embrión, a lo largo de la mitad anterior por debajo de los miembros anteriores y directamente sobre las extremidades posteriores y la cola como se indica en la figura 2A–B.
- Abrir el abdomen con tijeras quirúrgicas de 3,5 pulgadas. Con unas pinzas de punta fina desplazar o eliminar el hígado y asas del intestino, exponiendo los ovarios en una nueva placa de petri de 35 mm que contiene 3 mL de PBS precalentada a 37 ° C (consulte la guía en la figura 2B). Los ovarios están situados inmediatamente debajo y detrás del riñón hacia la pared posterior de la cavidad peritoneal (figura 2B,C). Una guía para diferenciar las gónadas masculinas y femeninas se presenta en la Figura 2D.
Nota: Para condiciones óptimas, rápidamente disecar hacia fuera de los ovarios después de mujer embarazada se sacrifica. - Extirpar ambos ovarios de cada feto femenino con un par de pinzas de punta fina en un ámbito de disección y en unas gafas de ver o pozos separados de un pozo varios con 0.5 a 1.0 mL de PBS con la placa y mantienen a 37 ° C.
- Colocar cada par de ovarios en 0,5 mL de tampón de extracción hypo (17 mM de citrato trisódico dihidrato, sacarosa de 50 mM, 5 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 30 mM Tris-HCl, inhibidor de la proteasa, pH 8.2) en un vidrio de reloj limpio o en un pequeño pozo de una placa de 9 pozos, asegurándose de que sumerja la comp ovarios letely. Incubar durante al menos 15 minutos, pero no más de 30 minutos.
Nota: Hacer tampón de hypo-extracción fresca y usar dentro de 2 h de además de TDT. - Durante la incubación, usando una barrera hidrofóbica PAP pluma, dibujar dos cuadrados de 22 x 22 mm2 en un limpia vidrio 25 x 75 mm2, portaobjetos grueso 1 mm como se muestra en la Figura 3A.
Nota: Diapositivas se pueden preparar antes de tiempo. - Pipeta de 45 – 50 μl de sacarosa 100 mM sobre un portaobjetos limpio y transferir un par de ovarios a la gota.
- Con los extremos afilados de dos agujas de 27 G, embromar aparte los ovarios para liberar las células en la solución de sacarosa. Con pinzas, quite los pedazos grandes de ovario y Pipetear cuidadosamente la solución de sacarosa para dispersar las células.
- Lugar 40 μl de solución de fijación (1% paraformaldehido (PFA), detergente de 0.2% (véase Tabla de materiales), pH 9.2) en cada plaza de la corredera preparada. Con una punta de pipeta de 200 μL, distribuir uniformemente la solución fijador sobre la superficie del portaobjetos.
- Pipetear 20 μl de la mezcla de sacarosa en cada cuadrado de la diapositiva que contiene el fijador.
Nota: Esto equivale a usar un par de ovarios por diapositiva. - Incubar los portaobjetos en cámara húmeda cerrada durante la noche a temperatura ambiente.
Nota: La incubación durante la noche puede variar alrededor de (12-15 horas) a temperatura ambiente. - Abra la tapa de la cámara y deje que el portaobjetos se seque al aire completamente.
- Lavar los portaobjetos en una jarra de Coplin conteniendo 50 mL de solución de agente humectante-PBS 0.4% (véase Tabla de materiales) por 2 min, secar al aire y proceder al Protocolo de immunolabelling (paso 6).
Nota: Es posible guardar las diapositivas a-80 ° C para su uso posterior, pero esto varía en función de la proteína de interés. Para obtener resultados óptimos proceder inmediatamente al protocolo immunolabelling (paso 6).
2. metafase I colección de ovocitos
- Para maximizar el número de folículos antrales aislada de cada ratón, inyectar intraperitonealmente ratones hembra Virgen sexualmente maduros con 5 UI de gonadotropina de suero de yegua preñada (PMSG gonadotropina coriónica también conocido como equina (eCG)).
Nota: Para el rendimiento óptimo de ovocitos, ratones deben ser 1 a 3 meses de edad, como el número de ovocitos cosechados disminuirá con la edad. Para preparar la PMSG, disolver botella de 5.000 UI en 100 mL de PBS estéril (5 mL de U/0.1) tienda alícuotas de un solo uso de 600 μL en-20 ° C. - Después de 44 a 48 h, preparar medio de colección, mínimo esencial medio alfa (MEMα) suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS) y 3 mg/mL albúmina sérica bovina (BSA; MEMΑ/BSA/FBS). Esterilizar los medios de comunicación a través de un filtro de poro de 0.2 μm. Decantar el 2,5 mL de MEMα/BSA/FBS medio en un recipiente de vidrio por ratón y caliente a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 .
Nota: Otra colección y medios de cultivo comercialmente disponibles (M2 y M16) son también de uso general.
Atención: Aconsejamos quitar platos de cultura de la incubadora 5% CO2 , uno en una hora de duración limitada minimizar la exposición al aire ambiente durante los pasos de manipulación. - Sacrificar a los ratones mediante dislocación cervical o CO2 asfixia según las pautas IACUC.
- Abrir la cavidad de abdominopelvic con tijeras estériles, haciendo una abertura en forma de V grande. Con unas pinzas, desplaza los intestinos hacia la cabeza del ratón. Localizar cada cuerno uterino; los ovarios son actual próximo a la caja torácica. Sostenga el oviducto con pinzas finas y cortar a la grasa superior al ovario con tijeras de disección (figura 4). Continúe oprimiendo el oviducto y con otro juego de Pinzas finas suelte el ovario de la bursa y el lugar en el recipiente de colección que contiene medio de MEMα/BSA/FBS.
Nota: Como en el paso 1, es imprescindible mantener los ovarios a 37 ° C y se mantiene a 5% CO2. Una incubadora de fliptop enganchada a la mezcla de 5% CO2 puede utilizarse para permitir el óptimo mantenimiento de la temperatura y niveles de CO2 . Además, una etapa de vidrio temperatura regulada puede usarse también para mantener la temperatura durante la manipulación de ovocitos. - Utilizando una jeringa de 1 mL con una aguja de calibre 27 o tamaño similar, liberar complejos de ovocito cumulus manualmente pinchando los grandes folículos antrales.
- Mientras observa a través de un microscopio de disección, recoger ovocitos organizado por el GV utiliza una pipeta de vidrio de boca operada o capilar o una manual micrómetro-jeringa (figura 5). Sólo recoger óvulos que se liberan de folículos antrales. GV ovocitos tienen un diámetro de aproximadamente 90 μm. GV ovocitos puede ser rodeados por 2-3 capas de células granulosas y tienen un diámetro total de alrededor de 200 μm.
- Ovocitos en un vidrio de reloj limpio o una placa de la pozo 9 que contiene medio de MEMα/BSA/FBS por 6 h para llegar a la metafase de la cultura que a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 .
- Proceda al paso 4.
3. colección de ovocitos metafase II (MII)
- Para maximizar ovocitos aislados de cada ratón, inyectar intraperitonealmente ratones hembra Virgen sexualmente maduros con 5 UI de PMSG. Después de 44 a 48 h, inyectar por vía intraperitoneal con 5 UI de gonadotropina coriónica humana (hCG).
Nota: Para el rendimiento óptimo de ovocitos, ratones deben ser 1 a 3 meses de edad, como el número de ovocitos cosechados disminuirá con la edad. Para preparar el hCG, disolver una botella de 10.000 U en 200 mL de PBS (5 mL de U/0.1). Almacenar en alícuotas de un solo uso de 600 μL en-20 ° C. - Después de 12-14 hrs, preparar medio de colección MEMα/BSA/FBS, como se describe en el paso 2.2, anteriormente.
- Sacrificar a los ratones mediante dislocación cervical o CO2 asfixia según las pautas IACUC.
- Abrir la cavidad de abdominopelvic con tijeras estériles, haciendo una abertura en forma de V grande. Con unas pinzas, desplaza los intestinos hacia la cabeza del ratón. Localizar cada cuerno uterino, los ovarios son actual próximo a la caja torácica. Sostenga el oviducto con pinzas finas y cortar a la grasa superior al ovario con tijeras de disección (figura 4). Luego quitar el ovario y oviducto y coloque un plato de colección que contiene medio de MEMα/BSA/FBS.
Nota: Como en los pasos 1 y 2, es imprescindible mantener los ovarios a 37 ° C y se mantiene a 5% CO2. Una incubadora de fliptop enganchada a la mezcla de 5% CO2 puede utilizarse para permitir el óptimo mantenimiento de la temperatura y niveles de CO2 . Además, una etapa de vidrio temperatura regulada puede usarse también para mantener la temperatura durante la manipulación de ovocitos. - Utilizando una jeringa de 1 mL con una 27 G (o tamaño similar) o afiladas pinzas, rasgar un agujero en la ampolla del oviducto a soltar de los ovocitos en MII.
Nota: Tenga cuidado de no dañar los ovocitos en la ampolla. La ampolla aparece hinchada y transparente que los ovocitos son visibles (figura 4). - Cosechar ovocitos MII de la ampolla del oviducto en una nueva placa con medio de colección, utilizando una pipeta de vidrio de boca operada o tubo capilar o una manual micrómetro-jeringa (figura 5).
- Proceda al paso 4.
4. ovocito desollamiento y el retiro de la Zona pelúcida
- Preparar 300 UI/mL de hialuronidasa en medio MEMα suplementado con 3 mg/mL de BSA para raspar ovocitos de rodear células del cúmulo (2.5 mL/ratón) en un vidrio de reloj y a 37 ° C, 5% CO2.
Nota: Eficacia de hialuronidasa disminuye agudamente después de 1 h de preparación. Para ovocitos MII, no se requiere tratamiento de hialuronidasa. - Exponen complejos ovocito-cumulus cell 300 UI/mL de hialuronidasa en MEMα/BSA durante 3 minutos para raspar ovocitos de rodear células del cúmulo.
PRECAUCIÓN: No exceda los 3 minutos de exposición a la hialuronidasa, dañará los ovocitos. - Lavar los ovocitos, transferencia de ovocitos a una fresca y caliente plato medio MEMα/BSA. Con una pipeta de vidrio boca operada o capilar (ligeramente más grande que el diámetro del ovocito, que es aproximadamente de 90 μm), pipetear los complejos para arriba y hacia abajo para separar totalmente las células del cúmulo. Permita que los ovocitos recuperar en la incubadora mientras se prepara para el siguiente paso.
- Calentar la solución ácida de Tyrode, MEMα y la BSA y los medios de comunicación de Waymouth a 37 ° C (500 μl/ratón). Lugar 300 μL en cada pocillo de las placas de vidrio 9-bien.
- Para remover la zona pelúcida (ZP) transferencia de 5 a 10 ovocitos en la solución de Tyrode. Exponga los ovocitos para solamente 30-45 s a la solución.
Nota: Muy poca exposición a la solución no elimina el ZP totalmente, que evitará que los ovocitos una explosión y los cromosomas se extienda. Exposición excesiva al dañar y matar el ovocito. Viendo el disolver de ZP bajo el microscopio de disección puede ayudar en la optimización de tiempo de exposición.
PRECAUCIÓN: Utilizar solución de Tyrode fresca es crítica, como su función disminuye con la edad. Usar un pozo fresco de solución de Tyrode para cada grupo de ovocitos tratadas para asegurar la digestión uniforme de la ZP. - Inmediatamente después del retiro de ZP, lave los ovocitos por transferencia en caliente medio MEMα/BSA/FBS. Repita este paso de lavado.
Nota: Tenga cuidado al transferir, como ovocitos se pegan juntos y a la pipeta de vidrio o capilar eliminación siguiente de la ZP. Mojar previamente la pipeta de vidrio o tubo capilar en medio de Waymouth minimizará ovocitos pegadas. - Transferencia y permitir que los ovocitos recuperar durante 30 minutos en medio de Waymouth a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 .
- Proceda al paso 5.
5. MI y MII de ovocitos cromatina
- Usando una pluma PAP, dibuje un rectángulo de 11 x 44 mm2 en el portaobjetos de cristal como se muestra en la figura 6A.
- Cubrir el portaobjetos con una fina capa de fijador (paraformaldehído al 1%, 0.2% Triton-X 100 de H2O, pH 9.2) Pipetear 100 μl de fijador en la diapositiva y mecer la corredera hacia adelante y hacia atrás. Puntee la diapositiva para deshacerse de exceso fijador.
- Recoger entre 5 a 10 ovocitos con una aguja de pipeta de boca pequeña con como poco posible y arrastre la aguja en línea a través de la diapositiva de cubierta fijador al depositar los ovocitos desde 1 cm encima de la diapositiva en la solución fijadora. Realizar este paso usando un microscopio de disección para asegurar que los ovocitos han sido depositados y que han irrumpido.
Nota: Los ovocitos deben estallar inmediatamente en la diapositiva. La altura a la que los ovocitos son depositados impacto del grado de difusión de la cromatina. Ver resultados representativos en la figura 6 para obtener más detalles. - Incube los portaobjetos a temperatura ambiente en una cámara humidificada cerrada durante la noche para permitir que la cromatina se adhieran.
- Deje que el portaobjetos se seque completamente y enjuagar diapositivas en una jarra de Coplin conteniendo 50 mL de 0.4% humectante-H2O, pH 8.0.
- Proceda al paso 6.
6. Immunolabelling
- Preparar el tampón de dilución de anticuerpo (Bad) se describe en la tabla 1.
- Preparar dos frascos Coplin conteniendo 50 mL de solución tampón (WB) de lavado (10% Bad diluido en PBS) y una jarra de Coplin con solución detergente WB y 0.05% de 50 mL (por ejemplo, Añadir 250 μl de detergente al 10% 50 ml WB).
- Lave las diapositivas que fueron elaboradas en la sección 1 y 5 del presente Protocolo por 10 min en una jarra de Coplin conteniendo 50 mL de WB.
PRECAUCIÓN: No deje que los portaobjetos seco en cualquier momento durante el immunolabelling. - Lave los portaobjetos por 10 min en el recipiente frasco conteniendo 50 mL WB y solución detergente al 0,05%. Luego, lave los portaobjetos en la jarra de Coplin restante que contiene 50 mL de solución de WB por 10 min.
- Tap off exceso líquido y la tapa porta con 100 μl de anticuerpos primarios seleccionados diluido en ADB. Incubar a 4 ° C durante la noche en una cámara húmeda cerrada.
Nota: La incubación puede acortarse a 2 a 3 horas a 37 ° C. Utilizar volúmenes menores de anticuerpos (p. ej., 50 μL) al cubrir el portaobjetos con un cubreobjetos o parafilm. - Enjuague los portaobjetos en un recipiente frasco con 50 mL de 0.2% solución humidificante-PBS, pH 8.0.
- Repita los pasos de 6.2 a 6.5.
- Tap off exceso líquido y la tapa porta con 100 μl de anticuerpos secundarios seleccionados diluido en ADB. Incube los portaobjetos 1 a 2 horas a 37 ° C en cámara húmeda cerrada.
- Lavar el portaobjetos 2 veces durante 10 minutos en frascos Coplin conteniendo 50 mL de 0.2% solución humectante-PBS, pH 8.0.
- Lavar el portaobjetos 2 veces durante 5 minutos en frascos Coplin conteniendo 50 mL de solución de agente humectante-H2O 0,2%, pH 8.0.
7. montaje de diapositivas
- De la profase la cromatina se separa preparado en el paso 2, agregar 100 μl de medio de montaje que contiene 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1.5µg / mL). Para MI y MII cromatina extensiones preparadas en paso 5, agregue 50 μl de medio de montaje con DAPI (1.5µg / mL). Suavemente Seque lejos exceso de líquido.
- Coloque un cubreobjetos de 22 x 60 mm en la parte superior y selle con esmalte de uñas claro. Guarde en una caja de diapositivas a 4 ° C o -20 ° C hasta evaluación por microscopía de fluorescencia.
Nota: Toque ligeramente el cubreobjetos para eliminar el exceso de medio de montaje antes del sellado con esmalte de uñas.
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Representative Results
Hemos descrito dos técnicas de visualización y evaluación de los cromosomas meiotic en ovocitos. La primera técnica es atendida para evaluar la progresión de la profase en ovarios embrionarias y neonatales. Profase la cromatina propagación preparados son muy valiosos para la visualización de numerosos procesos dinámicos durante la meiosis, incluyendo cromosoma emparejamiento, synapsis y desynapsis, recombinación homóloga y remodelación de cromosoma epigenético. Aquí, hemos demostrado la utilidad de este método de visualización sólido y análisis cuantitativo de la formación de crossover en ovocitos de C57BL/6J embriones (figura 3B y 3 C). Para enriquecer de las células en el subestadio de paquiteno, embriones de ratón fueron recuperados a 18.5 dpc (figura 1). Dos principales características distintivas de la platina de paquiteno de la profase I es la terminación de la sinapsis entre homólogos y la formación de al menos un cruce de MLH1, 3-positivo par homólogo. Sinapsis completa entre homólogos se manifestaron por la presencia de 20 superposición de SYCP3 y SYCP1 se extiende. Para caracterizar la formación de crossover en ovocitos de tipo salvaje immunolabeled profase cromatina difundir preparados utilizando anticuerpos que detectan SYCP3, SYCP1 y MLH1 y teñido con DAPI de ADN. Figura 3B muestra una imagen representativa de un ovocito de fase paquiteno, que se evidencia por la presencia de 27 focos de MLH1 distribuidos a lo largo de 20 estructuras SC completamente montadas. El número medio de crossovers de MLH1 positivo detectado en ovocitos de tipo salvaje fue 24 ± 3 (figura 3 C, N = 15 ovocitos). Figura 3D muestra SMC6 enriquecido en la región pericentromeric del heterocromatina (PCH) y por los brazos del cromosoma y MLH1 focos distribuidos a lo largo de la SC en la fase de paquiteno. Figura 3E representa un ovocito de paquiteno en escena donde la preparación de la extensión de cromosoma fue subóptima y los cromosomas individuales son indistinguibles, impidiendo la evaluación precisa de SYCP3, SMC6 y MLH1. Se separa del cromosoma óptimo puede observarse cuando incubación de ovarios en tampón de extracción hipo basta demasiado o no por mucho tiempo.
La segunda técnica descrita puede utilizarse para evaluar la morfología de la cromatina en ovocitos tras la reanudación meiótica (Figura 6B-D). Localización de la proteína, así como la ploidía, puede fácilmente ser evaluada, exponiendo las causas potenciales de errores de la segregación del cromosoma. Figura 6B representa un ovocito de MI mostrando 20 cromosomas y centrómero y tinción de heterocromatina pericentromeric claros. Figura 6 es una imagen ampliada donde se aprecia la topoisomerasa IIα (TOPOII) a lo largo de los brazos del cromosoma y el PCH. Figura 6 muestra un ovocito MII donde pares hermana chromatids pueden distinguirse por la morfología del cromosoma y el centrómero. Errores comunes al tratar de esta técnica incluyen ovocitos no estallar cuando se libera el portaobjetos recubierto de PFA, como cromosomas separarse demasiado lejos aparte (figura 6E-F). Si el ZP no se quita totalmente, los cromosomas permanecerá asociados al eje, como se muestra en la figura 6E. Si los ovocitos se caen demasiado alto de la diapositiva recubierto de PFA, los cromosomas se pueden propagar muy lejos aparte como se muestra en la figura 6F.
Figura 1: Cronología de la profase meiótica durante el desarrollo embrionario y neonatal mujer. Contornos azules indican poblaciones de profase específicos etapa sub células de germen (leptoteno, anfiteno, paquiteno, diploteno/dictyate etapas y) observadas durante el desarrollo embrionario y neonatal. Aumento de color azul oscuro indica el momento en que la sub-etapa específica de la profase se convierte en más abundante. Esta figura fue adaptada de referencia2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: extracción de ovario de embriones y crías hembra neonatales. (A, B) El primer corte (1) se hace por encima de los miembros anteriores para decapitar el embrión en el cruce de la cabeza y el cuello inmediatamente después de la recuperación desde el cuerno uterino materno. El segundo corte (2) se hace a lo largo de la línea media ventral de la mitad posterior del embrión, seguida por incisiones a lo largo de la mitad anterior debajo de las extremidades anteriores (3). Se hace un corte final para el retiro, las extremidades posteriores y la cola (4). (A) esquema de vista Frontal de los cortes de disección para el aislamiento de los ovarios de hembras cachorros. (B) esquema de vista lateral de cortes de disección para el aislamiento de los ovarios con posiciones relativas de los órganos internos. Regiones que se muestra en la luz rojizas son el hígado y los intestinos, que se eliminan durante la disección. La pared dorsal y órganos asociados aparecen en luz azul. Esta región incluye los ovarios, que se unen a los polos inferiores de los riñones en la parte superior del cuerno uterino. Vista esquemática de la Frontal (C) de la pared dorsal del embrión después de la extracción del hígado y los intestinos. (D) representación esquemática de las diferencias morfológicas entre las gónadas masculinas y femeninas en aproximadamente 15 a 18 dpc. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: cromatina representante profase propagación preparaciones. (A) vidrio diapositiva esquema para cromatina profase propagación preparados. Negro contornos cuadrados representan contornos de pluma líquido bloqueador. (B, C) Imágenes representativas y cuantificación de la formación de crossover en ovocitos de fase paquiteno de tipo salvaje con cromatina de profase de extendieron métodos de preparación que se describe en el paso 1. Se separa de la cromatina (B) se realizaron con ovarios aislados de embriones de ratón fromC57BL/6J a 18.5 dpc. La cromatina se separa fueron immunolabeled con anticuerpos contra la proteína de elemento lateral SC SYCP3 (rojo) y la proteína de elemento central SC SYCP1 (magenta), MLH1 (verde, marcador de evento crossover) y DAPI (azul, ADN). Barra de escala = 10 μm. (C) diagrama de punto de MLH1 focos cuentas de cromatina de fase paquiteno 15 extensión preparados. Barras de error representan la desviación estándar. (D, E) comparación de óptima (D) y óptimo (E) profase propagación preparados, respectivamente. La cromatina se separa immunolabeled con anticuerpos contra SMC6 (rojo), MLH1 (verde) y SYCP3 (azul). Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: esquema del ovario adulto. Este diagrama muestra la anatomía del ovario de ratón adulto, oviducto, útero y ampolla de. Los ovarios del ratón deben ser removidos por incisión cuidadosa de ligamentos que conectan los ovarios y los polos inferiores de los riñones, la pared posterior del abdomen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: imágenes de pipeta de vidrio de boca operada, tubo capilar de vidrio y manual micrómetro-jeringa utilizada para la manipulación de ovocitos. (A) el manipulador de ovocitos de pipeta de vidrio se compone de los siguientes componentes en secuencia: pedazo de boca, tubería del látex (3,2 mm diámetro interno (ID) x diámetro exterior (OD) de 6,4 mm), pipeta de 1 mL, tubería del látex (6,4 mm ID x 11,1 mm OD) y vidrio pipeta Pasteur. El extremo del vidrio, pipeta Pasteur se ha calentado a la llama y al final tiraron para crear un extremo de punta fina (figura 5A1). (B) el manipulador de ovocitos capilar de vidrio se compone de los siguientes componentes en secuencia: boquilla, filtro de 0.45 μm (opcional), tubería del látex (ID de 3,2 mm x 6,4 mm OD), pipeta de 1 mL, tubería del látex (6,4 mm ID x 11,1 mm OD) y el capilar de vidrio de 70 μl. Los tubos capilares de vidrio se calienta a la llama en el centro y tiraron en direcciones opuestas para crear dos capilares con extremos con punta finas (figura 5B1). (C) la jeringa-micrómetro manual está compuesto por los siguientes componentes en secuencia: cabeza de Mitutoyo micrómetro 150-208 (medio tamaño, 0-1 "gama, 0,001" graduación), jeringa de 5 mL, tubería del látex (ID de 3,2 mm x 6,4 mm OD), pipeta de 1 mL, tubería del látex (6.4 mm ID x 11,1 mm OD), pipeta de 1 mL y una punta de carga de gel 83 x 0,5 mm2 . La cabeza de 150-208 micrómetro Mitutoyo se inserta firmemente en la jeringa de 5 mL (5 figura1). Para asegurar que la punta de carga de gel se sujeta firmemente la pipeta de 1 mL conexión punta se corta (figura 52). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Representante metafase I y II ovocito cromatina difundir preparativos. (A) Deslice el esquema de la metafase I y II ovocito cromatina propagación preparados. Ovocitos (círculos) lanzados vía funcionan con boca de vidrio pipeta o tubo capilar en una línea recta (siguiendo la flecha). Contorno del rectángulo negro representa el contorno de lápiz líquido bloqueador. (B, C) Óptima metafase I preparación del extendido de la cromatina. Metafase I los cromosomas fueron teñidos con DAPI (azul, ADN) y immunolabeled por CEN (verde, marcador del cinetocoro/centrómero). Barras de la escala = 10 μm. (B) anticuerpos contra las histonas H4 (di metil K20, metil tri K20) se utilizó para etiquetar la heterocromatina pericentromeric (PCH). (C) anticuerpos contra topoisomerasa IIα (TOPOII) fueron utilizados para etiquetar los ejes PCH y cromosoma. (D) la cromatina II metafase óptima propagación preparación. Cromosomas de metafase II fueron teñidos con DAPI (azul, ADN) y immunolabeled por CEN (verde) y la histona H4 (di-metil K20, tri-metil K20) para etiquetar el PCH. Barra de escala: 10. (E, F) pobre metafase I cromatina difundir preparativos. Los cromosomas fueron teñidos con DAPI (azul, ADN) y el componente de cohesinas meióticas, REC8 y immunolabeled por CEN (verde). Barras de la escala = 10 μm (E) un oocito que no estalló sobre lanzamiento portaobjetos recubierto de PFA. (F) los cromosomas que fueron separados demasiado lejano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Artículo | Cantidad | Concentración final |
| 1 x PBS | 50 mL | 1 x |
| BSA | 1.5g | 3% (w/v) |
| Suero de caballo | 5 mL | 10% (v/v) |
| detergente al 10% (véase Tabla de materiales) en PBS |
250 ΜL | 0,05% (v/v) |
Tabla 1: Receta del anticuerpo dilución buffer (ADB). Almacenar ADB a 4 ° C o congelar existencias a-20 ° C si hacer cantidades más grandes. Bad puede contaminarse, así que asegúrese de buenas técnicas asépticas se utilizan y evaluación la solución para la contaminación antes de cada uso. Pequeñas alícuotas de ADB se pueden preparar también a minimizar la contaminación.
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Discussion
Preparaciones de extensión de cromatina permiten a los investigadores estudiar cronológicamente meiosis mamífera hembra y la localización dinámica de las proteínas implicadas. Las extensiones de cromatina embrionaria y neonatal permiten análisis cercano de los acontecimientos a lo largo de la profase meiótica. Metafase I y metafase II se separa de la cromatina puede utilizarse para distinguir solo hermana chromatids de emparejado hermanas y cromosomas homólogos emparejados, así como evaluar la ploidía. En comparación, el protocolo descrito aquí puede ser ventajoso en comparación con el ovocito todo immunolabelling, que con frecuencia produce altos niveles de señal de fondo que disminuye la resolución de las proteínas de la cromatina-limite. Además, técnicas de propagación de cromatina representan una alternativa atractiva a la proyección de imagen de células vivas, que requiere una gran inversión de tiempo y equipo especializado.
Los ovarios embrionarios y neonatales pueden ser difíciles de localizar y extraer. Recomendamos extraer cuidadosamente todos los otros órganos y material además de los riñones en un plato separado que contiene PBS antes de buscar los ovarios y usar un plato fresco de PBS por cada embrión/pup (figura 2B). Si el embrión/el cachorro es macho, el testículo será distinguible por la formación de túbulos, así como la ubicación de las gónadas (Figura 2D). Como desarrollan embriones masculinos, los testículos descenderán hacia el pene, cada vez más grande y ovalada.
El ovocito cromatina extensión técnica requiere dominio de la colección de ovocitos y manipulación con funcionan con boca de vidrio pipeta o tubo capilar. Recomendamos practicar controlando la pipeta de boca antes de realizar este protocolo. Tirando el tamaño adecuado de vidrio pipeta/capilar para colección y desollamiento ovocitos aumentará las posibilidades de éxito y eficacia reduciendo al mínimo tiempo ovocitos están fuera de la incubadora, así como en la solución de Tyrode. Momento correcto para la eliminación de ZP es extremadamente importante para el éxito de este método. Si los óvulos se incuban en solución de Tyrode para una cantidad insuficiente de tiempo, ZP no completamente desaparecerá. Esto evita que los ovocitos estallar eficientemente en la diapositiva, como puede verse en la figura 6E. Sin embargo, si los óvulos se incuban en solución de Tyrode durante demasiado tiempo, calidad de ovocitos y tinción de inmunofluorescencia aguas abajo serán ser comprometidas seriamente. Recomendamos observar los ovocitos bajo un microscopio para determinar el tiempo exacto de la ZP se disuelve en solución de Tyrode. Añadir sólo 5 a 10 ovocitos a la vez solución de Tyrode minimizará la exposición excesiva. Si los ovocitos son liberados muy alto por encima de la diapositiva recubierto de PFA, los cromosomas pueden transmitirse demasiado lejos aparte (figura 6F). Resultados óptimos se encuentran cuando los ovocitos son liberados 1 cm por encima de la diapositiva. Otros factores que pueden obstaculizar los resultados incluyen la exposición prolongada al CO2 niveles disminuidos en el aire ambiente durante los pasos de la manipulación de ovocitos. Esto causa las fluctuaciones de pH en los medios de comunicación que son perjudiciales para la calidad del ovocito y es evidente por el cambio de color progresiva de los medios de comunicación de color rojo anaranjado a rosado. La capacidad tampón de los medios de comunicación también disminuye con el tiempo; por lo tanto, no recomendamos utilizando los medios de comunicación que ha sido almacenado (4 ° C) por más de 1 semana. Medio de m2, que no requiere de CO2 para ser protegido, es utilizado como una alternativa.
Una limitación de cromatina difundir preparativos es la falta de visualización de la cromatina en el contexto natural de la célula. No se pueden visualizar material celular fuera del núcleo y no se puede evaluar la formación del huso. Por lo tanto, se pueden utilizar otros métodos para evaluar Oogénesis además se separa de la cromatina, como immunolabelling ovocito completa después del tratamiento monastrol, que se derrumba el huso bipolar en un eje mono polar22. Esto permite la hermana chromatids evaluarse dentro del contexto de la célula. Colectivamente, los métodos de extensión la cromatina descritos aquí pueden aplicarse fácilmente para determinar la ploidía de morfología y cromosoma de cromatina durante la Oogénesis en modelos con ratones transgénicos y mutantes nuevos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por NIGMS (R01GM11755) a P.W.J y por una beca de beca de capacitación desde el Instituto Nacional de cáncer (NIH) (CA009110) G.H. y J.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
| 60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
| 35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
| Fine forceps | VWR | 300-050 | |
| Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
| Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
| Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| 50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
| Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
| Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| 16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
| Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
| Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
| Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
| PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
| Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
| Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
| Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
| Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
| Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
| Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
| Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
| 83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
| α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
| Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
| 500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
| Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
| VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear nail polish | Amazon | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
| Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
| Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
| Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |
References
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